Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
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Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation (FAPESP), Fördernummern 2018/23039-3 und 2018/12605-8, unterstützt; Nationaler Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq), Fördernummern 465656/2014-5 und 309679/2018-4; und Koordinierung zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES), Finanzcode 001.

Alle Verfahren mit Tieren folgten den internationalen Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (http://www.iclas.org) und wurden vom Komitee für Ethik in der Forschung der Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519) genehmigt.
1. Gehirndissektion von Mäusen
<ol><li>10 ml kalte Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) in eine 100 mm Kulturschale und 1 ml in eine 1,5 ml Mikroröhre geben. Bereiten Sie eine Mikroröhrchen pro Tier vor. HINWEIS: Sowohl die Kult...

Die 3D-Bioprinting-Technologie hat sich als Biofabrikationsalternative herausgestellt, die die Entwicklung verfeinerter Konstrukte ermöglicht, die strukturell und physiologisch nativen Geweben ähneln22, einschließlich des Gehirns23. Die Biofabrikation von neuralähnlichen Geweben ermöglicht eine in vitro native Mikroumgebungsmodellierung und ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die mit der Entwicklung und Beha...

Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und spielen eine Schlüsselrolle bei der Homöostase des Gehirns. Neben der dauerhaften neuronalen Unterstützung sind Astrozyten für die Modulation der Aufnahme von Neurotransmittern, die Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und die Regulierung der neuronalen Synaptogenese verantwortlich1,2. Astrozyten spielen auch eine wesentliche Rolle bei ZNS-Entzündungen und reagieren auf Verletzungen des Gehirns in einem Prozess, der zu einer Astrocitary-Reaktivität oder reaktiven Astrogliose führt3,4 und bildet eine Glianarbe, die eine gesunde Gewebeexposition gegenüber degenerativen Agenzien verhindert5. Dieses Ereignis führt zu Veränderungen in der Genexpression, Morphologie und Funktion von Astrozyten6,7. Daher sind Studien zur Funktionalität von Astrozyten hilfreich für die Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen.
In-vitro-Modelle sind entscheidend für die Untersuchung von Mechanismen im Zusammenhang mit neurologischen Verletzungen, und obwohl eine erfolgreiche Isolierung und zweidimensionale (2D) Kultur von kortikalen Astrozyten etabliert wurde8, bietet dieses Modell keine realistische Umgebung, die das native Zellverhalten nachahmt und die Komplexität des Gehirns reproduziert9 . Im 2D-Zustand beeinflussen die schlechte mechanische und biochemische Unterstützung, die geringen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und die Zellabflachung, die zum Fehlen einer basal-apikalen Polarität führt, die Zellsignaldynamik und die experimentellen Ergebnisse, was zu einer veränderten Zellmorphologie und Genexpression führt, was die Reaktion auf Behandlungen beeinträchtigt10. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Alternativen zu entwickeln, die eine realistischere neuronale Umgebung bieten, um die Ergebnisse in die Klinik zu übertragen.
Die dreidimensionale (3D) Zellkultur stellt ein fortschrittlicheres Modell dar, das mit erhöhter Genauigkeit merkmale von Organen und Geweben, einschließlich des ZNS11,rekapituliert. In Bezug auf die Gliakultur tragen 3D-Modelle zur Aufrechterhaltung der Morphologie der Astrozyten, der basal-apikalen Polarität der Zellen und der Zellsignalisierung bei12,13. Die 3D-Bioprinting-Technologie entwickelte sich zu einem leistungsstarken Werkzeug, um lebendes 3D-Gewebe kontrolliert zu biofabrizieren, indem Zellen und Biomaterialien verwendet werden, um die Struktur und Eigenschaften von nativem Gewebe nachzubilden. Der Einsatz dieser Technologie hat zu einer erheblichen Verbesserung der Ergebnisvorhersage geführt und zur regenerativen Medizin beigetragen, die auf die ZNS14,15,16angewendet wird .
