Name: propagation of dental and respiratory cells and organs in microgravity
Uploaded: 2021-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity at JoVE.com

Studierna stöddes generöst av bidrag från National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 och R01-DE027930).

Allt nödvändigt institutionellt godkännande erhölls för att säkerställa att studien överensstämde med TAMU: s riktlinjer för institutionsvård av djur.
1. Bioreaktormontering och sterilisering
<ol><li>Sterilisera fyra HARV-kärl (High Aspect Ratio) för bioreaktorn i en autoklav på plastinstrumentcykeln i 20 minuter vid 121 °C enligt tillverkarens rekommendationer.</li>
	<li>Efter sterilisering, montera kärlen i en cellodlingshuv genom att dra åt skruvarna som är försedda med...

<ol>
	<li>Horneck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+sciences:+microorganisms+in+the+space+environment.">Life sciences: microorganisms in the space environment.</a> Science. 225 (4658), 226-228 (1984).</li><li>Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+and+the+orientation+of+cell+division.">Gravity and the orientation of cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).</li><li>Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+microgravity+affects+the+biology+of+living+systems.">How microgravity affects the biology of living systems.</a> BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).</li><li>Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+bioreactor+studies+of+cells+and+tissues.">Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues.</a> Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).</li><li>Walther, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+bioreactors+and+their+applications.">Space bioreactors and their applications.</a> Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).</li><li>Morabito, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCCS+bioreactor-based+modelled+microgravity+induces+significant+changes+on+in+vitro+3D+neuroglial+cell+cultures.">RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures.</a> BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).</li><li>Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+for+three-dimensional+modeling+in+rotating-wall+vessels:+An+application+of+simulated+microgravity.">Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).</li><li>Nokhbatolfoghahaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+of+media+flow+through+perfusion-based+bioreactors+for+bone+tissue+engineering.">Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).</li><li>Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+membrane+bioreactor+(MBR)+system+for+simultaneous+nitrogen+and+phosphorus+removal.">An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal.</a> Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).</li><li>Steimberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+3D+Models+Cultured+to+Investigate+Mesenchymal+Stromal+Cells+of+the+Human+Dental+Follicle.">Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle.</a> Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCCS+enhances+EOE+cell+proliferation+and+their+differentiation+into+ameloblasts.">RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells.">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li><li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Levitational+Assembly+for+Living+Material+Fabrication.">Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).</li><li>Sarigil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+biofabrication+of+adipocyte+structures+with+magnetic+levitation.">Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).</li><li>Anil-Inevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+in+situ+Self+Assembled+3D+Cell+Cultures+in+a+Weightlessness+Environment+Generated+using+Magnetic+Levitation.">Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+simulated+microgravity+by+three-dimensional+clinostat+on+bone+tissue+engineering.">The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering.</a> Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).</li><li>Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enamel+biomimetics-fiction+or+future+of+dentistry.">Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry.</a> International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).</li><li>Klein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+a+hard+look+at+the+state+of+enamel+research.">Meeting report: a hard look at the state of enamel research.</a> International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).</li><li>Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daughters+of+the+Enamel+Organ:+Development,+Fate,+and+Function+of+the+Stratum+Intermedium,+Stellate+Reticulum,+and+Outer+Enamel+Epithelium.">Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium.</a> Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).</li><li>Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+amelogenin+gene+expression+by+transformed+epithelial+cells+of+mouse+enamel+organ.">Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ.</a> Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).</li><li>DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+SV40+immortalized+porcine+ameloblast-like+cell+line.">Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line.</a> European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).</li><li>Arakaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+epithelial-stem+cell+interactions+during+dental+cell+differentiation.">Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).</li><li>Au - Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Dental+Epithelial+Stem+Cells+from+the+Adult+Mouse+Incisor.">Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).</li><li>Pandya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+Amelogenin+Processing+and+Changes+in+Matrix+Assembly+during+Enamel+Development.">Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development.</a> Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).</li><li>Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+neural-crest-derived+intermediate+pluripotent+progenitors+into+committed+periodontal+populations+involves+unique+molecular+signature+changes,+cohort+shifts,+and+epigenetic+modifications.">Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications.</a> Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).</li><li>Ahadian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+as+a+biomimicry+tool+for+regulating+muscle+cell+behavior.">Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior.</a> Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).</li><li>Smith, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+chemical+events+during+enamel+maturation.">Cellular and chemical events during enamel maturation.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).</li><li>Pei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+mediate+the+effectiveness+of+tissue+engineering+scaffolds.">Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds.</a> The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).</li><li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering.">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+an+epithelial+cell+type+in+culture:+the+epidermal+keratinocyte+and+its+dependence+on+products+of+the+fibroblast.">Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).</li><li>Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+therapy+with+cultured+cells.">The birth of therapy with cultured cells.</a> Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).</li><li>Zeichner-David, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ameloblast+differentiation.">Control of ameloblast differentiation.</a> International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).</li><li>Bei, M., Stowell, S., Maas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msx2+controls+ameloblast+terminal+differentiation.">Msx2 controls ameloblast terminal differentiation.</a> Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).</li><li>Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+periodontal+ligament+regeneration+by+periodontal+progenitor+preseeding+on+natural+tooth+root+surfaces.">Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).</li><li>Del Moral, P. M., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+mouse+embryonic+whole+lung,+isolated+epithelium,+or+mesenchyme+under+chemically+defined+conditions+as+a+system+to+evaluate+the+molecular+mechanism+of+branching+morphogenesis+and+cellular+differentiation.">Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).</li><li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells:+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro.">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).</li><li>Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+coculture+models+for+studying+infectious+diseases:+benefits+and+limitations.">Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).</li><li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+co-culture+of+epithelial+cells+and+smooth+muscle+cells+on+aligned+nanofibrous+scaffolds.">In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds.</a> Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).</li><li>Navran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+low+shear+modeled+microgravity+to+3-D+cell+biology+and+tissue+engineering.">The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering.</a> Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet för tillväxt av celler i mikrogravitation inkluderar bioreaktorn, byggnadsställningen, cellerna som används för 3D-odling och ställningsbeläggningen som ett sätt att inducera celldifferentiering. Den typ av bioreaktor som används i våra studier omfattar RCCS-4-bioreaktorn, en ny modifiering av den ursprungliga roterande cylindriska vävnadsodlingsanordningen (Rotary Cell Culture System) som utvecklats av NASA för att odla celler i simulerad mikrogravitation. Denna RCCS-4-miljö ger ...

