Name: 3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP), 2018/23039-3 ve 2018/12605-8 hibe numaraları tarafından desteklendi; Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi (CNPq), 465656/2014-5 ve 309679/2018-4 hibe numaraları; ve Yükseköğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES), mali kod 001.

Hayvanları içeren tüm prosedürler araştırmalarda hayvan kullanımı için uluslararası yönergelere uydu (http://www.iclas.org) ve Universidade Federal de São Paulo Araştırma Etik Komitesi (CEUA 2019/ 9292090519) tarafından onaylandı.
1. Farelerin beyin diseksiyonu
<ol><li>10 mL soğuk Hanks Tamponlu Tuz Çözeltisini (HBSS) 100 mm kültür yemeğine ve 1 mL'yi 1,5 mL mikrotüpe aktarın. Hayvan başına bir mikrotüp hazırlayın. NOT: Hem kültür yemeğinin hem de mikrotüp...

3D biyobaskı teknolojisi, yapısal ve fizyolojik olarak doğal dokulara benzeyen rafine yapıların mühendisliğine izin veren bir biyofabrikasyon alternatifi olarak ortaya çıkmıştır22, beyindahil 23. Nöral benzeri dokuların biyofabrikasyonu, CNS11'ietkileyen birçok hastalığın gelişimi ve tedavisi ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir araç olan in vitro yerel mikroçevre modellemesine i...

Astrositler Merkezi Sinir Sistemi'ndeki (CNS) en bol hücre tipidir ve beyin homeostazında önemli bir rol oynar. Kalıcı nöronal desteğe ek olarak, astrositler nörotransmitter alımını modüle etmekten, kan-beyin bariyer bütünlüğünü korumaktan ve nöronal sinaptogenez1,2'yi düzenlemekten sorumludur. Astrositler ayrıca CNS iltihabında önemli bir role sahiptir, astrosit reaktivitesine veya reaktif astrogliosis3,4, dejeneratif ajanlara sağlıklı doku ekspozisyonlarını önleyen bir glial skar oluşturan bir süreçte beyindeki yaralanmalara yanıt verir5. Bu olay astrositlerin gen ekspresyonunda, morfolojisinde ve fonksiyon 6 ,7 'dedeğişikliklerlesonuçlanır. Bu nedenle, astrositlerin işlevselliğini içeren çalışmalar, nörolojik bozuklukları tedavi etmek için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.
İn vitro modeller nörolojik yaralanmalarla ilgili mekanizmaları incelemek için çok önemlidir ve başarılı izolasyon ve kortikal astrositlerin iki boyutlu (2D) kültürü oluşturulmuş olmasına rağmen8, bu model yerel hücre davranışını taklit eden gerçekçi bir ortam sağlayamaz ve beynin karmaşıklığını yeniden üretememektedir9 . 2D durumda, zayıf mekanik ve biyokimyasal destek, düşük hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ve bazal-apikal polaritenin yokluğuna yol açan hücre düzleştirme, hücre sinyal dinamiklerini ve tedavilere yanıtı tehlikeye atan değiştirilmiş hücre morfolojisi ve gen ekspresyona yol açan deneysel sonuçları etkiler10. Bu nedenle, sonuçları kliniğe çevirmeyi amaçlayan daha gerçekçi bir sinir ortamı sağlayan alternatifler geliştirmek çok önemlidir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, CNS11de dahil olmak üzere organların ve dokuların artan sadakat özellikleriyle yeniden özetleyen daha gelişmiş bir modeli temsil eder. Glial kültür ile ilgili olarak, 3D modeller astrosit morfolojisinin, hücre bazal-apikal polaritesinin ve hücre sinyalinin korunmasına katkıda bulunur12,13. 3D biyobaskı teknolojisi, yerel dokuların yapısını ve özelliklerini yeniden oluşturmak için hücreler ve biyomalzemeler kullanarak 3D canlı dokuları kontrollü bir şekilde biyofabrik hale getirmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknolojinin kullanımı sonuç tahmininin önemli ölçüde iyileşmesine yol açmış ve CNS14 , 15,16'ya uygulanan rejeneratif tıbba katkıdabulunmuştur.
Burada açıklanan protokol kortikal astrositlerin izolasyonu ve kültürünü detaylandırıyor. Protokol ayrıca, laminin ile desteklenmiş jelatin / jelatin methacryloyl (GelMA) / fibrinojene gömülü biyobaskı astrositleri için tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırıyor. Bu çalışmada kortikal astrositler içeren biyomalzeme bileşimi 1 x 106 hücre/mL yoğunlukta yazdırmak için ekstrüzyon bazlı bir biyobaskı kullanılmıştır. Baskı hızı kontrol altına alarak biyobaskı kesme stresi en aza indirilmiş ve astrositler işlemden sonra yüksek canlılık göstermiştir. Biyobaskılı yapılar 1 hafta boyunca kültürlendi ve astrositler hidrojel içinde yayılabildi, bağlanabildi ve hayatta kalabildi, astrositik morfolojiyi korudu ve belirli bir belirteç glial fibrili asidik proteini (GFAP)ifade etti 4.
Bu prosedür piston tahrikli ekstrüzyon bazlı biyobaskılarla uyumludur ve farklı kaynaklardan elde edilen biyobaskı astrositleri için kullanılabilir. Burada önerilen 3D biyobaskı modeli, sağlıklı dokularda astrosit işlevselliğinde yer alan mekanizmaların çalışmaları ve nörolojik patolojilerin ilerlemesini ve tedavi gelişimini anlamak gibi çok çeşitli sinir mühendisliği uygulamaları için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Bioprinter</td>
			<td>3D Biotechnology Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Extrusion-based bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-tip forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>6--30</td>
			<td>Forceps for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Protease free, fatty acid free, essentially globulin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156340</td>
			<td>Culture flask T25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651, 339652</td>
			<td>Sterile tubes of 15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224589</td>
			<td>DAPI staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyalisis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9527</td>
			<td>Molecular weight cut-off = 14 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-15-5</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>12657011</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9001-32-5</td>
			<td>Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td>Gelatin powder from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td>Glycine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>14175095</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live dead kit cell imaging kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>760-93-0</td>
			<td>For GelMA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Microtubes of 1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 22G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1362045</td>
			<td>Sterile blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissor</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>05--02</td>
			<td>Sharp scissor for brain dissection previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Paraformaldehyde powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430591, 430588</td>
			<td>Sterile petri dishes of 35 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>iFluor 488 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106797-53-9</td>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antobody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td>Chicken polyclonal to GFAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td>Alexa fluor 594 anti-chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>V973-70</td>
			<td>Number 24 cement spatula previously sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>3000038</td>
			<td>Microscope for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>1222C84</td>
			<td>Sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-105</td>
			<td>Polypropylene filter for sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002--04-4</td>
			<td>Thrombin cristalline powder from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>15040066</td>
			<td>Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td>Sterile 24-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d bioprinting of murine cortical astrocytes for engineering neural-like tissue

