Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP), מספרי מענקים 2018/23039-3 ו-2018/12605-8; המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq), מספרי מענקים 465656/2014-5 ו-309679/2018-4; ותיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES), קוד פיננסי 001.

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים פעלו על פי הנחיות בינלאומיות לשימוש בבעלי חיים במחקר (http://www.iclas.org) ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה בחקר הממשלה הפדרלית של סאו פאולו (CEUA 2019/ 9292090519).
1. ניתוח מוח עכברים
<ol><li>העבר 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ Hanks קר (HBSS) לצלחת תרבות 100 מ"מ ו 1 מ"ל למיקרו-טיוב של 1.5 ?...

טכנולוגיית הביו-הדפסה התת-ממדית התפתחה כחלופה ביו-פיברית המאפשרת הנדסת מבנים מעודנים הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית לרקמות מקומיות22, כולל המוח23. biofabrication של רקמות דמויי עצבים מאפשר הנדסה במבחנה מיקרו-וירוסמנט מקומי מודלים, להיות כלי חשוב להבנת המנגנונים ה...

אסטרוציטים הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס במוח. בנוסף לתמיכה עצבית מתמשכת, אסטרוציטים אחראים על ויסות ספיגת נוירוטרנסמיטורים, שמירה על שלמות מחסום הדם - מוח, ווויסות סינפטוגנזה עצבית1,2. אסטרוציטים יש גם תפקיד חיוני דלקת מערכת העצבים, תגובה לפציעות במוח בתהליך שמוביל תגובתיות אסטרוקטריקטית או אסטרוגליוזיס תגובתי3,4, יצירת צלקת גליה המונעת תערוכת רקמות בריאה סוכנים ניווניים5. אירוע זה גורם לשינויים בביטוי הגנים, המורפולוגיה והפונקציה6,7של אסטרוציטים . לכן, מחקרים המערבים את הפונקציונליות של אסטרוציטים מועילים לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות.
מודלים במבחנה חיוניים לחקר מנגנונים הקשורים לפציעות נוירולוגיות, ולמרות שבידוד מוצלח ותרבות דו-ממדית (2D) של אסטרוציטים קליפת המוח הוקמו8, מודל זה אינו מצליח לספק סביבה מציאותית המחקה התנהגות תאים מקורית ולשכפל את המורכבות של המוח9 . במצב 2D, התמיכה המכנית והביוכימית הירודה, אינטראקציות נמוכות בין תאים לתאים ולמטריצת תאים, ושיטוח תאים המוביל להיעדר קוטביות בזאלית-אפית, משפיעים על דינמיקת איתות התא ועל התוצאות הניסיוניות המובילות לשינוי מורפולוגיה של תאים וביטוי גנים, אשר פוגעים בתגובה לטיפולים10. לכן, חשוב לפתח חלופות המספקות סביבה עצבית מציאותית יותר, במטרה לתרגם את התוצאות למרפאה.
תרבית תאים תלת מימדית (תלת-ממדית) מייצגת מודל מתקדם יותר המשיב את תכונות הנאמנות המוגברות של איברים ורקמות, כולל CNS11. לגבי תרבות גליה, מודלים תלת-ממדיים תורמים לשמירה על מורפולוגיה אסטרוציטים, קוטביות בזאלית-אפית של תאים, ואיתות תאים12,13. טכנולוגיית הביו-הדפסה בתלת-ממד התפתחה ככלי רב עוצמה לביו-פבריות של רקמות חיות תלת-ממדיות באופן מבוקר באמצעות תאים וביו-חומרים כדי לשחזר את המבנה והמאפיינים של רקמות מקומיות. השימוש בטכנולוגיה זו הוביל לשיפור משמעותי בחיזוי התוצאות ותרם לרפואה רגנרטיבית המיושמת ב- CNS14,15,16.
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הבידוד והתרבות של אסטרוציטים קליפת המוח. הפרוטוקול מפרט גם שיטה לשחזור אסטרוציטים ביו-הדפסה מוטבע ג'לטין / ג'לטין מתאקרילויל (GelMA)/פיברינוגן, בתוספת למינין. בעבודה זו, ביו-הדפסה מבוססת שחול שימשה להדפסת ההרכב הביו-חומרי המכיל אסטרוציטים קליפת המוח בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל. לחץ הגיוטה של ביו-הדפסה צומצם על ידי שליטה במהירות ההדפסה, ואסטרוציטים הראו כדאיות גבוהה לאחר התהליך. מבנים מודפסים ביו-מודפסים היו מתורבתים במשך שבוע אחד, ואסטרוציטים הצליחו להתפשט, לצרף ולשרוד בתוך ההידרוג'ל, לשמור על המורפולוגיה האסטרוציטית ולהביע סמן ספציפי של חלבון חומצי גליה (GFAP)4.
הליך זה תואם עם ביו-הדפסה מונחית בוכנה וניתן להשתמש בו כדי לבצע אסטרוציטים בהדפסה ביולוגית שמקורם במקורות שונים. המודל המודפס בתלת-ממד המוצע כאן מתאים למגוון רחב של יישומי הנדסה עצבית, כגון מחקרים של המנגנונים המעורבים בפונקציונליות אסטרוציטים ברקמות בריאות והבנת התקדמות הפתולוגיות הנוירולוגיות ופיתוח הטיפול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

