Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP)، وأرقام المنح 2018/23039-3 و2018/12605-8؛ المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية ،أرقام المنح 465656/2014-5 و 309679/2018-4 وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES)، القانون المالي 001.

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ التوجيهية الدولية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث (http://www.iclas.org) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في أبحاث جامعة ساو باولو الاتحادية (CEUA 2019 / 9292090519).
1. الفئران تشريح الدماغ
<ol><li>نقل 10 مل من محلول الملح البارد هانكس المخزنة (HBSS) إلى ط...

ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كبديل ل الصنع الحيوي يسمح بهندسة البنى المكررة التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا الأنسجة الأصلية22، بما في ذلك الدماغ23. يسمح التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالعصبية بنمذجة البيئة الدقيقة الأصلية في المختبر ، كونها أداة ?...

الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا رئيسيا في التوازن الدماغي. بالإضافة إلى دعم الخلايا العصبية دائمة, الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن تحوير امتصاص الناقلات العصبية, الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ, وتنظيم تولد الخلايا العصبية1,2. الخلايا الفلكية أيضا دورا أساسيا في التهاب الجهاز العصبي المركزي, الاستجابة لإصابات الدماغ في عملية تؤدي إلى التفاعل الفلكي أو astrogliosisالتفاعلية 3,4, تشكيل ندبة الدبقية التي تمنع معرض الأنسجة السليمة للعوامل التنكسية5. ينتج عن هذا الحدث تغييرات في التعبير الجيني للخلايا الفلكية، ومورفولوجيا، ووظيفة6،7. لذلك، تساعد الدراسات التي تنطوي على وظائف الخلايا الفلكية في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية.
في المختبر نماذج حاسمة لدراسة الآليات المتعلقة بالإصابات العصبية، وعلى الرغم من العزلة الناجحة والثقافة ثنائية الأبعاد (2D) من الخلايا الفلكية القشرية قد أنشئت8،وهذا النموذج يفشل في توفير بيئة واقعية تحاكي سلوك الخلايا الأصلية وإعادة إنتاج تعقيد الدماغ9 . في حالة 2D، وضعف الدعم الميكانيكية والبيوكيميائية، وانخفاض الخلايا الخلية والتفاعلات مصفوفة الخلية، وتسطيح الخلايا مما يؤدي إلى عدم وجود قطبية القاعدية apical، تؤثر على ديناميات إشارات الخلايا والنتائج التجريبية مما يؤدي إلى تغيير مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني، والتي تعرض للخطر الاستجابة للعلاجات10. لذلك، من المهم تطوير بدائل توفر بيئة عصبية أكثر واقعية، تهدف إلى ترجمة النتائج إلى العيادة.
ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة الخلية يمثل نموذجا أكثر تقدما أن يلخص مع زيادة ميزات الدقة من الأجهزة والأنسجة, بما في ذلك CNS11. وفيما يتعلق بالثقافة الدبقية، تساهم النماذج ثلاثية الأبعاد في الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا الفلكية، والقطبية القاعدية القاعدية للخلايا، وإشارة الخلية12،13. ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كأداة قوية لتصنيع الأنسجة الحية ثلاثية الأبعاد بطريقة خاضعة للرقابة باستخدام الخلايا والمواد الحيوية لإعادة إنشاء بنية وخصائص الأنسجة الأصلية. وقد أدى استخدام هذه التكنولوجيا إلى تحسن كبير في التنبؤ بالنتائج وساهم في الطب التجديدي المطبق على CNS14،15،16.
البروتوكول الموصوف هنا تفاصيل العزلة والثقافة من الخلايا الفلكية القشرية. البروتوكول تفاصيل أيضا طريقة استنساخها للخلايا الفلكية bioprint جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين / الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) / الفيبرينوجين، تكملها لامينين. في هذا العمل، تم استخدام طابعة بيولوجية تعتمد على البثق لطباعة تكوين المادة الحيوية التي تحتوي على الخلايا الفلكية القشرية بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. تم تقليل إجهاد القص الطباعة الحيوية عن طريق التحكم في سرعة الطباعة ، وأظهرت الخلايا الفلكية قابلية عالية للحياة بعد العملية. تم استزراع البنى المطبوعة بيولوجيا لمدة أسبوع واحد ، وتمكنت الخلايا الفلكية من الانتشار والإرفاق والبقاء على قيد الحياة داخل الهيدروجيل ، والحفاظ على مورفولوجيا الفلكية والتعبير عن بروتين حمضي الرجفان الرجفي الرجفي المحدد (GFAP)4.
يتوافق هذا الإجراء مع الطابعات الحيوية القائمة على البثق القائم على المكبس ويمكن استخدامه للطباعة الحيوية للخلايا الفلكية المشتقة من مصادر مختلفة. النموذج المطبوع بيولوجيا ثلاثي الأبعاد المقترح هنا مناسب لمجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة العصبية ، مثل دراسات الآليات المشاركة في وظائف الخلايا الفلكية في الأنسجة السليمة وفهم تطور الأمراض العصبية وتطوير العلاج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

