Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

We bedanken Dr. Ana-Maria Zaske, exploitant van Atomic Force Microscope-UT Core-faciliteit aan het University of Texas Health Sciences Center, voor de bijgedragen expertise in AFM in dit project. We danken ook de financieringsbronnen van de National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 en R01HL142704 aan J. Wang).

1. Hydrogel voorbereiding
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap die vóór gebruik is gedesinfecteerd met ethanol en ultraviolet (UV) -gesteriliseerd om de steriliteit te behouden. Gereedschappen, zoals pincetten en pipetten, moeten worden besproeid met ethanol. Bufferoplossingen moeten ook steriel worden gefilterd.
<ol><li>Bereiding van aminosilane-gecoate glazen coverslips<ol>
<li>Plaats het gewenste aantal glazen afdekplaten op een stuk laboratoriumdoekje.<br...

Het doel van de huidige studie is om een effectief en efficiënt in vitro systeem te bieden om de impact van mechanische signalen in NCC's beter te begrijpen. Naast het volgen van het hierboven genoemde stapsgewijze protocol, moeten onderzoekers in gedachten houden dat de celcultuur van O9-1 NCC's wordt beïnvloed door het type glazen afdekkingsplaten dat wordt gebruikt om hydrogels te bereiden. Er werd bijvoorbeeld opgemerkt dat cellen gezaaid op een specifiek type glazen afdekplaat (zie de tabel met ma...

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn een groep stamcellen tijdens gewervelde embryogenese met een opmerkelijk vermogen om te migreren en bij te dragen aan de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels. NCC's kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, kraakbeen, bot, melanocyten en gladde spiercellen, afhankelijk van de locatie van axiale oorsprong en de lokale omgevingsrichtlijnen van de NCC1,2. Met het vermogen om te differentiëren in een breed scala aan celtypen, kunnen genetische afwijkingen die ontregeling veroorzaken in elk stadium van de ontwikkeling van de neurale top (NC) leiden tot tal van aangeboren ziekten2. Verstoringen tijdens de vorming, migratie en ontwikkeling van NCC's leiden bijvoorbeeld tot ontwikkelingsstoornissen die gezamenlijk bekend staan als neurocristopathieën1,3. Deze ziekten variëren van craniofaciale defecten als gevolg van falen in NCC-vorming, zoals het Treacher Collins-syndroom, tot de ontwikkeling van verschillende kankers als gevolg van NCC-gemetastaseerd migratievermogen, zoals te zien bij melanoom3,4,5,6. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers opmerkelijke ontdekkingen gedaan over de rollen en mechanismen van NCC's in ontwikkeling en ziekten, waarbij de meeste bevindingen gericht zijn op chemische signalen7,8. Meer recent is aangegeven dat mechanische signalen een kritische maar slecht begrepen rol spelen in de ontwikkeling van NCC9,10.
De omgevingsfactoren van NCC's spelen een cruciale rol tijdens hun ontwikkeling, inclusief de regulering van NCC-differentiatie in verschillende celtypen. Omgevingssignalen, bijvoorbeeld fysieke signalen, beïnvloeden cruciaal gedrag en cellulaire reacties, zoals functionele diversificatie. Mechanotransductie stelt cellen in staat om die signalen te detecteren en erop te reageren om verschillende biologische processen in stand te houden2. NCC's zijn omgeven door naburige cellen en verschillende substraten, zoals de extracellulaire matrix (ECM), die aanleiding kan geven tot mechanische stimuli om de homeostase te behouden en zich aan te passen aan de veranderingen door lotbepaling, proliferatie en apoptose11. Mechanotransductie begint bij het plasmamembraan waar de sensorische component van mechanische extracellulaire stimuli optreedt, wat resulteert in de intracellulaire regulatie van de cel12. Integrinen, focale verklevingen en juncties van het plasmamembraan geven mechanische signalen, zoals schuifkrachten, spanning en de stijfheid van omliggende substraten, in chemische signalen om cellulaire reacties te produceren12. Het doorgeven van chemische signalen van het plasmamembraan naar de uiteindelijke cellulaire regulatie wordt uitgevoerd via verschillende signaalroutes om vitale processen voor het organisme, zoals differentiatie, af te ronden.