אסטרוציטים הם תאי גליה עם תפקיד חיוני במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), כולל תמיכה עצבית ופונקציונליות. תאים אלה מגיבים גם לפציעות עצביות ופועלים כדי להגן על הרקמה מפני אירועים ניווניים. אין ויטרו מחקרים על תפקוד אסטרוציטים חשובים כדי לבהיר את המנגנונים המעורבים באירועים כאלה ולתרום לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לביו-פטרייתית מבנה רקמות דמוי עצב עשיר באסטרוציטים על ידי ביו-סינק עתיר אסטרוציטים תלת-ממדי. נעשה שימוש בביו-הדפסה תלת-ממדית מבוססת שחול בעבודה זו, ואסטרוציטים חולצו מגורי המוח של עכברי C57Bl/6. הביו-וינק הוכן על ידי ערבוב אסטרוציטים קליפת המוח ממעבר 3 לתמיסה ביו-חומרית המורכבת מג'לטין, ג'לטין-מתיאקרילויל (GelMA) ופיברינוגן, בתוספת למינין, שהציג תנאי הדפסה ביולוגית אופטימליים. תנאי הביוהדפסה בתלת-ממד מזערו את הלחץ בתאים, ותרמו לבישאיות הגבוהה של האסטרוציטים במהלך התהליך, שבו 74.08% ± 1.33% מהתאים היו ברי קיימא מיד לאחר הדפסה ביולוגית. לאחר שבוע אחד של דגירה, הכדאיות של אסטרוציטים גדלה באופן משמעותי ל 83.54% ± 3.00%, המציין כי המבנה 3D מייצג microenvironment מתאים לצמיחת התא. ההרכב הביו-חומריםי אפשר חיבור תאים והתנהגות אסטרוציטית מגורה, עם תאים המבטאים את החלבון חומצי פרברילית גליה סמן ספציפי (GFAP) ובעל מורפולוגיה אסטרוציטית טיפוסית. פרוטוקול רבייה זה מספק שיטה בעלת ערך לביו-פבריקט של רקמה דמוית עצב תלת-ממדית עשירה באסטרוציטים הדומים למיקרו-סביבה הטבעית של התאים, שימושית לחוקרים שמטרתם להבין את תפקודם של אסטרוציטים ואת יחסם למנגנונים המעורבים במחלות נוירולוגיות.

עבודה זו נועדה לפתח רקמה דמוית עצב באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית להפקדת ביונק ג'לטין ראשי עמוס אסטרוציטים/גלמה/פיברינוגן. אסטרוציטים חולצו ובודדו מקליפת המוח של גורי עכברים (איור 1), נוספו להרכב ביו-חומרי, המאפשר ביו-פיכחון של מבנה תלת-ממדי חי.
?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

כאן אנו מדווחים על שיטה של אסטרוציטים קליפת המוח הדפסה ביולוגית 3D עבור biofabricating רקמות עצביות כדי ללמוד את הפונקציונליות של אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית ואת המנגנונים מעורבים תאי גליה במחלות נוירולוגיות וטיפולים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