Astrositler, nöronal destek ve işlevsellik de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminde (CNS) önemli bir role sahip glial hücrelerdir. Bu hücreler ayrıca sinirsel yaralanmalara yanıt verir ve dokuyu dejeneratif olaylardan korumak için hareket eder. Astrositlerin işlevselliğinin in vitro çalışmaları, bu tür olaylarda yer alan mekanizmaları aydınlatmak ve nörolojik bozuklukları tedavi etmek için tedaviler geliştirmeye katkıda bulunmak için önemlidir. Bu protokol, astrositler bakımından zengin sinir benzeri bir doku yapısını 3D biyobaskı astrosit yüklü biyoink ile biyofabrik hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada ekstrüzyon bazlı bir 3D biyobaskı kullanıldı ve C57Bl/6 fare yavrularının beyin kortikallerinden astrositler çıkarıldı. Biyoink, kortikal astrositlerin 3. 3D biyobaskı koşulları hücre stresini en aza indirerek, hücrelerin% 74.08'inin ±% 1.33'ünün biyobaskıdan hemen sonra uygulanabilir olduğu işlem sırasında astrositlerin yüksek canlılığına katkıda bulundu. 1 haftalık inkübasyondan sonra, astrositlerin canlılığı önemli ölçüde% 83.54'e ±% 3.00'e yükseldi ve bu da 3D yapının hücre büyümesi için uygun bir mikroçevrasyonu temsil ettiğini gösteriyor. Biyomalzeme bileşimi hücre bağlanmasına izin verdi ve astrositik davranışı uyardı, hücreler spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini (GFAP) ifade etti ve tipik astrositik morfolojiye sahip oldu. Bu tekrarlanabilir protokol, hücrelerin yerel mikroçevresine benzeyen astrositler bakımından zengin 3D sinir benzeri dokuyu biyofabrilleştirmek için değerli bir yöntem sağlar, astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalıklarda yer alan mekanizmalarla ilişkilerini anlamayı amaçlayan araştırmacılar için yararlıdır.

