Name: propagation of dental and respiratory cells and organs in microgravity
Uploaded: 2021-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity at JoVE.com

Os estudos foram generosamente apoiados por doações do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (UG3-DE028869 e R01-DE027930).

Toda a aprovação institucional necessária foi obtida para garantir que o estudo estivesse em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU.
1. Montagem e esterilização do biorreator
<ol><li>Esterilizar quatro recipientes de alta proporção (HARV) para o biorreator em uma autoclave no ciclo de instrumentos de plástico por 20 minutos a 121 °C, conforme recomendado pelo fabricante.</li>
	<li>Após a esterilização, monte os vasos em um exaustor de cultur...

<ol>
	<li>Horneck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+sciences:+microorganisms+in+the+space+environment.">Life sciences: microorganisms in the space environment.</a> Science. 225 (4658), 226-228 (1984).</li><li>Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+and+the+orientation+of+cell+division.">Gravity and the orientation of cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).</li><li>Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+microgravity+affects+the+biology+of+living+systems.">How microgravity affects the biology of living systems.</a> BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).</li><li>Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+bioreactor+studies+of+cells+and+tissues.">Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues.</a> Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).</li><li>Walther, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+bioreactors+and+their+applications.">Space bioreactors and their applications.</a> Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).</li><li>Morabito, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCCS+bioreactor-based+modelled+microgravity+induces+significant+changes+on+in+vitro+3D+neuroglial+cell+cultures.">RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures.</a> BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).</li><li>Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+for+three-dimensional+modeling+in+rotating-wall+vessels:+An+application+of+simulated+microgravity.">Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).</li><li>Nokhbatolfoghahaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+of+media+flow+through+perfusion-based+bioreactors+for+bone+tissue+engineering.">Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).</li><li>Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+membrane+bioreactor+(MBR)+system+for+simultaneous+nitrogen+and+phosphorus+removal.">An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal.</a> Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).</li><li>Steimberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+3D+Models+Cultured+to+Investigate+Mesenchymal+Stromal+Cells+of+the+Human+Dental+Follicle.">Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle.</a> Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCCS+enhances+EOE+cell+proliferation+and+their+differentiation+into+ameloblasts.">RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells.">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li><li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Levitational+Assembly+for+Living+Material+Fabrication.">Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).</li><li>Sarigil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+biofabrication+of+adipocyte+structures+with+magnetic+levitation.">Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).</li><li>Anil-Inevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+in+situ+Self+Assembled+3D+Cell+Cultures+in+a+Weightlessness+Environment+Generated+using+Magnetic+Levitation.">Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+simulated+microgravity+by+three-dimensional+clinostat+on+bone+tissue+engineering.">The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering.</a> Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).</li><li>Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enamel+biomimetics-fiction+or+future+of+dentistry.">Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry.</a> International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).</li><li>Klein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+a+hard+look+at+the+state+of+enamel+research.">Meeting report: a hard look at the state of enamel research.</a> International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).</li><li>Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daughters+of+the+Enamel+Organ:+Development,+Fate,+and+Function+of+the+Stratum+Intermedium,+Stellate+Reticulum,+and+Outer+Enamel+Epithelium.">Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium.</a> Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).</li><li>Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+amelogenin+gene+expression+by+transformed+epithelial+cells+of+mouse+enamel+organ.">Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ.</a> Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).</li><li>DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+SV40+immortalized+porcine+ameloblast-like+cell+line.">Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line.</a> European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).</li><li>Arakaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+epithelial-stem+cell+interactions+during+dental+cell+differentiation.">Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).</li><li>Au - Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Dental+Epithelial+Stem+Cells+from+the+Adult+Mouse+Incisor.">Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).</li><li>Pandya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+Amelogenin+Processing+and+Changes+in+Matrix+Assembly+during+Enamel+Development.">Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development.</a> Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).</li><li>Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+neural-crest-derived+intermediate+pluripotent+progenitors+into+committed+periodontal+populations+involves+unique+molecular+signature+changes,+cohort+shifts,+and+epigenetic+modifications.">Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications.</a> Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).</li><li>Ahadian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+as+a+biomimicry+tool+for+regulating+muscle+cell+behavior.">Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior.</a> Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).</li><li>Smith, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering.">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+an+epithelial+cell+type+in+culture:+the+epidermal+keratinocyte+and+its+dependence+on+products+of+the+fibroblast.">Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).</li><li>Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+therapy+with+cultured+cells.">The birth of therapy with cultured cells.</a> Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).</li><li>Zeichner-David, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ameloblast+differentiation.">Control of ameloblast differentiation.</a> International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).</li><li>Bei, M., Stowell, S., Maas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msx2+controls+ameloblast+terminal+differentiation.">Msx2 controls ameloblast terminal differentiation.</a> Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).</li><li>Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+periodontal+ligament+regeneration+by+periodontal+progenitor+preseeding+on+natural+tooth+root+surfaces.">Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).</li><li>Del Moral, P. M., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+mouse+embryonic+whole+lung,+isolated+epithelium,+or+mesenchyme+under+chemically+defined+conditions+as+a+system+to+evaluate+the+molecular+mechanism+of+branching+morphogenesis+and+cellular+differentiation.">Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).</li><li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells:+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro.">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).</li><li>Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+coculture+models+for+studying+infectious+diseases:+benefits+and+limitations.">Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).</li><li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+co-culture+of+epithelial+cells+and+smooth+muscle+cells+on+aligned+nanofibrous+scaffolds.">In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds.</a> Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).</li><li>Navran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+low+shear+modeled+microgravity+to+3-D+cell+biology+and+tissue+engineering.">The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering.</a> Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).</li></ol>

