Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
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इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP), अनुदान संख्या 2018/23039-3 और 2018/12605-8 द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद (CNPq), अनुदान संख्या 465656/2014-5 और 309679/2018-4; और उच्च शिक्षा कर्मियों (CAPES), वित्तीय कोड 001 के सुधार के लिए समन्वय।

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं ने अनुसंधान (http://www.iclas.org) में पशु उपयोग के लिए अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन किया और यूनीवर्सिडे फेडरल डी साओ पाउलो (सीईआ 2019/9292090519) के अनुसंधान में नैतिकता के लिए समित?...

3डी बायोप्रिंटिंग तकनीक एक बायोफैब्रिकेशन विकल्प के रूप में उभरी है जो परिष्कृत निर्माणों की इंजीनियरिंग की अनुमति देता है जो संरचनात्मक और शारीरिक रूप से देशी ऊतकों के समानहोता है,जिसमें म?...

एस्ट्रोसाइट्स सेंट्रल नर्वस सिस्टम (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं और मस्तिष्क होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। स्थायी न्यूरोनल समर्थन के अलावा, एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोट्रांसमीटर तेज को मॉडुल करने, रक्त-मस्तिष्क बाधा अखंडता को बनाए रखने और न्यूरोनल सिनेप्टोजेनेसिस1,2को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। सीएनएस सूजन में एस्ट्रोसाइट्स की भी एक आवश्यक भूमिका होती है, जो मस्तिष्क को चोटों का जवाब देता है, जो एस्ट्रोसिटरी रिएक्टिविटी या प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोग्लियोसिस3,4की ओर जाता है, एक चमकदार निशान बनाता है जो अपक्षयी एजेंटों के स्वस्थ ऊतकों को उजागर करने से रोकता है5। इस घटना के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स की जीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन6, 7में परिवर्तनहोताहै। इसलिए, एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता से जुड़े अध्ययन न्यूरोलॉजिक विकारों के इलाज के लिए उपचारों के विकास के लिए सहायक हैं।
इन विट्रो मॉडल न्यूरोलॉजिकल चोटों से संबंधित तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और हालांकि कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की सफल अलगाव और दो-आयामी (2डी) संस्कृति8 स्थापितकी गई है, यह मॉडल एक यथार्थवादी वातावरण प्रदान करने में विफल रहता है जो देशी कोशिका व्यवहार की नकल करता है और मस्तिष्क की जटिलता को पुन: पेश करताहै 9 . 2डी स्थिति में, खराब यांत्रिक और जैव रासायनिक समर्थन, कम सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन, और सेल सपाट बेसल-एपिकल ध्रुवीकरण की अनुपस्थिति के लिए अग्रणी, सेल सिग्नलिंग गतिशीलता और प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित करता है जिससे सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति बदल जाती है, जो उपचार10के प्रति प्रतिक्रिया से समझौता करती है। इसलिए, यह विकल्प है कि एक और अधिक यथार्थवादी तंत्रिका वातावरण प्रदान विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्लिनिक के लिए परिणामों का अनुवाद करने के लिए लक्ष्य ।
त्रि-आयामी (3 डी) कोशिका संस्कृति एक अधिक उन्नत मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है जो सीएनएस11सहित अंगों और ऊतकों की बढ़ी हुई निष्ठा सुविधाओं के साथ पुनः मृत्यु हो जाती है। ग्लियल संस्कृति के बारे में, 3 डी मॉडल एस्ट्रोसाइट्स आकृति विज्ञान, सेल बेसल-एपिकल ध्रुवता, और सेल सिग्नलिंग12, 13के रखरखाव में योगदानदेतेहैं। 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक देशी ऊतकों की संरचना और गुणों को फिर से बनाने के लिए कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स का उपयोग करके नियंत्रित तरीके से 3 डी जीवित ऊतकों को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा। इस तकनीक के प्रयोग से परिणामों की भविष्यवाणी में काफी सुधार हुआ है और इसने सीएनएस14 , 15,16पर लागू पुनर्योजी दवा में योगदान दिया है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति का विवरण दिया गया है । प्रोटोकॉल में जिलेटिन/जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) /फाइब्रिनोजेन में एम्बेडेड एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि का भी विवरण दिया गया है, जो लेमिनिन के साथ पूरक है । इस काम में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स युक्त बायोमैटेरियल कंपोजिशन को प्रिंट करने के लिए एक्सट्रूस बेस्ड बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया । प्रिंटिंग की गति को नियंत्रित करके बायोप्रिंटिंग कतरनी तनाव को कम किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स ने प्रक्रिया के बाद उच्च व्यवहार्यता दिखाई। बायोप्रिंटेड निर्माण 1 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे, और एस्ट्रोसाइट्स हाइड्रोगेल के भीतर फैलने, संलग्न करने और जीवित रहने में सक्षम थे, एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान को बनाए रखते थे और एक विशिष्ट मार्कर ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी)4व्यक्त करते थे।
यह प्रक्रिया पिस्टन-संचालित एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर के साथ संगत है और इसका उपयोग विभिन्न स्रोतों से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए किया जा सकता है। यहां प्रस्तावित 3 डी बायोप्रिंटेड मॉडल तंत्रिका इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है, जैसे स्वस्थ ऊतकों में एस्ट्रोसाइट्स कार्यक्षमता में शामिल तंत्र का अध्ययन और न्यूरोलॉजिकल विकृतियों और उपचार विकास की प्रगति को समझना।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में एक आवश्यक भूमिका के साथ ग्लियल कोशिकाएं हैं, जिसमें न्यूरोनल समर्थन और कार्यक्षमता शामिल है। ये कोशिकाएं तंत्रिका चोटों का भी जवाब देती हैं और ऊतक को अपक्षयी घटनाओं से बचाने के लिए कार्य करती हैं। एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता के इन विट्रो अध्ययन ऐसी घटनाओं में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने और न्यूरोलॉजिकल विकारों के इलाज के लिए उपचार विकसित करने में योगदान देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल 3 डी बायोप्रिंटिंग एस्ट्रोसाइट्स-लादेन बायोइंक द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध तंत्रिका जैसी ऊतक संरचना को बायोफैब्रिकेट करने की विधि का वर्णन करता है। इस काम में एक एक्सट्रूशन-आधारित 3डी बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स C57Bl/6 चूहों पिल्ले के ब्रेन कॉर्टिस से निकाले गए थे । बायोइंक को कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को 3 से पारित होने तक जिलेटिन, जिलेटिन-मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) और फाइब्रिनोजेन से बना बायोमे्टरियल समाधान में मिलाकर तैयार किया गया था, जो लेमिनिन के साथ पूरक था, जिसने इष्टतम बायोप्रिंटिंग स्थितियां प्रस्तुत कीं। 3 डी बायोप्रिंटिंग स्थितियों ने सेल तनाव को कम किया, इस प्रक्रिया के दौरान एस्ट्रोसाइट्स की उच्च व्यवहार्यता में योगदान दिया, जिसमें बायोप्रिंटिंग के बाद 1.33% कोशिकाओं के 74.08% ± व्यवहार्य थे। इनक्यूबेशन के 1 सप्ताह के बाद, एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता काफी बढ़कर 3.00% ± 83.54% हो गई, जो यह दर्शाती है कि 3 डी निर्माण सेल विकास के लिए एक उपयुक्त माइक्रोएनवायरमेंट का प्रतिनिधित्व करता है। बायोमैटेरियल संरचना ने कोशिका लगाव और उत्तेजित एस्ट्रोसाइटिक व्यवहार की अनुमति दी, जिसमें कोशिकाओं ने विशिष्ट एस्ट्रोसाइट्स मार्कर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को व्यक्त किया और विशिष्ट एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान रखा। यह प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध 3 डी तंत्रिका जैसे ऊतक को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक मूल्यवान विधि प्रदान करता है जो कोशिकाओं के देशी माइक्रोएनवायरमेंट जैसा दिखता है, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है जिसका उद्देश्य एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों में शामिल तंत्र से उनके संबंध को समझना है।

इस काम का उद्देश्य 3डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके एक तंत्रिका जैसे ऊतक विकसित करना है ताकि परत-दर-परत प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स-लादेन जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन बायोइंक जमा किया जा सके । एस्ट्रो...