Bu çalışma, katman katman primer astrositler yüklü jelatin /GelMA/fibrinojen biyoink biriktirmek için 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak sinir benzeri bir doku geliştirmeyi amaçlamaktadır. Astrositler, canlı bir 3D yapının biyofabrikasyonuna izin vererek biyomalzeme bileşimine eklenen fare yavrularının serebral korteksinden çıkarıldı ve izole edildi .
Bilgisayar destekli tasarım (CAD), besin maddelerinin ve oksijenin difüzyonunu kolaylaşt...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue at JoVE.com

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Burada, merkezi sinir sistemindeki astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalık ve tedavilerde glial hücreleri içeren mekanizmaları incelemek için nöral benzeri dokuların biyofabrik olarak tanımlanması için 3D biyobaskı murine kortikal astrositlerin bir yöntemini rapor ediyoruz.

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Astrositlerin 3D biyobaskı, nörolojik hastalıkta yer alan mekanizmaları anlamak için yararlı olan in vitro modellerin biyofabrikasyonuna izin veren nöro doku mühendisliğinde bir ilerlemeyi temsil eder. 3D biyobaskılamanın temel avantajı, dokuların biyokimyasal ve mekanik özelliklerini taklit eden hücre yardımcı yapılarını biyofabrik haline getirmek, sağlık ve hastalıkta hücre dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamaktır. Bu protokol, doğal polimerler ve hücre dışı matris bileşenlerinden oluşan bir biyo-mürekkecin 3D biyobaskısına dayandığı için diğer yumuşak dokuların biyofabrikasyonuna uygulanabilir.Başlangıç olarak, ötenazili fareden izole edilmiş kortikal dokuyu kavisli bir mikro makasla küçük parçalara bölün. Doku parçalarını yukarı ve aşağı pipetleme ile bir mililitre HBSS ile üç kez yıkayın. Üçüncü kez eklenen HBSS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin ve dokuyu 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya bırakın.Mekanik doku ayrışması için, doku tripsin karışımını 15 kez hafifçe pipetleyin. Daha sonra, ayrışmış karışımı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tripsin aktivitesini nötralize etmek için eşit miktarda FBS ekleyin. Ayrışmayan parçaları çıkarmak için süspansiyonu 0,4 mikrometre hücre süzgeç filtresinden geçirin.Filtreyi bir mililitre astrosit ortamıyla yıkayın. Pelet, santrifüjleme ile filtrelenmiş hücre süspansiyonunu indirdi. Süpernatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre astrosit kültür ortamında askıya alın.Hücre süspansiyonu bir T25 kültür şişesine aktarın. Toplam 3,5 mililitrelik orta hacmi oluşturan ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırarak. Mililitre başına üç miligramlık son konsantrasyonda fibrinojen elde etmek için, mililitre fibrinojen çözeltisi başına 10 miligramın 0,9 mililitresini jelatin-jelatin methacryloyl çözeltisine aktarın.Fotoğraf başlatıcıyı hacme göre% 0,5 ağırlıkta son konsantrasyonda elde etmek için, hazırlanan jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisine 0,015 gram fotoğraf başlatıcısı ekleyin. Girdaplamadan sonra, PI bozulmasını önlemek için çözeltiyi ışıktan korunarak 40 santigrat derecede tutun. Daha sonra, çözeltiyi 0,2 mikrometre filtreden steril 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin.Biyomalzeme çözeltisinin 980 mikrolitresini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mililitre başına iki mikrogramın son konsantrasyonunda laminin elde etmek için, biyo-mürekkep içeren tüpe 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcıklardan kaçınarak hafifçe karıştırın ve biyo-mürekkep çözeltisini hücrelerle karışmaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede tutun.Birincil astrositleri 5 dakika boyunca %0,05 trypsin ile deneyin ve FPS ile tripsin aktivitesini bire bir oranında nötralize edin. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de 15 mililitrelik konik tüpe ve santrifüje aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, 1 kez 10'u 6 hücreye, gösterildiği gibi farklı bir konik tüpe ve santrifüje aktarın.Tüpte sadece 200 mikrolitre süpernatan bırakın ve konik tüpün altına hafifçe dokunarak hücre peletini askıya alın. Mililitre başına 6 hücreye 1 kez 10'luk son bir konsantrasyon elde etmek için, bir mililitre jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisini hücreleri içeren tüpe aktarın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen biyo-mürekkep çözeltisine yerleştirilmiş astrositleri yavaşça beş mililitre plastik şırıngaya aktarmak için 1000 mikrolitre pipet kullanın, kabarcık oluşumunu önler.Steril 22 kalibrelik künt iğneyi şırıngaya bağlayın. Biyobaskıyı 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve ardından biyobaskıyı% 70 etanol ile silin, ardından şırınnayı biyobaskı baskı kafasına bağlayın ve kalan kabarcıkları çıkarmak için biyo mürekkeyi manuel olarak yıkayın. Biyobaskı yapmak için, biyobaskı masasına 35 milimetre kültür çanağına yerleştirin, iğnenin hareket etmesine izin vermek için iğneyi kültür çanağı yüzeyinden 0,1 milimetre uzağa yerleştirin ve Yazdır düğmesine basın.Biyobaskı bittikten sonra şırınnanın yemekten ve yakın kültür çanağından uzaklaştığından emin olun. Jelatin methacryloyl çapraz bağlama için kültür çanağı UV ışığı altına yerleştirin. Biyobaskı yapıyı 24 kuyu plakasına aktarmak için steril bir spatula kullanın.500 mikrolitre trombin kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve fibrin çapraz bağlanmasına izin vermek için 30 dakika bekletin. Çapraz bağlama çözeltisini çıkardıktan sonra, yapıyı iki mililitre PBS ile yıkayın, ardından PBS'yi bir mililitre astrosit kültür ortamıyla değiştirin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın ve ortamı her üç günde bir değiştirin.Biyobaskı yapıyı 35 milimetrelik bir kültür çanağına aktarmak için bir spatula kullanın. Yapıyı bir mililitre PBS ile yıkayın. Canlı ölü reaktifin 100 mikrolitresini yapının üzerine yatırın ve ışıktan korunarak 37 santigrat derecede 30 dakika tutun.Canlı ölü reaktifi çıkardıktan sonra, yapıyı gösterildiği gibi PBS ile yıkayın. Örneği bir konfokal çanağa aktarın ve görüntü elde etmek için 488 ve 570 nanometre uyarım kullanarak konfokal mikroskop altında yapı içindeki hücreleri gözlemleyin. 3D biyobaskıdan sonra, biyobaskılı iskelenin bütünlüğü tahmin edildi ve biyomalzeme içinde yer alan hücrelerle iyi tanımlanmış bir yapının oluşumu gözlendi.Biyobaskı ve çapraz bağlama işlemlerinden sonra, yapı bir astrosit ortamı ile inkübe edildiğinde çoğu hücre yuvarlak morfoloji sundu. Biyobaskılı iskeleler yedi günlük inkübasyondan sonra bütünlüğünü korudu ve bazı yuvarlak hücreler gözlenmesine rağmen, birçok astrosit yapı boyunca yayıldı ve astrositik morfoloji ve ara bağlantı sundu. Hücre canlılığı biyobaskıdan hemen sonra değerlendirildi ve sonuçlar, daha düşük hızda, canlı hücrelerin toplam hücrelerin% 74'üne kadar temsil ettiğini ve daha yüksek hızda biyobaskıda olan hücrelerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi.Biyobaskılı astrositlerin uygulanabilirliği 2D kültürlü astrositlere normalleştirildi ve sonuçlar yedinci günde biyobaskı astrositlerinin canlılığını önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Biyobaskıdan hemen sonra, astrositler yuvarlak morfoloji gösterdi ve ölü testlerle yaşadılar. Bir hafta sonra, astrositler yapıya yayıldı ve 2D kültürüne benzer farklı bir hücre morfolojisi sundu.3D biyobaskı astrositleri immünoforeziksiyon ile karakterize edildi. Biyobaskı yapısında yedi günlük inkübasyondan sonra, yıldız benzeri morfolojiye sahip oldukça yoğun astrositler gözlendi. Biyobaskılı astrosit hücreleri, yedi günlük biyobaskıdan sonra astrosit fenotipinin korunmasını gösteren spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini ifade etti ve bu sonuçlar biyo-mürekkep bileşiminin astrositlerin yapışıklığını, yayılmasını ve büyümesini teşvik etmek için biyouyumlu bir mikroçevre sağladığını göstermektedir.Biyobaskılı astrositler tarafından belirli genlerin ve hücre belirteçlerinin ekspresyonunun değerlendirilmesi, belirli uyaranları takip eden astrositary reaktivitesi gibi nöro doku benzeri fonksiyonun kanıtını sağlayacaktır. Bu protokol, biyomoleküllerdeki farklı hücre türlerinden oluşan daha karmaşık nöro benzeri yapıların biyofabrikasyonuna zemin hazırlayarak belirli nörojenik nişlerin taklitini sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Jelatin Metacryloyl Hidrojel Bazlı Bioinks 3D Biyobaskı Protokolleri

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...