Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør af Atomic Force Microscope-UT Core facilitet ved University of Texas Health Sciences Center, for den bidrog ekspertise i AFM i dette projekt. Vi takker også finansieringskilderne fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).

1. Hydrogel forberedelse
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i en cellekulturhætte, der er desinficeret med ethanol og ultraviolet (UV)steriliseret før brug for at opretholde steriliteten. Værktøj, såsom pincet og pipetter, skal sprøjtes med ethanol. Bufferopløsninger skal også sterilfiltrere.
<ol><li>Fremstilling af aminosilanebelagte glasovertræk<ol>
<li>Placer det ønskede antal glasovertræk på et stykke laboratoriestørring. BEMÆRK: Forbered yderligere 3-4 coverlips for at si...

Målet med den nuværende undersøgelse er at skabe et effektivt in vitro-system til bedre at forstå virkningen af mekaniske signaler i NCC'er. Ud over at følge den trin-for-trin protokol, der er nævnt ovenfor, forskere nødt til at huske på, at cellekulturen af O9-1 NCCs er påvirket af den type glas coverslips bruges til at forberede hydrogels. For eksempel blev det bemærket, at celler seedet på en bestemt type glas coverlip (se tabellen over materialer)overlevede og spredte sig godt, me...

Neurale crest celler (NCCs) er en gruppe af stamceller under hvirveldyr embryogenese med en bemærkelsesværdig evne til at migrere og bidrage til udviklingen af forskellige organer og væv. NCC'er kan differentiere sig til forskellige celletyper, herunder sensoriske neuroner, brusk, knogle, melanocytter og glatte muskelceller, afhængigt af placeringen af aksial oprindelse og den lokale miljøvejledning af NCC1,2. Med evnen til at differentiere sig til en bred vifte af celletyper kan genetiske abnormiteter, der forårsager dysregulering på ethvert stadium af neural crest (NC) udvikling, føre til mange medfødte sygdomme2. For eksempel fører forstyrrelser under dannelsen, migrationen og udviklingen af NCC'er til udviklingsforstyrrelser kendt kollektivt som neurocristopathies1,3. Disse sygdomme spænder fra kraniofaciale defekter på grund af svigt i NCC dannelse, såsom Treacher Collins syndrom, til udvikling af forskellige kræftformer på grund af NCC metastatisk migrationsevne, som det ses i melanom3,4,5,6. I løbet af de sidste par årtier har forskere gjort bemærkelsesværdige opdagelser om ncc'ernes roller og mekanismer i udvikling og sygdomme, hvor de fleste resultater er fokuseret på kemiske signaler7,8. For nylig er mekaniske signaler blevet angivet til at spille en kritisk, men dårligt forstået rolle i NCC udvikling9,10.
De miljømæssige signaler fra de nationale konkurrencemyndigheder spiller en afgørende rolle under deres udvikling, herunder regulering af NCC-differentiering i forskellige celletyper. Miljømæssige signaler, f.eks. fysiske signaler, indflydelse på afgørende adfærd og cellulære reaktioner, såsom funktionel diversificering. Mechanotransduction gør det muligt for celler at fornemme og reagere på disse signaler for at opretholde forskellige biologiske processer2. NCCs er omgivet af tilstødende celler og forskellige substrater, såsom den ekstracellulære matrix (ECM), som kan give anledning til mekaniske stimuli til at opretholde homøostase og tilpasse sig ændringerne gennem skæbnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mechanotransduktion begynder ved plasmamembranen, hvor den sensoriske komponent af mekaniske ekstracellulære stimuli opstår, hvilket resulterer i intracellulær regulering af cellen12. Integrins, fokale vedhæftninger og knudepunkter af plasmamembranen videresender mekaniske signaler, såsom forskydningskræfter, stress og stivheden af de omgivende substrater, i kemiske signaler til fremstilling af cellulære reaktioner12. Videresendelse af kemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære regulering udføres via forskellige signalveje for at færdiggøre vitale processer for organismen, såsom differentiering.
Flere undersøgelser har antydet, at mekanisk signalering fra substrat stivhed spiller en rolle i celledifferentiering13,14. For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at mesenkymale stamceller (MSC'er) dyrket på bløde substrater med en stivhed svarende til hjernevæv (i intervallet 0,1-1,0 kPa) resulterede i neuronal celledifferentiering15,16. Men flere MSC'er differentiere sig i myocyt-lignende celler, når de dyrkes på 8-17 kPa substrater efterligne stivhed af muskler, mens osteoblast-lignende differentiering blev observeret, når MSC'er blev dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen af mechanotransduktion fremhæves af uregelmæssigheder og abnormiteter i den mekaniske signalvej, der potentielt fører til alvorlige udviklingsdefekter og sygdomme, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme og osteoporose17,18,19. I kræftformer, normalt brystvæv er blødt, og risikoen for brystkræft stiger i stiv og tæt brystvæv, et miljø, der er mere beslægtet med brysttumorer15. Med denne viden kan virkningerne af mekanisk signalering på NCC-udvikling studeres gennem simpel manipulation af substratstivhed gennem et in vitro-system, hvilket giver yderligere fordele og muligheder for at forstå de grundlæggende elementer i NC-relateret sygdomsprogression og ætiologi.
