Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
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この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP)、助成金番号2018/23039-3および2018/12605-8によって支えられました。国家科学技術開発評議会(CNPq)、助成金数465656/2014-5および309679/2018-4;高等教育人材の向上のための調整 (CAPES), 金融コード 001.

動物に関するすべての手順は、研究における動物の使用に関する国際的なガイドライン(http://www.iclas.org)に従い(http://www.iclas.org)、サンパウロ連邦大学研究倫理委員会(CEUA 2019/9292090519)によって承認されました。
1. マウスの脳解剖
<ol><li>冷たいハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の10 mLを100mm培養皿に、1 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します。動物1匹につき1本のマイクロチューブを?...

3Dバイオプリンティング技術は、脳23を含む天然組織22に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子<sup cla...

アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリオーシス3、4に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤5に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能6,7の変化をもたらす。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。
インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立されたが、このモデルは、ネイティブの細胞挙動を模倣し、脳の複雑さを再現する現実的な環境を提供することができない.2D条件では、機械的および生化学的支持が悪いこと、低細胞および細胞マトリックス相互作用、および基底-腹極性の欠如につながる細胞平坦化は、細胞のシグナル伝達ダイナミクスおよび細胞形態および遺伝子発現の変化をもたらす実験的結果に影響を及ぼし、治療10に対する応答性を損なう。したがって、より現実的な神経環境を提供する代替案を開発し、その結果をクリニックに翻訳することを目指することが重要です。
3次元(3D)細胞培養は、CNS11を含む器官および組織の忠実性の高い特徴を再現する、より高度なモデルを表す。グリア培養に関しては、3Dモデルは、アストロサイト形態、細胞基底-極性、および細胞シグナル伝達12,13の維持に寄与する。3Dバイオプリンティング技術は、細胞と生体材料を使用してネイティブ組織の構造と特性を再現することで、3D生体組織を制御された方法でバイオハブ化する強力なツールとして登場しました。この技術の使用は、結果予測の大幅な改善につながり、CNS14、15、16に適用される再生医療に貢献しています。
ここで説明するプロトコルは、皮質アストロサイトの分離と培養について詳述する。このプロトコルはまた、ラミニンを補充したゼラチン/ゼラチンメタクリロイル(GelMA)/フィブリノーゲンに埋め込まれたアストロサイトをバイオプリントする再現可能な方法を詳述する。本研究では、1 x106細胞/mLの密度で皮質アストロサイトを含む生体材料組成物を印刷するために、押出ベースのバイオプリンターを使用した。バイオプリンティングせん断応力は、印刷速度を制御することによって最小限に抑え、そして、アストロサイトは、プロセス後に高い生存率を示した。バイオプリント構築物を1週間培養し、アストロサイトはヒドロゲル内で広がり、付着し、生存し、星状形態を維持し、特異的マーカーグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(GFAP)4を発現することができた。
この手順は、ピストン駆動押出ベースのバイオプリンターと互換性があり、異なるソースから得られたバイオプリントアストロサイトに使用することができます。ここで提案される3Dバイオプリントモデルは、健康組織のアストロサイト機能に関与するメカニズムの研究や、神経学的病理の進行や治療開発の理解など、幅広い神経工学用途に適しています。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。

この研究は、3Dバイオプリンティング技術を用いて、層ごとの一次アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを堆積させる神経様組織の開発を目的とした。アストロサイトをマウスの子犬の大脳皮質(図1)から抽出して単離し、生体物質組成物に添加し、生きた3D構築物のバイオファブリケーションを可能にした。
コンピュー...

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3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。

ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

アストロサイトの3Dバイオプリンティングは、神経組織工学の進歩を表し、神経疾患に関与するメカニズムを理解するのに有用なインビトロモデルのバイオファブリケーションを可能にする。3Dバイオプリンティングの主な利点は、組織の生化学的および機械的特徴を模倣する細胞補助構造をバイオファブリケートし、健康と疾患における細胞ダイナミクスをよりよく理解することです。このプロトコルは、天然ポリマーと細胞外マトリックス成分で構成されるバイオインクの3Dバイオプリンティングに基づいているため、他の軟組織のバイオファブリケーションに適用できます。まず、安楽死させたマウスから分離した皮質組織を、湾曲したマイクロハサミで小片に切り取ります。上下にピペットを入れ、1ミリリットルのHBSSで組織片を3回洗います。3回目に添加したHBSSを取り除いた後、0.05%トリプシンの1ミリリットルを加え、37°Cで5分間組織をインキュベートします。機械的組織解離の場合、トリプシン混合物を15回上下に静かにピペットします。次に、解離した混合物を15ミリリットルの円錐管に移し、同量のFBSを加えてトリプシン活性を中和する。0.4マイクロメートルの細胞ストレーナーフィルターを通して懸濁液をフィルターし、解約されていない断片を除去します。フィルターを1ミリリットルのアストロサイト培地で洗います。遠心分離によって濾過された細胞懸濁液を下にペレット。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に懸濁させる。細胞懸濁液をT25培養フラスコに移す。3.5ミリリットルの総培地量を構成し、37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終濃度でフィブリノーゲンを得るために、ゼラチンゼラチンメタクリロイル溶液に1ミリリットルフィブリノーゲン溶液あたり10ミリグラムの0.9ミリリットルを移す。体積で0.5%重量の最終的な濃度で写真のイニシエーターを得るために、調製されたゼラチンゼラチンメタクリロイルフィブリノーゲン溶液に0.015グラムの写真のイニシエーターを加えます。ボルテックス後、溶液を40°Cに保ち、PIの劣化を防ぐために光から保護します。次に、0.2マイクロメートルのフィルターを通して溶液を無菌15ミリリットルの円錐管にフィルターします。生体材料溶液980マイクロリットルを15ミリリットルの円錐チューブに移します。1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度でラミニンを得るために、バイオインクを含むチューブに希釈ラミニンを20マイクロリットル加えます。上下にピペットを入れて穏やかに混ぜ、泡を避け、細胞と混合する準備ができるまでバイオインク溶液を摂氏37度に保ちます。0.05%トリプシンで1次アストロサイトを5分間トリプシンし、FPSでトリプシン活性を1対1の割合で中和する。その後、細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を200倍Gで5分間移動させる。細胞を数えた後、実演したように、6細胞に10回10回移して、異なる円錐形チューブと遠心分離機を作り出した。上清の200マイクロリットルのみをチューブに残し、円錐管の底部を軽くタップして細胞ペレットを吊り下げます。1ミリリットル当たり6細胞に10倍の最終濃度を得るために、ゼラチンゼラチン・メタクリロイル・フィブリノゲン溶液を細胞を含むチューブに1ミリリットル移動し、上下に軽くピペッティングして均質化する。1000マイクロリットルピペットを使用して、ゼラチンゼラチンメタクリロイルヒビロイジェンバイオインク溶液に置かれたアストロサイトを5ミリリットルのプラスチックシリンジにゆっくりと移し、泡形成を避けます。滅菌22ゲージの鈍い針を注射器に接続します。バイオプリンターを15分間UV光に当て、70%エタノールでバイオプリンターを拭き取り、シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動でフラッシュして残りの気泡を取り除きます。バイオプリンティングを行うために、バイオプリンターテーブルの上に35ミリメートルの培養皿に置き、針の動きを可能にするために培養皿表面から0.1ミリメートル離れた場所に針を置き、印刷ボタンを押します。バイオプリンティングが終わったら、シリンジが皿から離れ、文化の皿を閉じてください。ゼラチンメタクリロイル架橋用UV光の下に培養皿を置きます。滅菌スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを24ウェルプレートに移します。500マイクロリットルのトロンビン塩化カルシウム溶液を加え、30分間放置してフィブリン架橋を可能にします。架橋液を取り除いた後、2ミリリットルのPBSで構築物を洗浄し、次にPBSを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に置き換える。摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを35ミリメートル培養皿に移します。PBSの1ミリリットルで構造を洗います。100マイクロリットルの生きた死んだ試薬をコンストラクトの上に入れ、37°Cで30分間保ち、光から保護します。生死んだ試薬を取り除いた後、実演したようにPBSで構造を洗浄する。サンプルを共焦点皿に移し、画像取得のために488および570ナノメートルの励起を使用して共焦点顕微鏡の下で構築物内の細胞を観察する。3Dバイオプリンティングの後、バイオプリント足場の完全性が推定され、生体材料内に閉じ込められた細胞で明確に定義された構造の形成が観察された。バイオプリンティングと架橋プロセスの後、ほとんどの細胞は、構築物がアストロサイト培地でインキュベートされたときに丸い形態を提示した。バイオプリントされた足場は、7日間のインキュベーションの後に完全性を維持し、いくつかの丸い細胞が観察されたが、多くのアストロサイトが構造全体に広がり、天文学的形態および相互接続を提示した。細胞の生存率は、バイオプリンティング直後に評価され、結果的に、より低速で、生存可能な細胞は、全細胞の74%まで表され、より高速でバイオプリントされた細胞よりも有意に高いことを示した。バイオプリントアストロサイトの生存率は2D培養アストロサイトに正規化され、その結果、7日目にバイオプリントアストロサイトが有意に生存率を増加させたことが示された。バイオプリンティングの直後、アストロサイトは丸い形態と生死んだアッセイを示した。1週間後、アストロサイトは構築物全体に広がり、2D培養と同一の細胞の明確な形態を提示した。3Dバイオプリントアストロサイトは、免疫蛍光によって特徴付けられていた。バイオプリント構築物における7日間のインキュベーションの後、星状形態を有する非常に高密度のアストロサイトが観察された。バイオプリントアストロサイト細胞は、7日間のバイオプリンティング後の星状表現型の保持を示す特定のアストロサイトマーカーグリア線維酸性タンパク質を示し、これらの結果は、バイオインク組成物がアストロサイトの接着、広がりおよび成長を促進するために生体適合性微小環境を提供したことを示している。バイオプリントアストロサイトによる特異的遺伝子および細胞マーカー発現の評価は、特定の刺激に続くアストロサイトル反応性などの神経組織様機能の証拠を提供するであろう。このプロトコルは、生体分子内の異なるタイプの細胞で構成されるより複雑な神経様構造のバイオファブリケーションへの道を開き、特定の神経原性ニッチの模倣を可能にする。

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