Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la ricerca di San Paolo (FAPESP), numeri di sovvenzione 2018/23039-3 e 2018/12605-8; Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq), numeri di sovvenzione 465656/2014-5 e 309679/2018-4; e Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES), codice finanziario 001.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito le linee guida internazionali per l'uso degli animali nella ricerca (http://www.iclas.org) e sono state approvate dal Comitato per l'etica nella ricerca dell'Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).
1. Dissezione cerebrale dei topi
<ol><li>Trasferire 10 mL di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) fredda in una soluzione di coltura da 100 mm e 1 mL in un microtubo da 1,5 mL. Preparare un microtubo per animale.<...

La tecnologia di bioprinting 3D è emersa come alternativa alla biofabbricazione che consente l'ingegnerizzazione di costrutti raffinati che strutturalmente e fisiologicamente assomigliano ai tessuti nativi22, incluso il cervello23. La biofabbricazione di tessuti simili a quelli neurali consente la modellazione in vitro del microambiente nativo, essendo uno strumento importante per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari associati allo sviluppo e al trattam...

Gli astrociti sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi cerebrale. Oltre a sopportare il supporto neuronale, gli astrociti sono responsabili della modulazione dell'assorbimento dei neurotrasmettitori, del mantenimento dell'integrità della barriera emato-encefalica e della regolazione della sinaptogenesi neuronale1,2. Gli astrociti hanno anche un ruolo essenziale nell'infiammazione del SNC, rispondendo alle lesioni al cervello in un processo che porta alla reattività astrologica o all'astrogliosi reattiva3,4,formando una cicatrice gliale che impedisce l'esposizione di tessuti sani ad agenti degenerativi5. Questo evento provoca cambiamenti nell'espressione genica, nella morfologia e nella funzione degli astrociti6,7. Pertanto, gli studi che coinvolgono la funzionalità degli astrociti sono utili per lo sviluppo di terapie per il trattamento di disturbi neurologici.
I modelli in vitro sono cruciali per lo studio dei meccanismi legati alle lesioni neurologiche e, sebbene siano stati stabiliti un isolamento di successo e una coltura bidimensionale (2D) di astrociti corticali8, questo modello non riesce a fornire un ambiente realistico che imita il comportamento delle cellule native e a riprodurre la complessità del cervello9 . In condizioni 2D, lo scarso supporto meccanico e biochimico, le basse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice e l'appiattimento cellulare che porta all'assenza di polarità basale-apicale, influenzano la dinamica della segnalazione cellulare e gli esiti sperimentali che portano a un'alterata morfologia cellulare e all'espressione genica, che compromettono la risposta ai trattamenti10. Pertanto, è fondamentale sviluppare alternative che forniscano un ambiente neurale più realistico, con l'obiettivo di tradurre i risultati in clinica.
La coltura cellulare tridimensionale (3D) rappresenta un modello più avanzato che ricapitola con maggiore fedeltà le caratteristiche di organi e tessuti, tra cui il CNS11. Per quanto riguarda la coltura gliale, i modelli 3D contribuiscono al mantenimento della morfologia degli astrociti, della polarità basale-apicale cellulare e della segnalazione cellulare12,13. La tecnologia di bioprinting 3D è emersa come un potente strumento per biofabbricare tessuti viventi 3D in modo controllato utilizzando cellule e biomateriali per ricreare la struttura e le proprietà dei tessuti nativi. L'utilizzo di questa tecnologia ha portato ad un sostanziale miglioramento della previsione dei risultati e ha contribuito alla medicina rigenerativa applicata al SNC 14,15,16.
Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'isolamento e la coltura degli astrociti corticali. Il protocollo descrive anche un metodo riproducibile per biostampare astrociti incorporati in gelatina / gelatina metacriloil (GelMA) / fibrinogeno, integrato con laminina. In questo lavoro, una biostampante basata sull'estrusione è stata utilizzata per stampare la composizione del biomateriale contenente astrociti corticali ad una densità di 1 x10 6 cellule / ml. Lo stress di taglio della biostampa è stato ridotto al minimo controllando la velocità di stampa e gli astrociti hanno mostrato un'elevata vitalità dopo il processo. I costrutti biostampati sono stati coltivati per 1 settimana e gli astrociti sono stati in grado di diffondersi, attaccarsi e sopravvivere all'interno dell'idrogel, mantenendo la morfologia astrocitica ed esprimendo uno specifico marcatore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP)4.
Questa procedura è compatibile con bioprinter a base di estrusione azionata da pistone e può essere utilizzata per biostampare astrociti derivati da fonti diverse. Il modello biostampato 3D qui proposto è adatto per una vasta gamma di applicazioni di ingegneria neurale, come gli studi dei meccanismi coinvolti nella funzionalità degli astrociti nei tessuti sani e la comprensione della progressione delle patologie neurologiche e lo sviluppo del trattamento.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

Gli astrociti sono cellule gliali con un ruolo essenziale nel sistema nervoso centrale (SNC), compreso il supporto neuronale e la funzionalità. Queste cellule rispondono anche alle lesioni neurali e agiscono per proteggere il tessuto da eventi degenerativi. Gli studi in vitro sulla funzionalità degli astrociti sono importanti per chiarire i meccanismi coinvolti in tali eventi e contribuire allo sviluppo di terapie per il trattamento dei disturbi neurologici. Questo protocollo descrive un metodo per biofabbricare una struttura tissutale simile a quella neurale ricca di astrociti mediante bioink 3D bioprinting carico di astrociti. In questo lavoro è stato utilizzato un bioprinter 3D basato sull'estrusione e gli astrociti sono stati estratti dalle cortecce cerebrali dei cuccioli di topi C57Bl / 6. Il bioink è stato preparato mescolando astrociti corticali fino al passaggio 3 in una soluzione di biomateriale composta da gelatina, gelatina-metacriloile (GelMA) e fibrinogeno, integrata con laminina, che presentava condizioni ottimali di bioprinting. Le condizioni di bioprinting 3D hanno ridotto al minimo lo stress cellulare, contribuendo all'elevata vitalità degli astrociti durante il processo, in cui il 74,08% ± l'1,33% delle cellule erano vitali subito dopo la bioprinting. Dopo 1 settimana di incubazione, la vitalità degli astrociti è aumentata significativamente all'83,54% ± al 3,00%, indicando che il costrutto 3D rappresenta un microambiente adatto per la crescita cellulare. La composizione del biomateriale permetteva l'attaccamento cellulare e stimolava il comportamento astrocitico, con cellule che esprimevano lo specifico marcatore astrocitario della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e possedevano la tipica morfologia astrocitica. Questo protocollo riproducibile fornisce un metodo prezioso per biofabbricare tessuto neurale 3D ricco di astrociti che assomiglia al microambiente nativo delle cellule, utile ai ricercatori che mirano a comprendere la funzionalità degli astrociti e la loro relazione con i meccanismi coinvolti nelle malattie neurologiche.

Questo lavoro mirava a sviluppare un tessuto simile a quello neurale utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D per depositare strato per strato la gelatina primaria carica di astrociti / GelMA / fibrinogen bioink. Gli astrociti sono stati estratti e isolati dalla corteccia cerebrale dei cuccioli di topo (Figura 1), aggiunti a una composizione di biomateriale, consentendo la biofabbricazione di un costrutto 3D vivente.
Il computer-aided-design (CAD) è stato svil...