الخلايا الفلكية هي خلايا جلبقية لها دور أساسي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك دعم الخلايا العصبية ووظائفها. هذه الخلايا تستجيب أيضا للإصابات العصبية وتعمل على حماية الأنسجة من الأحداث التنكسية. الدراسات المختبرية من وظائف الخلايا الفلكية مهمة لتوضيح الآليات المشاركة في مثل هذه الأحداث والمساهمة في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع بنية أنسجة تشبه العصبية غنية بالخلايا الفلكية عن طريق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية المحملة بالفينك الحيوي. تم استخدام طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد تعتمد على البثق في هذا العمل ، وتم استخراج الخلايا الفلكية من قشريات الدماغ C57Bl/6 الفئران. تم إعداد bioink عن طريق خلط الخلايا الفلكية القشرية من ما يصل إلى الممر 3 إلى محلول المواد الحيوية المكون من الجيلاتين والجيلاتين الميثاكريلويل (GelMA) والفيبرينوجين ، المكمل باللامينين ، والذي قدم ظروف الطباعة الحيوية المثلى. قللت ظروف الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من إجهاد الخلايا ، مما ساهم في البقاء العالي للخلايا الفلكية أثناء العملية ، حيث كان 74.08٪ ± 1.33٪ من الخلايا قابلة للحياة مباشرة بعد الطباعة الحيوية. بعد أسبوع واحد من الحضانة ، زادت صلاحية الخلايا الفلكية بشكل كبير إلى 83.54٪ ± 3.00٪، مما يشير إلى أن البناء ثلاثي الأبعاد يمثل بيئة دقيقة مناسبة لنمو الخلايا. سمح تكوين المادة الحيوية بتعلق الخلية وحفز السلوك الفلكي ، مع الخلايا التي تعبر عن الخلايا الفلكية المحددة علامة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وامتلاك مورفولوجيا فلكية نموذجية. يوفر هذا البروتوكول القابل للاستنساخ طريقة قيمة لتصنيع الأنسجة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالخلايا العصبية الغنية بالخلايا الفلكية التي تشبه البيئة الدقيقة الأصلية للخلايا ، مفيدة للباحثين الذين يهدفون إلى فهم وظائف الخلايا الفلكية وعلاقتها بالآليات المشاركة في الأمراض العصبية.

يهدف هذا العمل إلى تطوير نسيج يشبه العصبية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإيداع الجيلاتين /GelMA/fibrinogen bioink الأولي المشحون بالخلايا الفلكية طبقة بطبقة. تم استخراج الخلايا الفلكية وعزلها عن قشرة الدماغ من جراء الفئران (الشكل 1) ، إضافة إلى تكوين المواد الحيوية ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

هنا نحن تقرير طريقة الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الخلايا الفلكية القشرية مورين للأنسجة الحيوية مثل العصبية لدراسة وظائف الخلايا الفلكية في الجهاز العصبي المركزي والآليات التي تنطوي على الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية والعلاجات.

الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

تمثل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية تقدما في هندسة الأنسجة العصبية ، مما يسمح با الصنع الحيوي للنماذج المختبرية المفيدة لفهم الآليات المشاركة في الأمراض العصبية. الميزة الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي تصنيع الهياكل المساعدة للخلايا الحيوية التي تحاكي الميزات الكيميائية الحيوية والميكايكية للأنسجة ، مما يوفر فهما أفضل لديناميكيات الخلايا في الصحة والمرض. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التصنيع الحيوي للأنسجة الرخوة الأخرى ، لأنه يستند إلى الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للحبر الحيوي المكون من البوليمرات الطبيعية ومكونات المصفوفة خارج الخلية.في البداية، قطع الأنسجة القشرية المعزولة من الماوس القتل الرحيم إلى قطع صغيرة مع مقص صغير منحني. غسل قطع الأنسجة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من HBSS عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. بعد إزالة HBSS المضافة للمرة الثالثة، إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين واحتضان الأنسجة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.لتفكك الأنسجة الميكانيكية، ماصة بلطف خليط الأنسجة تريبسين صعودا وهبوطا 15 مرات. بعد ذلك، نقل الخليط المفكك إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وإضافة حجم متساو من FBS لتحييد نشاط التريبسين. تصفية التعليق من خلال مرشح مصفاة الخلية 0.4 ميكرومتر لإزالة شظايا غير مفككة.غسل مرشح مع ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية المتوسطة. بيليه أسفل تعليق الخلية المصفاة عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من supernatant، تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة.نقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة T25. تشكل الحجم المتوسط الكلي من 3.5 ملليلتر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للحصول على الفيبرينوجين في التركيز النهائي من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر, نقل 0.9 ملليلتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر فيبرينوجين حل إلى محلول الجيلاتين جيلاتين ميثاكريلويل.للحصول على البادئ الصورة في التركيز النهائي من 0.5٪ الوزن من حيث الحجم، إضافة 0.015 غرام من البادئ الصورة إلى الحل إعداد الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريلويل فيبرينوجين. بعد الدوامة، حافظ على الحل عند 40 درجة مئوية، محميا من الضوء لتجنب تدهور PI. بعد ذلك، قم بتصفية المحلول من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر.نقل 980 ميكرولتر من محلول المواد الحيوية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. للحصول على صفمين في التركيز النهائي من ميكروغرام اثنين لكل ملليلتر، إضافة 20 ميكرولتر من صفمين المخفف إلى أنبوب يحتوي على الحبر الحيوي. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، وتجنب فقاعات والحفاظ على حل الحبر الحيوي في 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للحصول على مختلطة مع الخلايا.جرب الخلايا الفلكية الأولية مع 0.05٪ تريبسين لمدة 5 دقائق وتحييد نشاط التريبسين مع FPS بنسبة واحد إلى واحد. ثم، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد عد الخلايا، نقل 1 مرات 10 إلى 6 خلايا إلى أنبوب مخروطي مختلف والطرد المركزي كما هو موضح.ترك فقط 200 ميكرولتر من supernatant في الأنبوب وتعليق بيليه الخلية عن طريق التنصت بلطف الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. للحصول على تركيز نهائي من 1 مرات 10 إلى 6 خلايا لكل ملليلتر، نقل ملليلتر واحد من الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريويل فيبرينوجين حل للأنبوب الذي يحتوي على الخلايا والتجانس عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. استخدام ماصة 1000 ميكرولتر لنقل ببطء الخلايا الفلكية وضعت في الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريلويل فيبرينوجين حل الحبر الحيوي إلى حقنة بلاستيكية خمسة ملليلتر، وتجنب تشكيل فقاعة.قم بتوصيل إبرة معقمة قياس 22 حادة إلى الحقنة. تعرض الطابعة الحيوية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ثم مسح الطابعة الحيوية بنسبة 70٪، ثم قم بتوصيل المحقنة برأس الطباعة المطبوعة الحيوية وامسح الحبر الحيوي يدويا لإزالة الفقاعات المتبقية. لإجراء الطباعة الحيوية، ضع طبق ثقافة 35 ملليمترا على طاولة الطباعة الحيوية، ضع الإبرة على بعد 0.1 ملليمتر من سطح طبق الثقافة للسماح بحركة الإبرة واضغط على زر الطباعة.