For at studere virkningen af mekaniske signaler i NCCs etablerede vi et effektivt in vitro-system til NCCs baseret på optimering af tidligere offentliggjorte metoder og evaluering af NCCs svar på forskellige mekaniske signaler20,21. Der blev fastsat en detaljeret protokol til varierende hydrogelstivhedsforberedelse og evaluering af virkningen af mekanisk signalering i ncc'er. For at opnå dette, O9-1 NCCs anvendes som NC model til at studere effekter og ændringer som reaktion på stive versus bløde hydrogels. O9-1 NCCs er en stabil NC cellelinje isoleret fra musefoster (E) på dag 8.5. O9-1 NCCs efterligner NCCs in vivo, fordi de kan differentiere sig til forskellige NC-afledte celletyper i defineret differentieringsmedie22. For at studere den mekaniske signalering af NCC'er blev et matrixsubstrat fremstillet med tunabel elasticitet fra varierende koncentrationer af acrylamid- og bis-acrylamidopløsninger for at opnå den ønskede stivhed, der korrelerede med den biologiske substratstivhed20,21,23. For at optimere betingelserne for matrixsubstrat til NCC'er, specielt O9-1-celler, blev der foretaget ændringer fra den tidligere offentliggjorte protokol20. En ændring foretaget i denne protokol var at inkubere hydrogeler i kollagen I, fortyndet i 0,2% eddikesyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C natten over. Den lave pH af eddikesyre fører til en homogen fordeling og højere kollagen I inkorporering, hvilket giver mulighed for en mere ensartet fastgørelse af ECM protein24. Derudover blev der anvendt en kombination af hesteserum og fosterkvægserum (FBS) i koncentrationerne på henholdsvis 10 % og 5 % i fosfatbuffersalin (PBS), inden hydrogelerne blev opbevaret i inkubatoren. Hesteserum blev brugt som et ekstra supplement til FBS på grund af dets evne til at fremme cellespredning og differentiering i koncentration af 10%25.
Med denne metode blev et biologisk miljø efterlignet af ECM-proteinbelægningen (f.eks. Kollagen I) for at skabe et nøjagtigt in vitro-miljø, så NCCs kunne vokse og overleve20,21. Stivheden af de forberedte hydrogeler blev kvantitativt analyseret via atomprøvesprængningsmikroskopi (AFM), en velkendt teknik til at skildre den elastiske modulus26. For at studere effekten af forskellige stivhedsniveauer på NCCs blev de vilde O9-1-celler kultiveret og forberedt på hydrogeler til immunfluorescence (IF) farvning mod filamentøs actin (F-actin) for at vise forskellene i celle vedhæftning og morfologier som reaktion på ændringer i substratstivhed. Ved hjælp af dette in vitro-system vil forskere være i stand til at studere rollerne af mekanisk signalering i NCCs og dets interaktion med andre kemiske signaler for at få en dybere forståelse af forholdet mellem NCCs og mekanisk signalering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Neurale crest celler (NCCs) er hvirveldyr embryonale multipotent celler, der kan migrere og differentiere sig til en bred vifte af celletyper, der giver anledning til forskellige organer og væv. Vævsstivhed producerer mekanisk kraft, en fysisk cue, der spiller en afgørende rolle i NCC differentiering; Mekanismen er dog fortsat uklar. Den metode, der er beskrevet her, giver detaljerede oplysninger til den optimerede generering af polyacrylamidhydrogeler af varierende stivhed, nøjagtig måling af en sådan stivhed og evaluering af virkningen af mekaniske signaler i O9-1-celler, en NCC-linje, der efterligner in vivo NCCs.
Hydrogel stivhed blev målt ved hjælp af atomprøvesprængningsmikroskopi (AFM) og indikerede forskellige stivhedsniveauer i overensstemmelse hermed. O9-1 NCCs kultiveret på hydrogeler af varierende stivhed viste forskellige cellemorfologi og genekspression af stressfibre, hvilket indikerede varierende biologiske virkninger forårsaget af mekaniske signalændringer. Desuden fastslog dette, at varierende hydrogel stivhed resulterede i et effektivt in vitro-system til at manipulere mekanisk signalering ved at ændre gel stivhed og analysere molekylær og genetisk regulering i NCCs. O9-1 NCCs kan differentiere sig til en bred vifte af celletyper under indflydelse af de tilsvarende differentiering medier, og det er praktisk at manipulere kemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-system et kraftfuldt værktøj til at studere den rolle, som mekanisk signalering i NCCs og dets interaktion med kemiske signaler, som vil hjælpe forskerne med bedre at forstå de molekylære og genetiske mekanismer i neural crest udvikling og sygdomme.