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3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Qui riportiamo un metodo di bioprinting 3D di astrociti corticali murini per biofabbricare tessuti neurali simili per studiare la funzionalità degli astrociti nel sistema nervoso centrale e i meccanismi che coinvolgono le cellule gliali nelle malattie e nei trattamenti neurologici.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Il bioprinting 3D degli astrociti rappresenta un progresso nell'ingegneria neuro tissutale, consentendo la biofabbricazione di modelli in vitro utili per comprendere i meccanismi coinvolti nelle malattie neurologiche. Il vantaggio principale del bioprinting 3D è quello di biofabbricare le strutture aggiuntive delle cellule che imitano le caratteristiche biochimiche e meccaniche dei tessuti, fornendo una migliore comprensione delle dinamiche cellulari in salute e malattia. Questo protocollo può essere applicato alla biofabbricazione di altri tessuti molli, in quanto si basa sulla bioprinting 3D di un bio-inchiostro composto da polimeri naturali e componenti della matrice extracellulare.Per cominciare, tagliare il tessuto corticale isolato dal topo eutanasizzato in piccoli pezzi con una micro forbice curva. Lavare i pezzi di tessuto tre volte con un millilitro di HBSS pipettando su e giù. Dopo aver rimosso HBSS aggiunto per la terza volta, aggiungere un millilitro di 0,05% di tripsina e incubare il tessuto per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Per la dissociazione meccanica del tessuto, pipettare delicatamente la miscela di tripsina tissutale su e giù 15 volte. Quindi, trasferire la miscela dissociata in un tubo conico da 15 millilitro e aggiungere un volume uguale di FBS per neutralizzare l'attività della tripsina. Filtrare la sospensione attraverso un filtro filtrante a celle da 0,4 micrometri per rimuovere i frammenti non dissociati.Lavare il filtro con un millilitro di mezzo astrocitario. Pellet lungo la sospensione cellulare filtrata mediante centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, sospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura degli astrociti.Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura T25. Costituisci un volume medio totale di 3,5 millilitri e incuba le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per ottenere il fibrinogeno alla concentrazione finale di tre milligrammi per millilitro, trasferire 0,9 millilitri di 10 milligrammi per millilitro soluzione di fibrinogeno alla soluzione di gelatina-gelatina metacrilolica.Per ottenere il fotoi iniziatore alla concentrazione finale dello 0,5% peso in volume, aggiungere 0,015 grammi di fotoi iniziatore alla soluzione di gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno preparata. Dopo il vortice, mantenere la soluzione a 40 gradi Celsius, al riparo dalla luce per evitare la degradazione del PI. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri in un tubo conico sterile da 15 millilitro.Trasferire 980 microlitri della soluzione di biomateriale in un tubo conico da 15 millilitri. Per ottenere la laminina alla concentrazione finale di due microgrammi per millilitro, aggiungere 20 microlitri di laminina diluita al tubo contenente bio-inchiostro. Mescolare delicatamente pipettando su e giù, evitando bolle e mantenere la soluzione di bio-inchiostro a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronta per essere miscelata con le cellule.Tripsinizzare gli astrociti primari con lo 0,05% di tripsina per 5 minuti e neutralizzare l'attività della tripsina con FPS in un rapporto di uno a uno. Quindi, trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitro e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti. Dopo aver contato le cellule, trasferire 1 volte 10 alle 6 celle in un tubo conico e una centrifuga diversi come dimostrato.Lasciare solo 200 microlitri del surnatante nel tubo e sospendere il pellet cellulare picchiettando delicatamente il fondo del tubo conico. Per ottenere una concentrazione finale di 1 volte 10 alle 6 cellule per millilitro, trasferire un millilitro di gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno soluzione al tubo contenente le cellule e omogeneizzare tubando delicatamente su e giù. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per trasferire lentamente gli astrociti deposti in gelatina-gelatina metacriloil fibrinogeno bio-inchiostro in una siringa di plastica da cinque millilitri, evitando la formazione di bolle.Collegare un ago smussato sterile calibro 22 alla siringa. Esporre la bioprinter alla luce UV per 15 minuti, quindi pulire la bioprinter con etanolo al 70%, quindi collegare la siringa alla testina di stampa della bioprinter e lavare manualmente il bio-inchiostro per rimuovere le bolle rimanenti. Per eseguire la bioprinting, posizionare una parabola di coltura di 35 millimetri sul tavolo della bioprinter, posizionare l'ago a 0,1 millimetri di distanza dalla superficie del piatto di coltura per consentire il movimento dell'ago e premere il pulsante Stampa.Una volta terminata la bioprinting, assicurarsi che la siringa si allontani dal piatto e si avvicini al piatto di coltura. Posizionare il piatto di coltura sotto la luce UV per la reticolazione della gelatina metacriloil. Utilizzare una spatola sterile per trasferire il costrutto biostampato su una piastra a 24 pozzetti.Aggiungere 500 microlitri di soluzione di cloruro di calcio trombina e lasciare per 30 minuti per consentire la reticolazione della fibrina. Dopo aver rimosso la soluzione reticolante, lavare il costrutto con due millilitri di PBS, quindi sostituire il PBS con un millilitro di terreno di coltura degli astrociti. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e cambiare il mezzo ogni tre giorni.Usa una spatola per trasferire il costrutto biostampato in un piatto di coltura da 35 millimetri. Lavare il costrutto con un millilitro di PBS. Depositare 100 microlitri del reagente morto vivo sul costrutto e tenerlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti, tenendolo al riparo dalla luce.Dopo aver rimosso il reagente morto vivo, lavare il costrutto con PBS come dimostrato. Trasferire il campione su un piatto confocale e osservare le cellule all'interno del costrutto al microscopio confocale utilizzando l'eccitazione di 488 e 570 nanometri per l'acquisizione dell'immagine. Dopo il bioprinting 3D, è stata stimata l'integrità dello scaffold bioprinted ed è stata osservata la formazione di una struttura ben definita con cellule intrappolate all'interno del biomateriale.Dopo i processi di bioprinting e cross-linking, la maggior parte delle cellule ha presentato una morfologia rotonda quando il costrutto è stato incubato con un mezzo astrocitario. Le impalcature biostampate hanno mantenuto l'integrità dopo sette giorni di incubazione e, sebbene siano state osservate alcune cellule rotonde, molti astrociti si sono diffusi in tutto il costrutto, presentando morfologia astrocitica e interconnessione. La vitalità cellulare è stata valutata subito dopo la bioprinting e i risultati hanno mostrato che alla velocità inferiore, le cellule vitali rappresentavano fino al 74% delle cellule totali, essendo significativamente più alte delle cellule biostampate a velocità più elevata.La vitalità degli astrociti bioprinted è stata normalizzata in astrociti in coltura 2D e i risultati hanno indicato che il settimo giorno, gli astrociti bioprinted avevano aumentato significativamente la vitalità. Subito dopo la bioprinting, gli astrociti hanno mostrato una morfologia rotonda e un test di morti vivi. Dopo una settimana, gli astrociti si diffusero in tutto il costrutto e presentarono una morfologia distinta di cellule, identica alla coltura 2D.Gli astrociti bioprinted 3D erano caratterizzati da immunofluorescenza. Dopo sette giorni di incubazione nel costrutto bioprinted, sono stati osservati astrociti altamente densi con una morfologia simile a una stella. Le cellule astrocitarie biostampate espresse lo specifico marcatore di astrociti la proteina acida fibrillare gliale indica il mantenimento del fenotipo astrocitico dopo sette giorni di bioprinting, e questi risultati indicano che la composizione del bio-inchiostro ha fornito un microambiente biocompatibile per promuovere l'adesione, la diffusione e la crescita degli astrociti.La valutazione di specifici geni e marcatori cellulari espressione da parte degli astrociti bioprinted fornirebbe evidenza della funzione neuro-tessuto-simile, come la reattività astrocitaria a seguito di stimoli specifici. Questo protocollo apre la strada alla biofabbricazione di strutture neuro-simili più complesse composte da diversi tipi di cellule in biomolecole, consentendo l'imitazione di specifiche nicchie neurogeniche.

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