Gravitationen påverkar alla aspekter av livet på jorden, inklusive biologin hos enskilda celler och deras funktion inom organismer. Celler känner av gravitation genom mekanoreceptorer och svarar på förändringar i tyngdkraften genom att omkonfigurera cytoskelettarkitekturer och genom att ändra celldelning 1,2,3. Andra effekter av mikrogravitation inkluderar det hydrostatiska trycket i vätskefyllda vesiklar, sedimentering av organeller och flytkraftsdriven konvektion av flöde och värme4. Studier om effekten av tyngdkraftsförlust på mänskliga celler och organ genomfördes ursprungligen för att simulera den viktlösa miljön i rymden på astronauter under rymdflygningsuppdrag5. Under de senaste åren har dock dessa 3D-bioreaktortekniker som ursprungligen utvecklats av NASA för att simulera mikrogravitation blivit alltmer relevanta som nya metoder för odling av cellpopulationer som annars inte är mottagliga för 2D-odlingssystem.
3D-bioreaktorer simulerar mikrogravitation genom att odla celler i suspension och därmed skapa en konstant "fritt fall" -effekt. Andra fördelar med de roterande bioreaktorerna inkluderar bristen på luftexponering som uppstår i organodlingssystem, en minskning av skjuvspänning och turbulens och en kontinuerlig exponering för en förändrad tillförsel av näringsämnen. Dessa dynamiska förhållanden som tillhandahålls av en RVCS-bioreaktor (Rotary Cell Culture System) gynnar rumslig samlokalisering och tredimensionell montering av enskilda celler i aggregat 6,7.
Tidigare studier har visat fördelarna med en roterande bioreaktor för benregenerering8, tandgroddsodling9 och för odling av mänskliga tandfollikelceller10. Det har också förekommit en rapport som tyder på att RCCS förbättrar cellproliferation och differentiering av EOE till ameloblaster11. Differentierade celler betraktades emellertid som ameloblaster baserade på ameloblastinimmunofluorescens och/eller ameloginuttryck ensamt11 utan hänsyn till deras långsträckta morfologi eller polariserade cellform.
Förutom den NASA-utvecklade bioreaktorn för roterande väggkärl (RWV) inkluderar andra tekniker för att generera 3D-aggregat från celler magnetisk levitation, slumpmässig positioneringsmaskin (RPM) och clinostat12. För att uppnå magnetisk levitation leviteras celler märkta med magnetiska nanopartiklar med hjälp av en extern magnetisk kraft, vilket resulterar i bildandet av ställningsfria 3D-strukturer som har använts för biofabricering av adipocytstrukturer13,14,15. Ett annat tillvägagångssätt för att simulera mikrogravitation är genereringen av multidirektionella G-krafter genom att styra samtidig rotation runt två axlar vilket resulterar i en annullering av den kumulativa tyngdkraftsvektorn i mitten av en enhet som kallas clinostat16. När benmärgsstamceller odlades i en kliostat hämmades ny benbildning genom undertryckande av osteoblastdifferentiering, vilket illustrerar en av de dedifferentierande effekterna av mikrogravitation16.
In vitro-system för att underlätta den trogna kulturen av ameloblaster skulle ge ett stort steg framåt mot tandemaljens vävnadsteknik17. Tyvärr har ameloblasternas kultur hittills varit ett utmanande företag18,19. Hittills har fem olika ameloblastliknande cellinjer rapporterats, inklusive musens ameloblast-härstamningscellinje (ALC), råttans dentala epitelcellinje (HAT-7), musens LS8-cellinje20, svin PABSo-E-cellinjen 21 och råttan SF2-24 cellinje22. Majoriteten av dessa celler har dock förlorat sin distinkta polariserade cellform i 2D-odling.
I den aktuella studien har vi vänt oss till ett Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) för att underlätta tillväxten av ameloblastliknande celler från cervikal loopepitel som odlas tillsammans med mesenkymala stamfäder och för att övervinna utmaningarna med 2D-odlingssystem, inklusive minskat flöde av näringsämnen och cytoskelettförändringar på grund av tyngdkraften. Dessutom har RCCS tillhandahållit nya vägar för studier av cell-/ställningsinteraktioner relaterade till parodontal vävnadsteknik och för att undersöka effekterna av inflammatoriska mediatorer på lungalveolära vävnader in vitro. Tillsammans belyser resultaten från dessa studier fördelarna med mikrogravitationsbaserade rotatoriska odlingssystem för förökning av differentierad epitel och för bedömning av miljöeffekter på celler som odlas in vitro, inklusive cell/ ställningsinteraktioner och vävnadssvaret på inflammatoriska tillstånd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BGJb Fitton-Jackson Modification media</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>12591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOST PGA scaffold</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Available from the company through a custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibricol</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5133-20mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galanin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin disc</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene sheets</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>AA1-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite disc</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>CytoForm 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il-6 protein</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte SFM media (1X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRAP peptide</td>
			<td>Peptide 2.0</td>
			<td>Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT 
			PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL 
			PLEAWPATDKTKREEVD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCCS Bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS 4HD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpongeCol</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5135-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX5-61L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with needle 3cc</td>
			<td>McKESSON</td>
			<td>16-SN3C211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientfic</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of dental and respiratory cells and organs in microgravity