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3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

यहां हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों और उपचारों में ग्लियल कोशिकाओं से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका जैसे ऊतकों के लिए बायोफैब्रिकेट के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं।

इंजीनियरिंग न्यूरल-जैसे ऊतक के लिए मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की 3डी बायोप्रिंटिंग

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

एस्ट्रोसाइट्स का 3डी बायोप्रिंटिंग न्यूरो टिश्यू इंजीनियरिंग में एक अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे इन विट्रो मॉडल के बायोफैब्रिकेशन की अनुमति होती है जो न्यूरोलॉजिकल रोग में शामिल तंत्र को समझने के लिए उपयोगी होते हैं। 3 डी बायोप्रिंटिंग का मुख्य लाभ कोशिका सहायक संरचनाओं को बायोफैब्रिक करना है जो ऊतकों की जैव रासायनिक और यांत्रिक विशेषताओं की नकल करते हैं, जो स्वास्थ्य और रोग में कोशिका गतिशीलता की बेहतर समझ प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल अन्य नरम ऊतकों के बायोफैब्रिकेशन पर लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह प्राकृतिक पॉलिमर और बाह्राश मैट्रिक्स घटकों से बना बायो-इंक के 3 डी बायोप्रिंटिंग पर आधारित है।शुरू करने के लिए, कॉर्टिकल ऊतक को इच्छामृत्यु वाले माउस से अलग करते हुए घुमावदार माइक्रो कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में काट लें। ऊतक के टुकड़ों को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एचबीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। तीसरी बार एचबीबीएस को हटाने के बाद, 0.05% ट्राइप्सिन का एक मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें।यांत्रिक ऊतक वियोजन के लिए, धीरे-धीरे ऊतक ट्राइप्सिन मिश्रण को 15 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। इसके बाद, एक 15 मिलीलीटर शंकुदाता के लिए अलग मिश्रण हस्तांतरण और एफबीएस की एक समान मात्रा जोड़ने के लिए ट्रिप्सिन गतिविधि बेअसर । गैर-वियोजनित टुकड़ों को हटाने के लिए 0.4 माइक्रोमीटर सेल छन्नी फिल्टर के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें।एस्ट्रोसाइट्स माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ फिल्टर धोएं। अपकेंद्रित्र द्वारा फ़िल्टर सेल निलंबन नीचे गोली। सुपरनेट को छोड़ने के बाद, एस्ट्रोसाइट्स कल्चर मीडियम के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को निलंबित करें।सेल निलंबन को टी-25 संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 3.5 मिलीलीटर की कुल मध्यम मात्रा बनाएं और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। तीन मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर फाइब्रिनोजन प्राप्त करने के लिए, जिलेटिन-जिलेटिन मेथाक्रिलोइल समाधान के लिए 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर फाइब्रिनोजेन समाधान के 0.9 मिलीलीटर स्थानांतरित करें।मात्रा से 0.5% वजन की अंतिम एकाग्रता पर फोटो सर्जक प्राप्त करने के लिए, तैयार जिलेटिन-जिलेटिन मेथाक्रिलोइल फाइब्रिनोजेन समाधान में 0.015 ग्राम फोटो सर्जक जोड़ें। भंवर के बाद, समाधान को 40 डिग्री सेल्सियस पर रखें, पीआई गिरावट से बचने के लिए प्रकाश से सुरक्षित रहें। इसके बाद, एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु नली में एक 0.2 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।बायोमटेरियल सॉल्यूशन के 980 माइक्रोलीटर को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर लेमिनिन प्राप्त करने के लिए, जैव स्याही युक्त ट्यूब में पतला लेमिनिन के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा धीरे मिलाएं, बुलबुले से बचें और कोशिकाओं के साथ मिश्रित होने के लिए तैयार होने तक बायो-इंक समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।