Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
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这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的支持，资助号为2018/23039-3和2018/12605-8;国家科学技术发展委员会（CNPq），批准号465656/2014-5和309679/2018-4;和高等教育人员改进协调（CAPES），财务代码001。

所有涉及动物的程序都遵循国际动物在研究中使用的指导方针（http://www.iclas.org），并得到圣保罗联邦大学研究伦理委员会（CEUA 2019 / 9292090519）的批准。
1. 小鼠脑部解剖
<ol><li>将 10 mL 冷汉克斯缓冲盐溶液 （HBSS） 转移到 100 mm 培养皿中，将 1 mL 转移到 1.5 mL 微管中。每只动物准备一个微管。 注意：培养皿和微管都需要保持在冰上。</li>
	<li>使用DMEM F12 + 10%胎牛血清（FBS）?...

3D生物打印技术已经成为一种生物制造替代方案，可以设计出在结构和生理上类似于天然组织22的精制结构，包括大脑23。神经样组织的生物制造允许在体外进行天然微环境建模，是了解与影响CNS11的许多疾病的发展和治疗相关的细胞和分子机制的重要工具。由于神经胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮质星形胶质细胞已被用于许多研?...

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在大脑稳态中起着关键作用。除了持久的神经元支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质摄取，维持血脑屏障完整性，并调节神经元突触发生1，2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，在导致星体反应性或反应性星形胶质细胞增多症3，4的过程中对大脑损伤作出反应，形成神经胶质疤痕，阻止健康组织暴露于退行性因子5。该事件导致星形胶质细胞的基因表达，形态和功能的变化6，7。因此，涉及星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的疗法。
体外 模型对于研究与神经损伤相关的机制至关重要，尽管已经建立了成功的皮质星形胶质细胞的分离和二维（2D）培养8，但该模型未能提供模拟天然细胞行为的现实环境并重现大脑的复杂性9.在2D条件下，较差的机械和生化支持，低细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用以及细胞扁平化导致基底 - 顶端极性缺失，影响细胞信号传导动力学和实验结果，导致细胞形态和基因表达改变，从而损害对治疗的反应10。因此，开发提供更逼真的神经环境的替代方案至关重要，旨在将结果转化为临床。
三维（3D）细胞培养代表了一种更先进的模型，该模型概括了器官和组织（包括CNS11）的保真度增加的特征。关于神经胶质培养，3D模型有助于维持星形胶质细胞形态，细胞基底 - 顶端极性和细胞信号传导12，13。3D生物打印技术成为一种强大的工具，通过使用细胞和生物材料重建天然组织的结构和性质，以受控的方式生物制造3D活组织。该技术的使用导致了结果预测的实质性改进，并有助于再生医学应用于CNS14，15，16。
这里描述的方案详细介绍了皮质星形胶质细胞的分离和培养。该协议还详细介绍了一种可重复的方法，用于生物打印嵌入明胶/明胶甲基丙烯酰（GelMA）/纤维蛋白原中的星形胶质细胞，并补充层粘连蛋白。在这项工作中，使用基于挤出的生物打印机以1×106个细胞/ mL的密度打印含有皮质星形胶质细胞的生物材料组合物。通过控制打印速度将生物打印剪切应力降至最低，并且星形胶质细胞在该过程后显示出高活力。生物打印构建体培养1周，星形胶质细胞能够在水凝胶内扩散，附着和存活，维持星形细胞形态并表达特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4 。
该程序与活塞驱动的基于挤出的生物打印机兼容，可用于生物打印来自不同来源的星形胶质细胞。这里提出的3D生物打印模型适用于广泛的神经工程应用，例如研究健康组织中星形胶质细胞功能所涉及的机制以及了解神经病理学的进展和治疗发展。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