Gravitation är en av de viktigaste determinanterna för mänsklig cellfunktion, spridning, cytoskeletal arkitektur och orientering. Roterande bioreaktorsystem (RCCS) efterliknar tyngdkraftsförlusten när den sker i rymden och ger istället en mikrogravitationsmiljö genom kontinuerlig rotation av odlade celler eller vävnader. Dessa RCCS säkerställer en oavbruten tillförsel av näringsämnen, tillväxt- och transkriptionsfaktorer och syre och tar itu med några av bristerna i gravitationskrafter i orörliga 2D (tvådimensionella) cell- eller organodlingsrätter. I den aktuella studien har vi använt RCCS för att samodla cervikala loopceller och tandmassaceller för att bli ameloblaster, för att karakterisera parodontala stam- / ställningsinteraktioner och för att bestämma effekten av inflammation på lungalveoler. RCCS-miljöerna underlättade tillväxten av ameloblastliknande celler, främjade periodontal stamfaderproliferation som svar på ställningsbeläggningar och möjliggjorde en bedömning av effekterna av inflammatoriska förändringar på odlade lungalveoler. Detta manuskript sammanfattar miljöförhållandena, materialen och stegen på vägen och belyser kritiska aspekter och experimentella detaljer. Sammanfattningsvis är RCCS innovativa verktyg för att behärska odling och 3D (tredimensionell) tillväxt av celler in vitro och för att möjliggöra studier av cellulära system eller interaktioner som inte är mottagliga för klassiska 2D-odlingsmiljöer.