Verschillende studies hebben gesuggereerd dat mechanische signalering van substraatstijfheid een rol speelt bij celdifferentiatie13,14. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat mesenchymale stamcellen (MSC's) gekweekt op zachte substraten met een stijfheid vergelijkbaar met die van hersenweefsel (in het bereik van 0,1-1,0 kPa) resulteerden in neuronale celdifferentiatie15,16. Meer MSC's differentiëren echter in myocytachtige cellen wanneer ze worden gekweekt op 8-17 kPa-substraten die de stijfheid van spieren nabootsen, terwijl osteoblastachtige differentiatie werd waargenomen wanneer MSC's werden gekweekt op stijve substraten (25-40 kPa)15,16. Het belang van mechanotransductie wordt benadrukt door de onregelmatigheden en afwijkingen in de mechanische signaleringsroute die mogelijk leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen en ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en osteoporose17,18,19. Bij kankers is normaal borstweefsel zacht en neemt het risico op borstkanker toe in stijf en dicht borstweefsel, een omgeving die meer lijkt op borsttumoren15. Met deze kennis kunnen de effecten van mechanische signalering op de ontwikkeling van NCC worden bestudeerd door eenvoudige manipulatie van substraatstijfheid door middel van een in vitro systeem, wat verdere voordelen en mogelijkheden biedt bij het begrijpen van de fundamenten van NC-gerelateerde ziekteprogressie en etiologie.
Om de impact van mechanische signalen in NCC's te bestuderen, hebben we een efficiënt in vitro systeem voor NCC's opgezet op basis van de optimalisatie van eerder gepubliceerde methoden en evaluatie van de reacties van NCC's op verschillende mechanischesignalen 20,21. Er werd een gedetailleerd protocol verstrekt voor de voorbereiding van de variërende hydrogelstijfheid en evaluatie van de impact van mechanische signalering in NCC's. Om dit te bereiken, worden O9-1 NCC's gebruikt als het NC-model om de effecten en veranderingen in reactie op stijve versus zachte hydrogels te bestuderen. O9-1 NCC's zijn een stabiele NC-cellijn geïsoleerd uit muizenembryo (E) op dag 8,5. O9-1 NCC's bootsen NCC's in vivo na omdat ze kunnen differentiëren in verschillende NC-afgeleide celtypen in gedefinieerde differentiatiemedia22. Om de mechanische signalering van NCC's te bestuderen, werd een matrixsubstraat vervaardigd met instelbare elasticiteit van verschillende concentraties acrylamide en bis-acrylamide-oplossingen om de gewenste stijfheid te bereiken, correlerend met de biologische substraatstijfheid20,21,23. Om de omstandigheden van matrixsubstraat voor NCC's, met name O9-1-cellen, te optimaliseren, werden wijzigingen aangebracht in het eerder gepubliceerde protocol20. Een verandering in dit protocol was het incuberen van hydrogels in collageen I, verdund in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES, bij 37 °C gedurende de nacht. De lage pH van azijnzuur leidt tot een homogene verdeling en een hogere collageen I-opname, waardoor een meer uniforme aanhechting van het ECM-eiwit mogelijk is24. Daarnaast werd een combinatie van paardenserum en foetaal runderserum (FBS) gebruikt in concentraties van respectievelijk 10% en 5% in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), voordat de hydrogels in de couveuse werden bewaard. Paardenserum werd gebruikt als een extra aanvulling op FBS vanwege het vermogen om celproliferatie en differentiatie te bevorderen bij een concentratie van 10%25.