5 मिनट के लिए 0.05% ट्राइप्सिन के साथ प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स को ट्रिप्सिन करें और एफपीएस के साथ ट्राइप्सिन गतिविधि को एक से एक के अनुपात में बेअसर करें। फिर, कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 200 बार जी पर 15 मिलीलीटर शंकु नली और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं की गिनती के बाद, 1 बार 10 को 6 कोशिकाओं में एक अलग शंकु नली और अपकेंद्रित्र के रूप में प्रदर्शित करने के लिए स्थानांतरित करें।ट्यूब में सुपरनेट के केवल 200 माइक्रोलीटर छोड़ दें और शंकु नली के नीचे धीरे-धीरे टैप करके सेल पेलेट को निलंबित कर दें। प्रति मिलीलीटर 6 कोशिकाओं को 1 गुना 10 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं वाली ट्यूब में जिलेटिन-जिलेटिन मेथाक्रिलोइल फाइब्रिनोजेन समाधान के एक मिलीलीटर को स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समरूप हो जाएं। बबल बनने से बचते हुए पांच मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज में जिलेटिन-जिलेटिन मेथाक्रिलोइल फाइब्रिनोजेन बायो-इंक समाधान में रखे एस्ट्रोसाइट्स को धीरे-धीरे स्थानांतरित करने के लिए 1000 माइक्रोलिटर पिपेट का उपयोग करें।सिरिंज के लिए एक बाँझ 22 गेज कुंद सुई कनेक्ट करें। बायोप्रिंटर को 15 मिनट के लिए यूवी लाइट में बेनकाब करें, और फिर बायोप्रिंटर को 70% इथेनॉल से पोंछें, फिर सिरिंज को बायोप्रिंटर प्रिंट हेड से कनेक्ट करें और शेष बुलबुले को हटाने के लिए बायो-इंक को मैन्युअल रूप से फ्लश करें। बायोप्रिंटिंग का संचालन करने के लिए, बायोप्रिंटर टेबल पर 35 मिलीमीटर कल्चर डिश पर रखें, सुई के आंदोलन की अनुमति देने और प्रिंट बटन दबाने के लिए संस्कृति पकवान सतह से सुई 0.1 मिलीमीटर दूर रखें।एक बार बायोप्रिंटिंग खत्म हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि सिरिंज डिश और क्लोज कल्चर डिश से दूर चले जाते हैं। जिलेटिन मेथाक्रिलोइल क्रॉस-लिंकिंग के लिए यूवी लाइट के नीचे कल्चर डिश रखें। बायोप्रिंटेड निर्माण को 24 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ स्पैटुला का उपयोग करें।थ्रोम्बिन कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और फाइब्रिन क्रॉस-लिंकिंग की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दें। क्रॉस-लिंकिंग समाधान को हटाने के बाद, पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ निर्माण को धोएं, फिर पीबीएस को एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट और हर तीन दिन में माध्यम बदल जाते हैं।बायोप्रिंटेड निर्माण को 35 मिलीमीटर संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें। पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ निर्माण धोएं। निर्माण पर जीवित मृत अभिकर्ण के 100 माइक्रोलीटर जमा करें और इसे प्रकाश से सुरक्षित रखते हुए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।लाइव डेड रिएजेंट को हटाने के बाद, प्रदर्शन के अनुसार पीबीएस के साथ निर्माण को धोएं। नमूने को एक कॉन्फोकल डिश में स्थानांतरित करें और छवि अधिग्रहण के लिए 488 और 570 नैनोमीटर उत्तेजन का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निर्माण के भीतर कोशिकाओं का निरीक्षण करें। 3 डी बायोप्रिंटिंग के बाद, बायोप्रिंटेड पाड़ की अखंडता का अनुमान लगाया गया था और बायोमटेरियल के भीतर फंसी कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित संरचना के गठन को देखा गया था।