星形胶质细胞是神经胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中起着至关重要的作用，包括神经元的支持和功能。这些细胞也对神经损伤有反应，并保护组织免受退行性事件的影响。星形胶质细胞功能的 体外 研究对于阐明此类事件所涉及的机制并有助于开发治疗神经系统疾病的疗法非常重要。该协议描述了一种通过3D生物打印含有星形胶质细胞的生物墨水生物制造富含星形胶质细胞的神经样组织结构的方法。在这项工作中使用了基于挤出的3D生物打印机，并从C57Bl / 6小鼠幼崽的脑皮质层中提取星形胶质细胞。通过将皮质星形胶质细胞从第3代混合到由明胶，明胶 - 甲基丙烯酰（GelMA）和纤维蛋白原组成的生物材料溶液中，并补充层粘连蛋白来制备生物墨水，其提供了最佳的生物打印条件。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，有助于星形胶质细胞在此过程中的高活力，其中74.08%±1.33%的细胞在生物打印后立即存活。孵育1周后，星形胶质细胞的活力显着增加到83.54%±3.00%，表明3D构建体代表了适合细胞生长的微环境。生物材料组成允许细胞附着并刺激星形细胞行为，细胞表达特定的星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）并具有典型的星形细胞形态。这种可重复的方案提供了一种有价值的方法来生物制造富含星形胶质细胞的3D神经样组织，类似于细胞的天然微环境，对于旨在了解星形胶质细胞的功能及其与神经系统疾病中涉及的机制的关系的研究人员很有用。

这项工作旨在使用3D生物打印技术开发一种神经样组织，以逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/ GelMA / 纤维蛋白原生物墨水。从小鼠幼崽的大脑皮层中提取和分离星形胶质细胞（图1），添加到生物材料组合物中，允许生物制造活的3D构建体。
计算机辅助设计（CAD）是使用G代码（补充文件）作为方形（0.6 x 0.6毫米）的互连框架开发的，孔?...

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3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

在这里，我们报道了一种3D生物打印小鼠皮质星形胶质细胞的方法，用于生物制造神经样组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能以及涉及神经胶质细胞在神经系统疾病和治疗中的机制。