Met deze methode werd een biologische omgeving nagebootst door de ECM-eiwitcoating (bijv. Collageen I) om een nauwkeurige in vitro omgeving te creëren voor NCC's om te groeien en te overleven20,21. De stijfheid van de bereide hydrogels werd kwantitatief geanalyseerd via atomic force microscopy (AFM), een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven26. Om het effect van verschillende stijfheidsniveaus op NCC's te bestuderen, werden wild-type O9-1-cellen gekweekt en bereid op hydrogels voor immunofluorescentie (IF) kleuring tegen filamenteuze actine (F-actine) om de verschillen in celadhesie en morfologieën aan te tonen als reactie op veranderingen in substraatstijfheid. Met behulp van dit in vitro systeem zullen onderzoekers in staat zijn om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met andere chemische signalen te bestuderen om een dieper inzicht te krijgen in de relatie tussen NCC's en mechanische signalering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn embryonale multipotente cellen van gewervelde dieren die kunnen migreren en differentiëren in een breed scala aan celtypen die aanleiding geven tot verschillende organen en weefsels. Weefselstijfheid produceert mechanische kracht, een fysieke aanwijzing die een cruciale rol speelt bij NCC-differentiatie; het mechanisme blijft echter onduidelijk. De hier beschreven methode biedt gedetailleerde informatie voor de geoptimaliseerde generatie van polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheid, de nauwkeurige meting van dergelijke stijfheid en de evaluatie van de impact van mechanische signalen in O9-1-cellen, een NCC-lijn die in vivo NCC's nabootst.
Hydrogelstijfheid werd gemeten met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) en gaf dienovereenkomstig verschillende stijfheidsniveaus aan. O9-1 NCC's gekweekt op hydrogels met verschillende stijfheid vertoonden verschillende celmorfologie en genexpressie van stressvezels, wat duidde op verschillende biologische effecten veroorzaakt door mechanische signaalveranderingen. Bovendien werd vastgesteld dat het variëren van de hydrogelstijfheid resulteerde in een efficiënt in vitro systeem om mechanische signalering te manipuleren door de gelstijfheid te veranderen en de moleculaire en genetische regulatie in NCC's te analyseren. O9-1 NCC's kunnen differentiëren in een breed scala aan celtypen onder invloed van de overeenkomstige differentiatiemedia, en het is handig om chemische signalen in vitrote manipuleren . Daarom is dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met chemische signalen te bestuderen, wat onderzoekers zal helpen de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling en ziekten van de neurale top beter te begrijpen.

Hydrogelvoorbereiding en stijfheidsbeoordeling via AFM en het Hertz-model Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om polyacrylamidehydrogels van verschillende stijfheid te genereren door de verhouding acrylamide en bis-acrylamide te reguleren. De polyacrylamide hydrogels zijn echter niet klaar voor de hechting van cellen vanwege het gebrek aan ECM-eiwitten. Sulfo-SANPAH, dat als linker fungeert, bindt dus covalent aan de hydrogels en reageert met de primaire amines van ECM-eiwitten om de <...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

De methode helpt bij de studie van de mechanische signalering van de neurale crest-cellen en de interactie met chemische signalen. Het kan ook helpen bij de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling van de neurale top bij ziekten. Het overbrengen van de glassportreten is het meest uitdagend, daarom breng je ze langzaam en aandachtig over om te voorkomen dat ze breken en vallen.De procedure wordt gedemonstreerd door mij en Dr. Sherry Zhao, een postdoctoraal fellow uit mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van het gewenste aantal glazen afdeksels op een stuk laboratoriumdoekje. Steriliseer vervolgens elke afdekplaat door deze heen en weer te laten gaan door de vlam van de alcoholbrander.Wanneer de afdekking afkoelt, bedek u de afdekslip van 12 millimeter met ongeveer 200 microliter en de afdekslip van 25 millimeter met 800 microliter 0,1 molair natriumhydroxide. Zuig na vijf minuten natriumhydroxide op en laat de afdeksels vijf minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen. Zodra de afdekslips zijn gedroogd, voegt u ongeveer 18 microliter aminopropyltriethoxysilaan of APTS toe aan een afdekslip van 12 millimeter en 150 microliter APTS aan een afdekslip van 25 millimeter.Aspiraat toegang tot APTS om de resterende APTS vijf minuten te laten drogen. Spoel de afdekzeilen driemaal af door ze telkens vijf minuten onder te dompelen in steriel gedeïoniseerd water. Verplaats de gewassen hoesjes naar een verse petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht.En