Hydrogel forberedelse og stivhed vurdering gennem AFM og Hertz model Her er en detaljeret protokol til at generere polyacrylamid hydrogels af varierende stivhed ved at regulere forholdet mellem acrylamid og bis-acrylamid. Polyacrylamidhydrogelerne er dog ikke klar til vedhæftning af celler på grund af manglen på ECM-proteiner. Sulfo-SANPAH, der fungerer som linker, binder sig således kovalent til hydrogelerne og reagerer med de primære aminer af ECM-proteiner for at gøre det muligt at vedhæfte ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Detaljerede trin-for-trin protokoller er beskrevet her for at studere mekaniske signaler in vitro ved hjælp af multipotent O9-1 neurale crest celler og polyacrylamid hydrogels af varierende stivhed.

Et optimeret O9-1/Hydrogel-system til undersøgelse af mekaniske signaler i neurale crestceller

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Metoden hjælper i undersøgelsen af den mekaniske signalering af neurale crest celler og dens interaktion med kemiske signaler. Det kan også støtte i de molekylære og genetiske mekanismer i neural crest udvikling i sygdomme. Overfør glasdækslet glider er den mest udfordrende derfor overføre dem langsomt og opmærksomt for at forhindre at bryde og slippe dem.Demonstrere proceduren vil være mig og Dr.Sherry Zhao, en postdoc fyr fra mit laboratorium. Begynd med at placere det ønskede antal glasdæksel glider på et stykke laboratoriestørring. Derefter sterilisere hvert dæksel slip ved at sende det frem og tilbage gennem flammen af alkoholbrænderen.Når dækslet glider køle ned, dække 12 millimeter dækning slip med ca 200 mikroliter og 25 millimeter dækning slip med 800 mikroliter af 0,1 molar natriumhydroxid. Efter fem minutter, aspirere natriumhydroxid og lad dækslet glider til lufttørre i fem minutter for at danne en jævn film. Når dækslet glider er tørret, tilsæt ca. 18 mikroliter af aminopropyl triethoxysilane eller APTS på en 12 millimeter dæksel slip og 150 mikroliter af APTS på en 25 millimeter dækning slip.Aspirate adgang APTS at tillade de resterende APTS at tørre i fem minutter. Senere skylles dækslet glider tre gange ved at nedsænke dem i sterilt deioniseret vand i fem minutter hver gang. Flyt det vaskede dæksel glider til en frisk Petriskål med den reaktive side med forsiden nedad.Og behandle dækslet glider ved at iblødsætning i nok 0,5% glutaraldehyd i 30 minutter. Efter at have indsugning af glutaraldehyd, skyl dækslet glider en gang med deioniseret vand i tre minutter og lufttørre dækslet glider med den reaktive side op. For at forberede silikone dække glider, placere det lige antal dæk glider som at aminosilane belagt dække glider i en Petri parabol foret med para film.Derefter behandles 12 millimeter dæksel glider med 40 mikroliters og 25 millimeter dækning glider med 150 mikroliter dichloromethan silan eller DCMS i fem minutter. Vask dækslet glider med sterilt deioniseret vand en gang i et minut, før du placerer reaktive dæksler med billedsiden op på en laboratoriestørk. For at forberede hydrogels, pipette frisklavet acrylamid gel opløsning på de tørrede aminosilane belagt dække glider.Ved hjælp af buede pincet overføres den DCMS-behandlede dækselsglidning oven på gelopløsningen, hvor den behandlede side rører gelopløsningen, hvorved gelopløsningen ændres mellem to dæksler. Når gelen er polymeriseret, adskille DCMS behandlet dække slip med buede pincet, forlader gel knyttet til aminosilane belagt dække slip. Dernæst nedsænke 12 millimeter dæksel slip med den vedhæftede hydrogel i en forudbestemt 4-brønd eller 24-brønd plade dækket med 500 mikroliter steril PBS eller deioniseret vand og 25 millimeter dækning slip i en 6-brønds plade dækket med to milliliter steril PBS eller deioniseret vand i 30 minutter.Når du har fjernet overskydende acrylamidopløsning, opbevares hydrogelerne i steril PBS eller deioniseret vand ved stuetemperatur i 30 minutter. Senere, aspirere PBS eller deioniseret vand fra brønden plade, før du tilføjer Sulfo-succinimydyl eller Sulfo-SUNPAH løsning til at dække gelen helt. Og læg gelerne med opløsningen under et 15 watt, 365 nanometer ultraviolet lys afdækket i 10 minutter.Saml så meget af Sulfo-SANPAH pr. opløsning som muligt ved at vippe pladen. Og vask gelen to til tre gange