As etapas críticas do protocolo para o crescimento de células em microgravidade incluem o biorreator, o andaime, as células usadas para cultura 3D e o revestimento de andaimes como um meio de induzir a diferenciação celular. O tipo de biorreator usado em nossos estudos compreende o biorreator RCCS-4, uma modificação recente do dispositivo de cultura de tecidos cilíndricos rotativos do Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) original desenvolvido pela NASA para cultivar células em microgravidade simulada....

A gravidade afeta todos os aspectos da vida na Terra, incluindo a biologia das células individuais e sua função dentro dos organismos. As células sentem a gravidade através de mecanorreceptores e respondem a mudanças na gravidade reconfigurando arquiteturas citoesqueléticas e alterando a divisão celular 1,2,3. Outros efeitos da microgravidade incluem a pressão hidrostática em vesículas cheias de fluido, sedimentação de organelas e convecção de fluxo e calor impulsionada por flutuabilidade4. Estudos sobre o efeito da perda de gravidade em células e órgãos humanos foram originalmente conduzidos para simular o ambiente sem peso do espaço em astronautas durante missões de voo espacial5. No entanto, nos últimos anos, essas tecnologias de biorreatores 3D originalmente desenvolvidas pela NASA para simular a microgravidade estão se tornando cada vez mais relevantes como novas abordagens para a cultura de populações celulares que, de outra forma, não são passíveis de sistemas de cultura 2D.
Os biorreatores 3D simulam a microgravidade cultivando células em suspensão e, assim, criando um efeito constante de "queda livre". Outras vantagens dos biorreatores rotativos incluem a falta de exposição ao ar encontrada em sistemas de cultura de órgãos, uma redução na tensão de cisalhamento e turbulência, e uma exposição contínua a um suprimento variável de nutrientes. Essas condições dinâmicas proporcionadas por um biorreator do Sistema de Cultura de Células Rotativas (CCRC) favorecem a colocalização espacial e a montagem tridimensional de células individuais em agregados 6,7.
Estudos prévios demonstraram as vantagens de um biorreator rotativo para a regeneração óssea8, cultura de germes dentários9 e para a cultura de células do folículo dentário humano10. Também houve um relato sugerindo que o RCCS aumenta a proliferação e diferenciação de células EOE em ameloblastos11. No entanto, células diferenciadas foram consideradas ameloblastos com base na imunofluorescência da ameloblastina e/ou expressão de amelogenina isoladamente11 sem considerar sua morfologia alongada ou forma celular polarizada.
Além do biorreator de vasos de parede rotativa (RWV) desenvolvido pela NASA, outras tecnologias para gerar agregados 3D a partir de células incluem levitação magnética, a máquina de posicionamento aleatório (RPM) e o clinostato12. Para alcançar a levitação magnética, células marcadas com nanopartículas magnéticas são levitadas por meio de uma força magnética externa, resultando na formação de estruturas 3D livres de andaimes que têm sido utilizadas para a biofabricação de estruturas de adipócitos13,14,15. Outra abordagem para simular a microgravidade é a geração de forças G multidirecionais controlando a rotação simultânea em torno de dois eixos, resultando em um cancelamento do vetor de gravidade cumulativa no centro de um dispositivo chamado clinostato16. Quando as células-tronco da medula óssea foram cultivadas em clinostato, a nova formação óssea foi inibida através da supressão da diferenciação de osteoblastos, ilustrando um dos efeitos desdiferenciadores da microgravidade16.
Sistemas in vitro para facilitar a cultura fiel de ameloblastos proporcionariam um grande passo em direção à engenharia de tecidos de esmalte dentário17. Infelizmente, até hoje, a cultura dos ameloblastos tem sido um empreendimento desafiador18,19. Até agora, cinco linhagens celulares diferentes semelhantes a ameloblastos foram relatadas, incluindo a linhagem celular de linhagem de ameloblastos de camundongo (ALC), a linhagem celular epitelial dentária de ratos (HAT-7), a linhagem celular LS8 20 de camundongos, a linhagem celular PABSo-Esuína 21 ea linhagem celular 22 SF2-24 de ratos. No entanto, a maioria dessas células perdeu sua forma distinta de célula polarizada em cultura 2D.
No presente estudo, recorremos a um Sistema de Biorreator de Cultura de Células Rotativas (CCRC) para facilitar o crescimento de células semelhantes a ameloblastos a partir de epitélios de alça cervical co-cultivados com progenitores mesenquimais e superar os desafios dos sistemas de cultura 2D, incluindo a redução do fluxo de nutrientes e alterações citoesqueléticas devido à gravidade. Além disso, o RCCS forneceu novos caminhos para o estudo das interações célula/andaime relacionadas à engenharia do tecido periodontal e para examinar os efeitos dos mediadores inflamatórios nos tecidos alveolares pulmonares in vitro. Juntos, os resultados desses estudos destacam os benefícios dos sistemas de cultura rotatória baseados em microgravidade para a propagação de epitélios diferenciados e para a avaliação dos efeitos ambientais em células cultivadas in vitro, incluindo interações célula/andaime e a resposta tecidual a condições inflamatórias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BGJb Fitton-Jackson Modification media</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>12591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOST PGA scaffold</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Available from the company through a custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibricol</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5133-20mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galanin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin disc</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene sheets</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>AA1-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite disc</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il-6 protein</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte SFM media (1X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRAP peptide</td>
			<td>Peptide 2.0</td>
			<td>Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT 
			PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL 
			PLEAWPATDKTKREEVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCCS Bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS 4HD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpongeCol</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5135-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX5-61L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with needle 3cc</td>
			<td>McKESSON</td>
			<td>16-SN3C211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of dental and respiratory cells and organs in microgravity