ביו-הדפסה תלת-ממדית של אסטרוציטים מייצגת התקדמות בהנדסת רקמות נוירו, ומאפשרת ביו-פיבריות של מודלים במבחנה שימושיים להבנת המנגנונים המעורבים במחלות נוירולוגיות. היתרון העיקרי של ביו-הדפסה תלת-ממדית הוא ביו-פטריית מבנים מן החוץ של התאים המחקים את התכונות הביוכימיות והמכניות של הרקמות, ומספקים הבנה טובה יותר של דינמיקת התאים בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על biofabrication של רקמות רכות אחרות, כפי שהוא מבוסס על הדפסה ביולוגית 3D של ביו-דיו המורכב פולימרים טבעיים ורכיבי מטריצה חוץ תאית.ראשית, לחתוך את רקמת קליפת המוח מבודד מן העכבר המתת חסד לחתיכות קטנות עם מספריים מיקרו מעוקלים. לשטוף את חתיכות הרקמה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של HBSS על ידי צינור למעלה ולמטה. לאחר הסרת HBSS הוסיף בפעם השלישית, להוסיף מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין ולדגירה את הרקמה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לניתוק רקמות מכני, יש להפיץ בעדינות את תערובת טריפסין הרקמה למעלה ולמטה 15 פעמים. לאחר מכן, להעביר את התערובת מנותקת לצינור חרוט 15 מיליליטר ולהוסיף נפח שווה של FBS כדי לנטרל את פעילות טריפסין. סנן את המתלה באמצעות מסנן מסנן מסננת תאי מיקרומטר 0.4 כדי להסיר שברים שאינם מנותקים.לשטוף את המסנן עם מיליליטר אחד של אסטרוציטים בינוני. גלולה למטה השעיית התא המסונן על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatant, להשעות את גלולה התא במיליליטר אחד של אסטרוציטים תרבות מדיום.העבר את ההשעיה התאית לבקבוקון תרבות T25. להפוך את הנפח הבינוני הכולל של 3.5 מיליליטר ולדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לקבלת פיברינוגן בריכוז הסופי של שלושה מיליגרם למיליליטר, להעביר 0.9 מיליליטר של 10 מיליגרם לכל תמיסת פיברינוגן מיליליטר לפתרון ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל.לקבלת יוזם התמונה בריכוז הסופי של 0.5% משקל לפי נפח, להוסיף 0.015 גרם של יוזם תמונה מוכן ג'לטין-ג'לטין methacryloyl פיברינוגן. לאחר מערבולת, לשמור על הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור כדי למנוע השפלה PI. לאחר מכן, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.2 לתוך צינור חרוט סטרילי 15 מיליליטר.העבר 980 מיקרוליטרים של הפתרון הביו-חומריםי לצינור חרוט 15 מיליליטר. לקבלת למינין בריכוז הסופי של שני מיקרוגרם למיליליטר, הוסף 20 מיקרוליטרים של למינין מדולל לצינור המכיל ביו-דיו. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, הימנעות בועות ולשמור על פתרון ביו-דיו ב 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לקבל מעורבב עם התאים.Trypsinize את אסטרוציטים הראשי עם 0.05%טריפסין במשך 5 דקות ולנטרל את פעילות טריפסין עם FPS ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר ספירת התאים, העבר 1 כפול 10 ל -6 תאים לצינור חרוט וצנטריפוגה שונים כפי שהודגם.השאירו רק 200 מיקרוליטרים של הסופר-נט בצינור והשעו את גלולה התא על ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור החרוט. כדי להשיג ריכוז סופי של 1 כפול 10 ל 6 תאים למיליליטר, להעביר מיליליטר אחד של פתרון פיברינוגן ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל לצינור המכיל את התאים הומוגניזציה על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה. השתמש 1000 פיפטה מיקרוליטר להעביר לאט את אסטרוציטים הניח ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל פיברינוגן ביו-דיו פתרון מזרק פלסטיק חמישה מיליליטר, הימנעות היווצרות בועה.