बायोप्रिंटिंग और क्रॉस-लिंकिंग प्रक्रियाओं के बाद, अधिकांश कोशिकाओं ने गोल आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया जब निर्माण को एस्ट्रोसाइट माध्यम के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। बायोप्रिंटेड मचानों ने इनक्यूबेशन के सात दिनों के बाद अखंडता बनाए रखी, और हालांकि कुछ गोल कोशिकाओं को देखा गया, लेकिन कई एस्ट्रोसाइट्स पूरे निर्माण में फैले हुए थे, जो एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान और इंटरकनेक्शन पेश करते थे। कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन बायोप्रिंटिंग के ठीक बाद किया गया था और परिणामों से पता चला कि कम गति पर, व्यवहार्य कोशिकाओं ने कुल कोशिकाओं के 74% तक का प्रतिनिधित्व किया, जो उच्च गति पर बायोप्रिंटेड कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक है।बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता को 2डी सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में सामान्य किया गया था और परिणामों से संकेत मिलता है कि सातवें दिन, बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स ने व्यवहार्यता में काफी वृद्धि की थी। बायोप्रिंटिंग के तुरंत बाद, एस्ट्रोसाइट्स ने गोल आकृति विज्ञान और जीवित मृत परख दिखाई। एक सप्ताह के बाद, एस्ट्रोसाइट्स पूरे निर्माण में फैल गए और कोशिकाओं की एक अलग आकृति प्रस्तुत की, जो 2डी संस्कृति के समान थी।3 डी बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विशेषता थी। बायोप्रिंटेड निर्माण में इनक्यूबेशन के सात दिनों के बाद, स्टार जैसी आकृति विज्ञान के साथ अत्यधिक घने एस्ट्रोसाइट्स देखे गए। बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट कोशिकाओं ने विशिष्ट एस्ट्रोसाइट्स मार्कर ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन को जैव मुद्रण के सात दिनों के बाद एस्ट्रोसाइटिक फेनोटाइप को बनाए रखने का संकेत दिया, और इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बायो-इंक संरचना ने एस्ट्रोसाइट्स के आसंजन, प्रसार और विकास को बढ़ावा देने के लिए एक जैव-प्रतिस्पर्धी माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान किया।बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स द्वारा विशिष्ट जीन और सेल मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन न्यूरो ऊतक जैसे कार्य का सबूत प्रदान करेगा, जैसे विशिष्ट उत्तेजनाओं के बाद एस्ट्रोसाइटरी प्रतिक्रियाशीलता। यह प्रोटोकॉल बायोमॉलिक्यूल्स में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से बनी अधिक जटिल न्यूरो जैसी संरचनाओं के बायोफैब्रिकेशन का मार्ग प्रशस्त करता है, जिससे विशिष्ट न्यूरोजेनिक निकस की नकल की अनुमति होती है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

एक murine मॉडल में आंत का ऊतक इंजीनियरिंग

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

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एक मानव 3 डी के ऊतक इंजीनियरिंग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; ट्यूमर परीक्षा प्रणाली

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

टिशू इंजीनियरिंग: स्तरित सेल पत्रक के वितरण के लिए एक बहुकोशिकीय 3D पाड़ के निर्माण

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

संवहनी ऊतक उत्थान के लिए इंजीनियरिंग 3 डी Cellularized कोलेजन जैल

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग करने वाले स्पैरोइड्स के मेडीकल इंटीग्रेशन का कार्डिएक टिश्यू का निर्माण

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए vascularization इकाइयों के रूप में म्यूरीन वसा ऊतक व्युत्पन्न माईक्रवैस्कुलर टुकड़े के अलगाव

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

ऊतकों और Organoids इंजीनियरिंग के लिए Microfluidic Bioprinting Vascularized

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

उपास्थि और त्वचा ऊतक Bioink Precellularization के लिए एक उपंयास निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक के उपयोग के अनुरूप का मुद्रण

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

जिलेटिन मेथक्रिलोइल हाइड्रोजेल आधारित बायोइंक्स के 3डी बायोप्रिंटिंग के प्रोटोकॉल

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...