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur kortikaler Astrozyten. Das Protokoll beschreibt auch eine reproduzierbare Methode zum Bioprint von Astrozyten, die in Gelatine / Gelatine Methacryloyl (GelMA) / Fibrinogen eingebettet sind, ergänzt mit Laminin. In dieser Arbeit wurde ein extrusionsbasierter Bioprinter verwendet, um die Biomaterialzusammensetzung zu drucken, die kortikale Astrozyten mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen / ml enthält. Die Bioprinting-Scherspannung wurde durch die Kontrolle der Druckgeschwindigkeit minimiert, und Astrozyten zeigten nach dem Prozess eine hohe Lebensfähigkeit. Biogedruckte Konstrukte wurden 1 Woche lang kultiviert, und Astrozyten konnten sich innerhalb des Hydrogels ausbreiten, anheften und überleben, wobei die astrozytäre Morphologie beibehalten und ein spezifisches Marker-Glialfibrillär-saures Protein (GFAP) exprimiert wurde4.
Dieses Verfahren ist kompatibel mit kolbengetriebenen extrusionsbasierten Bioprintern und kann zum Biodrucken von Astrozyten aus verschiedenen Quellen verwendet werden. Das hier vorgeschlagene 3D-Bioprinted-Modell eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Neurotechnik, wie z.B. Studien der Mechanismen, die an der Funktionalität von Astrozyten in gesundem Gewebe beteiligt sind, und das Verständnis des Fortschreitens neurologischer Pathologien und der Behandlungsentwicklung.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

Astrozyten sind Gliazellen mit einer wesentlichen Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), einschließlich neuronaler Unterstützung und Funktionalität. Diese Zellen reagieren auch auf neuronale Verletzungen und schützen das Gewebe vor degenerativen Ereignissen. In-vitro-Studien zur Funktionalität von Astrozyten sind wichtig, um die Mechanismen solcher Ereignisse aufzuklären und zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen beizutragen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Biofabrikation einer neuralen Gewebestruktur, die reich an Astrozyten ist, durch 3D-Bioprinting von Astrozyten-beladener Bioink. Ein extrusionsbasierter 3D-Bioprinter wurde in dieser Arbeit verwendet, und Astrozyten wurden aus den Gehirnkortexen von C57Bl/6 Mäusenwelpen extrahiert. Die Bioink wurde hergestellt, indem kortikale Astrozyten von bis Zurgang 3 zu einer Biomateriallösung aus Gelatine, Gelatine-Methacryloyl (GelMA) und Fibrinogen gemischt wurden, ergänzt mit Laminin, das optimale Bioprinting-Bedingungen aufwies. Die 3D-Bioprinting-Bedingungen minimierten den Zellstress und trugen zur hohen Lebensfähigkeit der Astrozyten während des Prozesses bei, bei dem 74,08% ± 1,33% der Zellen direkt nach dem Bioprinting lebensfähig waren. Nach 1 Woche Inkubation stieg die Lebensfähigkeit der Astrozyten signifikant auf 83,54% ± 3,00%, was darauf hindeutet, dass das 3D-Konstrukt eine geeignete Mikroumgebung für das Zellwachstum darstellt. Die Zusammensetzung des Biomaterials ermöglichte die Zellanheftung und stimulierte das astrozytäre Verhalten, wobei zellen den spezifischen Astrozytenmarker glial fibrillary acidic protein (GFAP) exprimierten und eine typische astrozytäre Morphologie besaßen. Dieses reproduzierbare Protokoll bietet eine wertvolle Methode zur Bioschmierung von 3D-neuralem Gewebe, das reich an Astrozyten ist und der nativen Mikroumgebung der Zellen ähnelt, nützlich für Forscher, die die Funktionalität von Astrozyten und ihre Beziehung zu den Mechanismen neurologischer Erkrankungen verstehen wollen.

Diese Arbeit zielte darauf ab, ein neuralähnliches Gewebe zu entwickeln, das die 3D-Bioprinting-Technologie nutzt, um Schicht für Schicht primäre Astrozyten-beladene Gelatine / GelMA / Fibrinogen-Biotinte abzuscheiden. Astrozyten wurden extrahiert und aus der Großhirnrinde von Mäusewelpen isoliert (Abbildung 1), zu einer Biomaterialzusammensetzung hinzugefügt, die die Biofabrikation eines lebenden 3D-Konstrukts ermöglicht.
Das Computer-Aided-Design (CAD) wu...