A gravidade é um dos principais determinantes da função celular humana, proliferação, arquitetura citoesquelética e orientação. Os sistemas de biorreatores rotativos (RCCSs) imitam a perda de gravidade à medida que ocorre no espaço e, em vez disso, fornecem um ambiente de microgravidade através da rotação contínua de células ou tecidos cultivados. Esses RCCSs garantem um suprimento ininterrupto de nutrientes, fatores de crescimento e transcrição e oxigênio, e abordam algumas das deficiências das forças gravitacionais em pratos de cultura de células ou órgãos 2D (bidimensionais) imóveis. No presente estudo, utilizamos RCCSs para co-cultivar células de alça cervical e células da polpa dentária para se tornarem ameloblastos, para caracterizar interações progenitor/andaime periodontal e para determinar o efeito da inflamação nos alvéolos pulmonares. Os ambientes do CCRC facilitaram o crescimento de células semelhantes a ameloblastos, promoveram a proliferação de progenitores periodontais em resposta a revestimentos de andaimes e permitiram uma avaliação dos efeitos das alterações inflamatórias nos alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume as condições ambientais, materiais e etapas ao longo do caminho e destaca aspectos críticos e detalhes experimentais. Em conclusão, os CCRCs são ferramentas inovadoras para dominar a cultura e o crescimento 3D (tridimensional) de células in vitro e para permitir o estudo de sistemas celulares ou interações não passíveis de ambientes clássicos de cultura 2D.

A câmara interna do biorreator fornece um ambiente para as células proliferarem e se diferenciarem, se ligarem a um andaime ou se reunirem para formar tecidos como conjuntos. Cada vaso HARV comporta até 10 mL de meio e facilita uma circulação constante de nutrientes para que cada célula tenha uma excelente chance de sobreviver. A figura 1A ilustra a fixação das portas da seringa à placa frontal do recipiente, onde estão fixadas válvulas de balcão único estéreis. Essas válvulas...

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Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity

Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.

Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) ...