Bioreaktorns inre kammare ger en miljö för cellerna att sprida sig och differentiera, fästa vid en byggnadsställning eller samlas för att bilda vävnadsliknande sammansättningar. Varje HARV-kärl rymmer upp till 10 ml medium och underlättar en konstant cirkulation av näringsämnen så att varje cell har en utmärkt chans att överleva. Figur 1A illustrerar fastsättningen av sprutportarna på kärlets främre platta där sterila one-stop-ventiler är fästa. Dessa ventiler fungerar s...

Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity at JoVE.com

Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity

Detta protokoll presenterar en metod för odling och 3D-tillväxt av ameloblastliknande celler i mikrogravitation för att bibehålla sin långsträckta och polariserade form samt emaljspecifikt proteinuttryck. Odlingsförhållanden för odling av parodontala ingenjörskonstruktioner och lungorgan i mikrogravitation beskrivs också.

Förökning av tand- och andningsceller och organ i mikrogravitation

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) ...

Långsträckt och polariserade den amelogeninutsöndrande ameloblasten i kulturen. Detta är också det första protokollet för odling av ameloblastceller i mikrogravitation. Tillväxten av ameloblaster i kulturen har varit en av de största utmaningarna inom emaljområdet.Och för oss är det att använda denna bioreaktormodell, det är första gången som vi har uppnått detta kännetecken inom emaljforskning. Denna modell kan användas för att förstå biologin hos ameloblastceller. Denna modell kommer att demonstreras av Dr.Mirali Pandya.Börja med att placera den uppsamlade vävnaden från sex dagars postnatala möss under dissektionsmikroskopet och dissekerade livmoderhalsslingor. Sätt upp en bioreaktor genom att fästa sterilventilerna på sprutportarna. Tillsätt båda cellerna, livmoderhalsslingan och tandmassan, tillsammans med belagd byggnadsställning till bioreaktorn och fyll bioreaktorkärlet med 10 ml keratinocyt SFM-media kompletterat med tillväxtfaktorer och extracellulära matrisproteiner.Stäng och dra åt påfyllningsportens lock på bioreaktorkärlet och öppna sedan sterilventilerna. Använd två sterila tre milliliterssprutor för en medieförändring. För att göra det, fyll en spruta med det färska mediet och lämna den andra sprutan tom.Öppna båda sprutventilerna och manövrera försiktigt bubblorna mot den tomma sprutporten. När det färska mediet från hela sprutan försiktigt har injicerats i kärlet, ta bort alla bubblor genom den tomma sprutporten. Stäng sprutportarna med lock.Fäst varje kärl på rotatorbasen. Slå på strömmen och ställ in hastigheten till 10,1 varv per minut. Justera hastigheten för att säkerställa att ställningarna är upphängda och inte vidrör kärlväggen.För mediabyte var 24: e timme, placera kärlen upprätt för att säkerställa att cellerna sätter sig längst ner. Öppna sprutportarna för att ansluta sterilsprutorna till portarna. Aspirera 75% av det näringsutarmade mediet och injicera det färska mediet genom den andra hamnen som tidigare visats.Här visas makrograferna för grafenställningar och kollagenställningar. Grafenställningen hade en parallell uppsättning ytpräglingar, medan kollagenställningen uppvisade den porösa strukturen. En skelettiserad musunderkäke dissekerades och den distala delen av den nedre musens framtand exponerades.Den exakta positionen för den resekterade livmoderhalsslingan avgränsas i den sex dagar långa postnatala mussnittet, medan en liknande region i en vuxen skelettiserad musunderkäke tillhandahålls som referens. Hemimandiblerna bestod av tre mandibulära molarer och en ständigt växande framtänd, medan cervikal loopcellnisch innehöll en varierad cellpopulation som var nödvändig för emaljbildning. Den framgångsrika differentieringen av livmoderhalsslingcellerna i en skräddarsydd mikromiljö resulterade i bildandet av ameloblaster med en typisk egenskap hos polariserade celler med kärnan i ena änden och långa cellulära processer i den andra.Odlingen av celler enbart i media utan tillväxtfaktorer och ställningsbeläggning resulterade i cervikala loopceller som utsöndrade viktiga emaljproteiner, men inte förlängdes eller polariserades. Den galaninbelagda ställningsgruppen uppvisade en signifikant högre spridningshastighet jämfört med kontrollgruppen som innehöll obelagda ställningar. Lungvävnadssegmenten som skördats från E15-möss odlades framgångsrikt i 10 dagar i en 3D-mikrogravitationsmiljö i bioreaktorn.Tillsatsen av interleukin-6 till odlingsmediet resulterade i inflammationsassocierade förändringar i alveolär morfologi som liknar dem som ses in vivo. I inledningen berättade jag hur svårt det var för emaljteamet att komma på en ameloblastcellodlingsmodell. Nu har vi tagit itu med denna utmaning genom att använda ett mycket innovativt förfarande som fokuserar på två aspekter: svampkollagenställning och även användningen av matris för att differentiera ameloblastcellerna.Tillsammans resulterade dessa två innovationer i polarisering och tillväxt av ameloblastliknande celler i 3D-odling. Dessa 3D-odlade celler är en underbar modell för att förstå ameloblastbiologi. Och för att förstå denna biologi kan vi använda en mängd olika tekniker inklusive elektronmikroskopi, proteomik och genomik.Ameloblaster är fantastiska celler. Ja, de har förmågan att utsöndra prismatisk tandemalj. Nu sätter denna bioreaktormodell oss i positionen att förstå hur ameloblaster utsöndrar matris och utsöndrar apatitmineraler för att odla prismatisk tandemalj.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Användning av mänskliga perivaskulär stamceller för benuppbyggnad

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Mikropipett Aspiration av substrat-anslutna celler att uppskatta Cell Styvhet

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassning av Electro processen med att ge tre unika miljöer för en Tri-lager<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utveckling av en multicellulär Tredimensionell Organotypiska modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlade under mikrogravitation

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Gränssnitt mikrofluidik med mikroelektrod matriser för att studera Neuronal kommunikation och Axonal signalen förökning

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvarial modell av ben förstärkning i kanin för bedömning av bentillväxt och kärlnybildning i ben ersättning material

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induktion av humantandkött stamceller mot bukspottskörtelstammar

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...