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3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Der 3D-Bioprinting von Astrozyten stellt einen Fortschritt im Neuro Tissue Engineering dar und ermöglicht die Biofabrikation von In-vitro-Modellen, die nützlich sind, um die Mechanismen neurologischer Erkrankungen zu verstehen. Der Hauptvorteil des 3D-Bioprintings besteht darin, Zelladjunktstrukturen zu biofabrizieren, die die biochemischen und mechanischen Eigenschaften des Gewebes nachahmen und ein besseres Verständnis der Zelldynamik in Gesundheit und Krankheit ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf die Biofabrikation anderer Weichteile angewendet werden, da es auf dem 3D-Bioprinting einer Biotinte basiert, die aus natürlichen Polymeren und extrazellulären Matrixkomponenten besteht.Schneiden Sie zunächst das von der eingeschläferten Maus isolierte kortikale Gewebe mit einer gekrümmten Mikroschere in kleine Stücke. Waschen Sie die Gewebestücke dreimal mit einem Milliliter HBSS, indem Sie nach oben und unten pipettieren. Nachdem Sie HBSS zum dritten Mal entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin hinzu und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Für die mechanische Gewebedissoziation die Gewebe-Trypsin-Mischung 15 Mal vorsichtig nach oben und unten pipettieren. Als nächstes übertragen Sie die dissoziierte Mischung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen FBS hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Filtern Sie die Suspension durch einen 0,4 Mikrometer großen Zellsiebfilter, um nicht dissoziierte Fragmente zu entfernen.Waschen Sie den Filter mit einem Milliliter Astrozytenmedium. Pellet durch Zentrifugation die gefilterte Zellsuspension herunter. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Astrozytenkulturmedium.Die Zellsuspension wird in einen T25-Kulturkolben überführt. Bilden Sie ein mittleres Gesamtvolumen von 3,5 Millilitern und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Zur Gewinnung des Fibrinogens in der Endkonzentration von drei Milligramm pro Milliliter werden 0,9 Milliliter à 10 Milligramm pro Milliliter Fibrinogenlösung in die Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Lösung überführt.Um den Photoinitiator in der Endkonzentration von 0,5 Gew.-% Vol.-%, zu erhalten, werden 0,015 Gramm Photoinitiator zu der hergestellten Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogen-Lösung gegeben. Halten Sie die Lösung nach dem Wirbeln bei 40 Grad Celsius, geschützt vor Licht, um pi-Degradation zu vermeiden. Als nächstes filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen.980 Mikroliter der Biomateriallösung werden in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Um das Laminin in der Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, werden 20 Mikroliter verdünntes Laminin in das Röhrchen gegeben, das Biotinte enthält. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, Blasen vermeiden und die Bio-Tintenlösung bei 37 Grad Celsius halten, bis sie bereit ist, mit den Zellen gemischt zu werden.Trypsinisieren Sie die primären Astrozyten mit 0,05% Trypsin für 5 Minuten und neutralisieren Sie die Trypsinaktivität mit FPS in einem Verhältnis von eins zu eins. Dann die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen und fünf Minuten lang bei 200 mal G zentrifugieren. Nach dem Zählen der Zellen 1 mal 10 zu den 6 Zellen in ein anderes konisches Rohr und eine andere Zentrifuge übertragen, wie gezeigt.Lassen Sie nur 200 Mikroliter des Überstands im Röhrchen und suspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Rohres klopfen. Um eine Endkonzentration von 1 mal 10 auf die 6 Zellen pro Milliliter zu erhalten, einen Milliliter Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogenlösung in das Röhrchen geben, das die Zellen enthält, und homogenisieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die in Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogen-Biotintenlösung gelegten Astrozyten langsam auf eine Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze zu übertragen und die Bildung von Blasen zu vermeiden.Schließen Sie eine sterile stumpfe 22-Gauge-Nadel an die Spritze an. Den Bioprinter 15 Minuten lang UV-Licht aussetzen und dann den Bioprinter mit 70% Ethanol