חבר מחט קהה סטרילית 22 מד למזרק. לחשוף את הביו-הדפסה לאור UV במשך 15 דקות, ולאחר מכן לנגב את הביו-הדפסה עם 70%אתנול, ולאחר מכן לחבר את המזרק לראש ההדפסה ביו הדפסה באופן ידני לשטוף את הדיו הביולוגי כדי להסיר את הבועות הנותרות. כדי לבצע הדפסה ביולוגית, מניחים צלחת תרבות של 35 מ"מ על שולחן הביו-הדפסה, מקמו את המחט במרחק של 0.1 מילימטרים משטח צלחת התרבות כדי לאפשר תנועה של המחט ולחצו על כפתור ההדפסה".לאחר סיום ההדפסות הביולוגיות, ודאו שהמזרק מתרחק מהמנה וסוגרים את מנת התרבות. מניחים את מנת התרבות תחת אור UV לחיבור צולב של ג'לטין מתאקרילויל. השתמש מרית סטרילית כדי להעביר את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת 24 באר.הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת סידן כלורי תרומבין והשאירו למשך 30 דקות כדי לאפשר חיבור צולב של פיברין. לאחר הסרת הפתרון חוצה קישור, לשטוף את המבנה עם שני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן להחליף את PBS עם מיליליטר אחד של אסטרוציטים תרבות מדיום. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ולשנות את המדיום כל שלושה ימים.השתמש מרית כדי להעביר את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת תרבות 35 מ"מ. לשטוף את המבנה עם מיליליטר אחד של PBS. הפקד 100 מיקרוליטרים של ריאגנט מת חי מעל המבנה ולשמור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, שמירה על זה מוגן מפני אור.לאחר הסרת ריאגנט מת חי, לשטוף את המבנה עם PBS כפי שהוכח. העבר את המדגם לצלחת קונפוקלית והתבונן בתאים בתוך המבנה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עירור של 488 ו -570 ננומטר לרכישת תמונה. לאחר הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, הוערכה שלמות הפיגומים המודפסים ביולוגית והיווצרות מבנה מוגדר היטב נצפתה עם תאים לכודים בתוך הביו-חומרים.לאחר ביו-הדפסה ותהליכי קישור צולב, רוב התאים הציגו מורפולוגיה עגולה כאשר המבנה היה דגירה עם מדיום אסטרוציטים. הפיגומים המודפסים ביו-מודפסים שמרו על שלמות לאחר שבעה ימים של דגירה, ולמרות שנצפתו כמה תאים עגולים, אסטרוציטים רבים התפשטו ברחבי המבנה, והציגו מורפולוגיה אסטרוציטית ויחסים הדדיים. הכדאיות של התא הוערכה מיד לאחר הדפסה ביולוגית ותוצאות הראו כי במהירות נמוכה יותר, תאים קיימא ייצגו עד 74% מכלל התאים, להיות גבוה באופן משמעותי מאשר תאים ביוהדפסה במהירות גבוהה יותר.הכדאיות של אסטרוציטים מודפסים ביו-מודפסים מנורמלה לאסטרוציטים מתורבתים 2D והתוצאות הצביעו על כך שביום השביעי, האסטרוציטים המודפסים ביו-מודפסים הגדילו באופן משמעותי את הכדאיות. מיד לאחר הטביעה הביולוגית, האסטרוציטים הראו מורפולוגיה עגולה ובחון מת חי. לאחר שבוע, האסטרוציטים התפשטו לאורך המבנה והציגו מורפולוגיה ברורה של תאים, זהים לתרבות הדו-די.האסטרוציטים המודפסים ביו-ממדיים התאפיינו באימונופלואורסצנטיות. לאחר שבעה ימים של דגירה במבנה המודפס ביולוגית, נצפו אסטרוציטים צפופים מאוד עם מורפולוגיה דמוית כוכב. תאי האסטרוציטים המודפסים ביו-מודפסים הביעו את החלבון החומצי גליה גליה סמן אספרילרי ספציפי מציין שמירה על פנוטיפ אסטרוציטי לאחר שבעה ימים של ביו-הדפסה, ותוצאות אלה מצביעות על כך שהרכב הביו-דיו סיפק מיקרו-סביבה תואמת ביולוגית לקידום הידבקות, התפשטות וצמיחה של אסטרוציטים.הערכה של ביטוי גנים וסמני תאים ספציפיים על ידי אסטרוציטים מודפסים ביולוגית תספק עדות לתפקוד דמוי הרקמה העצבית, כגון תגובתיות אסטרוציטארית בעקבות גירויים ספציפיים. פרוטוקול זה סולל את הדרך לביו-פיכחון של מבנים מורכבים יותר דמויי נוירו המורכבים מסוגים שונים של תאים ביומולקולס, ומאפשר חיקוי של נישות נוירוגניות ספציפיות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...