بمجرد انتهاء الطباعة الحيوية ، تأكد من أن الحقنة تبتعد عن الطبق وطبق الثقافة الوثيق. ضع طبق الثقافة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للجيلاتين ميثاكريلويل عبر الربط. استخدام ملعقة معقمة لنقل بناء مطبوع بيولوجيا إلى لوحة بئر 24.إضافة 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم thrombin وترك لمدة 30 دقيقة للسماح الفيبرين عبر ربط. بعد إزالة الحل عبر ربط، وغسل بناء مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم استبدال برنامج تلفزيوني مع ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام.استخدام ملعقة لنقل بناء مطبوع بيولوجيا إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر. غسل بناء مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إيداع 100 ميكرولتر من الكاشف الميت الحي فوق البناء وإبقائه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يبقيه محميا من الضوء.بعد إزالة الكاشف الميت الحي ، اغسل البناء مع PBS كما هو موضح. نقل العينة إلى طبق confocal ومراقبة الخلايا داخل بناء تحت المجهر confocal باستخدام 488 و 570 نانومتر الإثارة للحصول على الصورة. بعد الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، تم تقدير سلامة السقالة المطبوعة بيولوجيا ولوحظ تشكيل بنية محددة جيدا مع الخلايا المحاصرة داخل المادة الحيوية.بعد الطباعة الحيوية وعمليات الربط المتبادل ، قدمت معظم الخلايا مورفولوجيا مستديرة عندما تم احتضان البناء مع وسيطة الخلايا الفلكية. حافظت السقالات المطبوعة بيولوجيا على سلامتها بعد سبعة أيام من الحضانة ، وعلى الرغم من ملاحظة بعض الخلايا المستديرة ، انتشرت العديد من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء ، مما يقدم مورفولوجيا فلكية وترابطا. تم تقييم صلاحية الخلية مباشرة بعد الطباعة الحيوية وأظهرت النتائج أنه بالسرعة المنخفضة ، تمثل الخلايا القابلة للحياة ما يصل إلى 74٪ من إجمالي الخلايا ، كونها أعلى بكثير من الخلايا المطبوعة بيولوجيا بسرعة أعلى.تم تطبيع صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا إلى الخلايا الفلكية المستزرعة 2D وأشارت النتائج إلى أنه في اليوم السابع ، زادت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا بشكل كبير من قابليتها للحياة. مباشرة بعد الطباعة الحيوية، أظهرت الخلايا الفلكية مورفولوجيا مستديرة وقاية حية ميتة. بعد أسبوع واحد ، انتشرت الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء وقدمت مورفولوجيا متميزة من الخلايا ، مطابقة للثقافة 2D.تميزت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد بفلورية المناعة. بعد سبعة أيام من الحضانة في البناء المطبوع بيولوجيا ، لوحظت خلايا أستراتية كثيفة للغاية مع مورفولوجيا تشبه النجوم. عبرت خلايا الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا عن البروتين الحمضي الرجفانى الرجفانى الغليظى المحدد الذى يشير إلى الاحتفاظ بالنمط الظاهري الفلكي بعد سبعة أيام من الطباعة الحيوية ، وتشير هذه النتائج إلى أن تكوين الحبر الحي وفر بيئة دقيقة قابلة للكومبيا لتعزيز التصاق الخلايا الفلكية وانتشارها ونموها .تقييم جينات محددة وتعبير علامات الخلية من قبل الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا من شأنه أن يوفر دليلا على وظيفة تشبه الأنسجة العصبية، مثل التفاعل الفلكي بعد محفزات محددة. يمهد هذا البروتوكول الطريق لتحضير هياكل أكثر تعقيدا تشبه الأعصاب تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا في الجزيئات الحيوية ، مما يسمح بمحاكاة منافذ عصبية محددة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

هندسة الأنسجة من الأمعاء في نموذج الفئران

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

هندسة الأنسجة ل3D الإنسان<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ورم اختبار

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

عزل الفئران الدهنية المشتقة من الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة شظايا كما وحدات الأوعية الدموية للهندسة الأنسجة

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

بروتوكولات 3D بيوريتينغ من الجيلاتين ميثاكريلويل هيدروجيل القائم علي الحيوية

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...