abwischen, dann die Spritze an den Bioprinter-Druckkopf anschließen und die Biotinte manuell spülen, um die verbleibenden Blasen zu entfernen. Um Bioprinting durchzuführen, legen Sie die 35-Millimeter-Kulturschale auf den Bioprinter-Tisch, positionieren Sie die Nadel 0,1 Millimeter von der Oberfläche der Kulturschale entfernt, um eine Bewegung der Nadel zu ermöglichen, und drücken Sie die Taste "Print".Sobald der Bioprinting abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass sich die Spritze von der Schüssel entfernt und die Kulturschale verschließt. Stellen Sie die Kulturschale unter UV-Licht, um eine Gelatine-Methacryloyl-Vernetzung zu erhalten. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um das biogedruckte Konstrukt auf eine 24-Well-Platte zu übertragen.Fügen Sie 500 Mikroliter Thrombin-Calciumchlorid-Lösung hinzu und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken, um eine Fibrinvernetzung zu ermöglichen. Nachdem Sie die Vernetzungslösung entfernt haben, waschen Sie das Konstrukt mit zwei Millilitern PBS und ersetzen Sie dann das PBS durch einen Milliliter Astrozytenkulturmedium. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren und das Medium alle drei Tage wechseln.Verwenden Sie einen Spatel, um das biogedruckte Konstrukt in eine 35-Millimeter-Kulturschale zu übertragen. Waschen Sie das Konstrukt mit einem Milliliter PBS. Geben Sie 100 Mikroliter des lebenden toten Reagenzes über das Konstrukt und halten Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um es vor Licht zu schützen.Nachdem Sie das lebende tote Reagenz entfernt haben, waschen Sie das Konstrukt wie gezeigt mit PBS. Übertragen Sie die Probe in eine konfokale Schale und beobachten Sie die Zellen innerhalb des Konstrukts unter einem konfokalen Mikroskop mit 488 und 570 Nanometer Anregung zur Bildaufnahme. Nach dem 3D-Bioprinting wurde die Integrität des biogedruckten Gerüsts geschätzt und die Bildung einer klar definierten Struktur mit Zellen beobachtet, die im Biomaterial eingeschlossen waren.Nach Bioprinting- und Vernetzungsprozessen zeigten die meisten Zellen eine runde Morphologie, wenn das Konstrukt mit einem Astrozytenmedium inkubiert wurde. Die biogedruckten Gerüste behielten nach sieben Tagen Inkubation ihre Integrität bei, und obwohl einige runde Zellen beobachtet wurden, breiteten sich viele Astrozyten im gesamten Konstrukt aus und zeigten astrozytäre Morphologie und Verbindung. Die Zelllebensfähigkeit wurde direkt nach dem Bioprinting bewertet und die Ergebnisse zeigten, dass lebensfähige Zellen bei der niedrigeren Geschwindigkeit bis zu 74% der Gesamtzellen ausmachten, was signifikant höher ist als Zellen, die mit höherer Geschwindigkeit biogedruckt wurden.Die Lebensfähigkeit von biogedruckten Astrozyten wurde auf 2D-kultivierte Astrozyten normalisiert und die Ergebnisse zeigten, dass die biogedruckten Astrozyten am siebten Tag die Lebensfähigkeit signifikant erhöht hatten. Unmittelbar nach dem Bioprinting zeigten die Astrozyten eine runde Morphologie und einen Live-Dead-Assay. Nach einer Woche breiteten sich die Astrozyten im gesamten Konstrukt aus und zeigten eine ausgeprägte Morphologie der Zellen, identisch mit der 2D-Kultur.Die 3D-biogedruckten Astrozyten waren durch Immunfluoreszenz gekennzeichnet. Nach siebentägiger Inkubation im biogedruckten Konstrukt wurden hochdichte Astrozyten mit einer sternartigen Morphologie beobachtet. Die biogedruckten Astrozytenzellen exprimierten den spezifischen Astrozytenmarker Gliafibrillär saures Protein zeigt die Beibehaltung des astrozytären Phänotyps nach sieben Tagen Bioprinting an, und diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biotintenzusammensetzung eine biokompatible Mikroumgebung bot, um die Adhäsion, Ausbreitung und das Wachstum der Astrozyten zu fördern.Die Bewertung der Expression spezifischer Gene und Zellmarker durch die biogedruckten Astrozyten würde Hinweise auf die neurogewebeähnliche Funktion liefern, wie z.B. die astrozytäre Reaktivität nach spezifischen Reizen. Dieses Protokoll ebnet den Weg für die Biofabrikation komplexerer neuroähnlicher Strukturen, die aus verschiedenen Zelltypen in Biomolekülen bestehen und die Nachahmung spezifischer neurogener Nischen ermöglichen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...