med 15 millimolar HEPES. Tilsæt 15 milligram per milliliter Kollagen 1 fortyndet i 0,2% eddikesyre til hver brønd, der indeholder hydrogel.Og inkubere gelerne natten over ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste dag skal du udføre vasken som beskrevet i manuskriptet, før du inkuberer hydrogelerne med PBS indeholdende 10% hesteserum og 5% FBS ved 37 Celsius og 5% kuldioxid. Efter to timers inkubation tilsættes 500 mikroliter sterilt filtreret DMEM med 10% FBS og 1% penicillin streptomycin til hver brønd og opbevar gelerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Når cellekulturen er klar, plade ca 1,5 gange 10 til den fjerde 09-1 celler pr centimeter kvadreret i bazell medium. Brug pincet til at transportere dækslet glider til en ny plade for at minimere falske signaler fra cellerne dyrkes direkte på pladen. Derefter rettes cellerne ved hjælp af 500 mikroliter på 4% paraformaldehyd i 10 minutter, før du behandler cellerne med 500 mikroliter på 0,1% Triton X-100 ved stuetemperatur.Efter 15 minutter skal du gå cellerne med 250 mikroliter af 10% æselserumum. Plet cellerne til F-actin med felodipin ved fortynding af 1 til 400 i 250 mikroliter af 10% æselserumum, efterfulgt af inkubation med DAPI i 10 minutter. Vask cellerne med PBS i to minutter, før du tilføjer tre til fire dråber montering medium til hver brønd.På et fluorescensmikroskop skal du tage billeder af mindst tre tilfældige rammer pr. hydrogelprøve, der producerer individuelle og fusionerede kanaler. I stivhedsvurderingen af hydrogelen gennem atomprøvesprængningsmikroskopi eller AFM var kraftkurvens hældning skånsom for bløde hydrogeler, da den nødvendige kraft fra AFM-sonden var mindre. Men på stive hydrogels var den genererede skråning meget stejlere.AFM-målingerne blev derefter brugt til at beregne den gennemsnitlige stivhed af hydrogels fra Youngs elastiske modulus i kilopascals. Vækstegenskaberne for P19- og 09-1-celler blev observeret i en kilopascal og 40 kilopascals hydrogels af kontrol og modificerede gelsystemer. De 09-1 celler, der dyrkes på de oprindelige gelsystemer, resulterede i et højere antal døde celler.I modsætning hertil udviste de 09-1 celler, der blev dyrket på de modificerede gelsystemer, en sund cellevækst og tilstrækkelig tilknytning til hydrogelsubstratet med lidt celledæk angivet med minimale runde celler. P19-cellerne, der var belagt på begge hydrogelsystemer, viste et overskud af runde flydende celler og mangel på cellesubstrat vedhæftede filer. Kompatibiliteten af neurale crest celler eller NCCs med den modificerede hydrogel system blev vurderet af immunofluorescent farvning til AP-2.Der blev observeret en signifikant stigning i AP-2-ekspressionen i 09-1-celler, der er belagt på det modificerede hydrogelsystem. Derudover udstillede 09-1-cellerne forskellige morfologier baseret på lav eller høj stivhed hydrogels gennem varierende mængder af stressfibrene. Anti-vinculin udtrykket i 09-1 celler dyrket på 40 kilopascals hydrogel var højere end dem, der dyrkes på den ene kilopascal hydrogel afspejler, at cellerne dyrket på blødere substrater danner minimale fokal tilføjelse komplekser end den stive substrat.Passende ventetid er afgørende for polymeriseringen af hydrogelerne, da acrylamider er giftige for cellerne. Dyk hydrogelerne ned i PBS eller deioniseret vand i mindst 30 minutter for at sikre bedre resultater.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar i kyllingembryoner ved hjælp af ChickGFP Neural Tube Poding og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiseret tilgang til multispecies Rensning af mammale mannlige germeller ved hjælp af mekanisk vævsdissociation og flowcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolleret kortikal indvirkning model af mus hjerneskade med terapeutisk transplantation af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neurale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissektion, kultur og analyse af primær kranie neurale crest celler fra mus til studiet af Neural Crest celle delaminering og migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolation, Kultur og adipogen induktion af neuralcrest original fedt-afledte stamceller fra periaortisk fedtvæv

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...