Alongado e polarizado o ameloblasto secretor de amelogenina na cultura. Este é também o primeiro protocolo para o crescimento de células de ameloblastos em microgravidade. O crescimento dos ameloblastos na cultura tem sido um dos maiores desafios no campo do esmalte.E para nós, está usando esse modelo de biorreator, é a primeira vez que alcançamos essa marca registrada na pesquisa de esmalte. Este modelo pode ser usado para entender a biologia das células ameloblásticas. Este modelo será demonstrado pela Dra. Mirali Pandya.Comece colocando o tecido coletado de camundongos pós-natais de seis dias sob o microscópio de dissecção e alças cervicais dissecadas. Configure um biorreator conectando as válvulas estéreis às portas da seringa. Adicione ambas as células, a alça cervical e a polpa dentária, juntamente com o andaime revestido ao biorreator e encha o vaso do biorreator com 10 mililitros de meio SFM de queratinócitos suplementados com fatores de crescimento e proteínas da matriz extracelular.Feche e aperte a tampa da porta de enchimento do recipiente do biorreator e, em seguida, abra as válvulas estéreis. Use duas seringas estéreis de três mililitros para uma mudança de mídia. Para tal, encha uma seringa com o meio fresco e deixe a outra seringa vazia.Abra ambas as válvulas da seringa e manobrar suavemente as bolhas em direção à porta da seringa vazia. Uma vez que o meio fresco da seringa cheia é cuidadosamente injetado no recipiente, remova todas as bolhas através da porta da seringa vazia. Feche as portas da seringa com tampas.Fixar cada recipiente à base do rotador. Ligue a alimentação e defina a velocidade para 10,1 rotações por minuto. Ajuste a velocidade para garantir que os andaimes estejam em suspensão e não toquem na parede da embarcação.Para a troca de meios a cada 24 horas, coloque os vasos na posição vertical para garantir que as células se depositem no fundo. Abra as portas da seringa para ligar as seringas estéreis às portas. Aspirar 75% do meio esgotado em nutrição e injetar o meio fresco através da outra porta, como demonstrado anteriormente.As macrografias de andaimes de grafeno e andaimes de colágeno são mostradas aqui. O andaime de grafeno tinha uma matriz paralela de relevos de superfície, enquanto o andaime de colágeno exibia a estrutura porosa. Uma mandíbula esqueletizada foi dissecada e a porção mais distal do incisivo inferior do camundongo foi exposta.A posição precisa da alça cervical ressecada é demarcada no incisivo de camundongo pós-natal de seis dias, enquanto uma região semelhante em uma mandíbula adulta esqueletizada de camundongo é fornecida como referência. As hemimandíbulas eram compostas por três molares mandibulares e um incisivo em constante crescimento, enquanto o nicho de células da alça cervical continha uma população celular variada necessária para a formação do esmalte. A diferenciação bem-sucedida das células da alça cervical em um microambiente adaptado resultou na formação de ameloblastos com uma característica típica de células polarizadas com o núcleo em uma extremidade e longos processos celulares na outra.A cultura de células em meios isoladamente sem fatores de crescimento e revestimento de andaime resultou em células de alça cervical que secretaram proteínas-chave do esmalte, mas não alongaram ou polarizaram. O grupo de andaimes revestidos de galanina demonstrou uma taxa de proliferação significativamente maior em comparação com o grupo controle contendo andaimes não revestidos. Os segmentos de tecido pulmonar colhidos de camundongos E15 foram cultivados com sucesso por 10 dias em um ambiente de microgravidade 3D no biorreator.A adição de interleucina-6 ao meio de cultura resultou em alterações associadas à inflamação na morfologia alveolar semelhantes às observadas in vivo. Na introdução, eu disse o quão difícil foi para a equipe de esmalte criar um modelo de cultura de células de ameloblasto. Agora, abordamos esse desafio usando um procedimento altamente inovador que se concentra em dois aspectos: andaime de colágeno de esponja e também o emprego de matriz para diferenciar as células do ameloblasto.Juntas, essas duas inovações resultaram na polarização e crescimento de células semelhantes a ameloblastos em cultura 3D. Essas células cultivadas em 3D são um modelo maravilhoso para entender a biologia dos ameloblastos. E para entender essa biologia, podemos usar uma variedade de técnicas, incluindo microscopia eletrônica, proteômica e genômica.Os ameloblastos são células fantásticas. Sim, eles têm a capacidade de secretar esmalte dentário prismático. Agora, esse modelo de biorreator nos coloca na posição de entender como os ameloblastos secretam matriz e secretam minerais de apatita para cultivar o esmalte dentário prismático.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Bioengenharia

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Modelo calvarial de aumento ósseo em coelho para avaliação do crescimento ósseo e neovascularização em materiais de substituição óssea

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...