用于工程神经样组织的小鼠皮质星形胶质细胞的3D生物打印

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

星形胶质细胞的3D生物打印代表了神经组织工程的进步，允许生物制造体外模型，这些模型有助于理解神经系统疾病所涉及的机制。3D生物打印的主要优点是生物制造模拟组织生化和机械特征的细胞辅助结构，从而更好地了解健康和疾病中的细胞动力学。该协议可应用于其他软组织的生物制造，因为它基于由天然聚合物和细胞外基质组分组成的生物墨水的3D生物打印。首先，用弯曲的微型剪刀将从安乐死小鼠中分离出来的皮质组织切成小块。通过上下移液，用一毫升HBSS清洗组织块三次。第三次取出添加的HBSS后，加入一毫升0.05%胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育组织五分钟。对于机械组织解离，轻轻地上下移液组织胰蛋白酶混合物15次。接下来，将解离的混合物转移到15毫升锥形管中，并加入等体积的FBS以中和胰蛋白酶活性。通过0.4微米细胞过滤器过滤悬浮液以除去未解离的片段。用一毫升星形胶质细胞培养基洗涤过滤器。通过离心将沉淀下来过滤后的细胞悬浮液。弃去上清液后，将细胞沉淀悬浮在一毫升星形胶质细胞培养基中。将细胞悬浮液转移到T25培养瓶中。构成3.5毫升的总培养基体积，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育细胞。为了获得终浓度为每毫升3毫克的纤维蛋白原，将0.9毫升每毫升10毫克的纤维蛋白原溶液转移到明胶 - 明胶甲基丙烯酰溶液中。为了获得终浓度为0.5%重量体积的光引发剂，向制备的明胶-明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原溶液中加入0.015克光引发剂。涡旋后，将溶液保持在40摄氏度，避光，避免PI降解。接下来，通过0.2微米过滤器过滤溶液到无菌的15毫升锥形管中。将980微升的生物材料溶液转移到15毫升的锥形管中。为了获得最终浓度为每毫升2微克的层粘连蛋白，将20微升稀释的层粘连蛋白加入含有生物墨水的管中。通过上下移液轻轻混合，避免气泡，并将生物墨水溶液保持在37摄氏度，直到准备好与细胞混合。用0.05%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞进行胰蛋白酶消化5分钟，并用FPS以一比一的比例中和胰蛋白酶活性。然后，将细胞转移到15毫升的锥形管中，并以200倍G离心5分钟。计数细胞后，将1次10到6个细胞转移到不同的锥形管中并离心，如图所示。在管中仅留下200微升的上清液，并通过轻轻敲击锥形管的底部来悬浮细胞沉淀。为了获得每毫升10至6个细胞的1倍的最终浓度，将一毫升明胶 - 明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原溶液转移到含有细胞的管中，并通过轻轻地上下移液来均质化。使用1000微升移液器将明胶 - 明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原生物墨水溶液中铺设的星形胶质细胞缓慢转移到五毫升塑料注射器中，避免形成气泡。将无菌的22号钝针连接到注射器。将生物打印机暴露在紫外线下15分钟，然后用70%乙醇擦拭生物打印机，然后将注射器连接到生物打印机打印头并手动冲洗生物墨水以除去剩余的气泡。要进行生物打印，请将培养皿放置在生物打印机台上的35毫米培养皿中，将针头放置在距离培养皿表面0.1毫米的位置以允许针头移动，然后按下打印"按钮。生物打印结束后，确保注射器远离培养皿并关闭培养皿。将培养皿置于紫外光下，使明胶甲基丙烯酰交联。使用无菌刮刀将生物打印的构建体转移到24孔板中。加入500微升凝血酶氯化钙溶液，静置30分钟，让纤维蛋白交联。除去交联溶液后，用两毫升PBS洗涤结构，然后用一毫升星形胶质细胞培养基代替PBS。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，每三天更换一次培养基。使用刮刀将生物打印的构建体转移到35毫米培养皿中。用一毫升PBS清洗结构。将100微升活死试剂沉积在结构物上，并将其保持在37摄氏度下30分钟，使其免受光照。取出活死试剂后，如图所示用PBS清洗构建体。将样品转移到共聚焦培养皿中，并在共聚焦显微镜下使用488和570纳米激发观察构建体内的细胞以进行图像采集。在3D生物打印之后，估计了生物打印支架的完整性，并观察到细胞被捕获在生物材料内的明确结构的形成。在生物打印和交联过程之后，当构建体与星形胶质细胞培养基孵育时，大多数细胞呈现圆形形态。生物打印的支架在孵育七天后保持完整性，尽管观察到一些圆形细胞，但许多星形胶质细胞在整个结构中扩散，呈现星形细胞形态和相互连接。在生物打印后立即评估了细胞活力，结果表明，在较低的速度下，活细胞占总细胞的74%，明显高于以较高速度生物打印的细胞。生物打印星形胶质细胞的活力归一化为2D培养的星形胶质细胞，结果表明，在第七天，生物打印的星形胶质细胞的活力显着增加。生物打印后，星形胶质细胞立即显示出圆形形态和活死测定。一周后，星形胶质细胞扩散到整个构建体中，并呈现出与2D培养物相同的细胞的独特形态。3D生物打印星形胶质细胞通过免疫荧光进行表征.在生物打印结构中孵育七天后，观察到具有星状形态的高致密星形胶质细胞。生物打印的星形胶质细胞表达的特异性星形胶质细胞标志物神经胶质原纤维酸性蛋白表明经过生物打印7天后星形胶质细胞表型的保留，这些结果表明，生物墨水组合物提供了一种生物相容的微环境，以促进星形胶质细胞的粘附、扩散和生长。生物打印的星形胶质细胞对特定基因和细胞标记表达的评估将为神经组织样功能提供证据，例如特定刺激后的星形胶质细胞反应性。该协议为生物分子中由不同类型的细胞组成的更复杂的神经样结构的生物制造铺平了道路，从而允许模仿特定的神经源性生态位。

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