behandel de afdekslip door gedurende 30 minuten voldoende 0,5% glutaaraldehyde in te weken. Na het aanzuigen van het glutaaraldehyde spoelt u de afdekplaat eenmaal drie minuten af met gedeïoniseerd water en droogt u de afdekking aan de lucht met de reactieve kant naar boven. Om de gesiliconiseerde afdekslips voor te bereiden, plaatst u het gelijke aantal afdekslips als die met aminosilane gecoate afdekplaat in een petrischaaltje bekleed met parafilm.Behandel vervolgens de 12 millimeter afdekslips met 40 microliter en 25 millimeter afdekslips met 150 microliter dichloormethaansilaan of DCMS gedurende vijf minuten. Was de afdekslipjes eenmaal gedurende één minuut met steriel gedeïoniseerd water voordat u de reactieve afdekslipjes met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje plaatst. Om de hydrogels te bereiden, pipetteer vers bereide acrylamidegeloplossing op de gedroogde aminosilaan gecoate afdekslips.Breng met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de dcms-behandelde afdekslip over op de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen twee afdekslips wordt gesandwicht. Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde afdekslip met een gebogen pincet, waardoor de gel aan de met aminosilane gecoate afdekslip blijft zitten. Dompel vervolgens de 12 millimeter afdekslip met de bijgevoegde hydrogel onder in een vooraf bepaalde 4-well of 24-well plaat bedekt met 500 microliter steriel PBS of gedeïoniseerd water en de 25 millimeter cover slip in een 6-well plaat bedekt met twee milliliter steriel PBS of gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten.Na het verwijderen van overtollig acrylamide-oplossing, bewaar de hydrogels in steriel PBS of gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aspirateer later PBS of gedeïoniseerd water uit de putplaat voordat u Sulfo-succinimydyl of Sulfo-SUNPAH-oplossing toevoegt om de gel volledig te bedekken. En plaats de gels met de oplossing onder een 15 watt, 365 nanometer ultraviolet licht onbedekt gedurende 10 minuten.Verzamel zoveel mogelijk van de Sulfo-SANPAH per oplossing door de plaat te kantelen. En was de gel vervolgens twee tot drie keer met 15 millimolaire HEPES. Voeg 15 milligram per milliliter Collageen 1 verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat.En incubeer de gels 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voer de volgende dag de was uit zoals beschreven in het manuscript voordat u de hydrogels incubeert met PBS met 10% paardenserum en 5% FBS bij 37 Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na twee uur incubatie 500 microliter steriel gefilterd DMEM met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine toe aan elke put en bewaar de gels bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Wanneer de celkweek klaar is, plaat ongeveer 1,5 maal 10 tot de vierde 09-1 cellen per centimeter in het kwadraat in het basismedium. Gebruik een pincet om de afdeksels naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van de cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Fixeer vervolgens de cellen met 500 microliter 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten voordat u de cellen behandelt met 500 microliter van 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur.Loop na 15 minuten door de cellen met 250 microliter 10% ezelserum. Kleur de cellen voor F-actine met felodipine bij een verdunning van 1 tot 400 in 250 microliter 10% ezelsserum, gevolgd door incubatie met DAPI gedurende 10 minuten. Was de cellen twee minuten met PBS voordat u drie tot vier druppels bevestigingsmedium aan elke put toevoegt.Leg op een fluorescentiemicroscoop de beelden vast van ten minste drie willekeurige frames per hydrogelmonster dat individuele en samengevoegde kanalen produceert. Bij de stijfheidsbeoordeling van de hydrogel door middel van atoomkrachtmicroscopie of AFM was de helling van de krachtcurve zacht voor zachte hydrogels omdat de vereiste kracht van de AFM-sonde minder was. Op stijve hydrogels was de gegenereerde helling echter veel steiler.De AFM-metingen werden vervolgens gebruikt om de gemiddelde stijfheid van hydrogels uit de elastische modulus van Young in kilopascals te berekenen. De groeikenmerken van P19- en 09-1-cellen werden waargenomen in één kilopascal en 40 kilopascals hydrogels van controle- en gemodificeerde gelsystemen. De 09-1 cellen gekweekt op de oorspronkelijke gelsystemen resulteerden in een hoger aantal dode cellen.Daarentegen vertoonden de 09-1 cellen gekweekt op de gemodificeerde gelsystemen een gezonde celgroei en voldoende hechting aan het hydrogelssubstraat met weinig celdek aangegeven door minimale ronde cellen. De P19-cellen op beide hydrogelsystemen vertoonden een overmaat aan ronde drijvende cellen en een gebrek aan celsubstraataanhechtingen. De compatibiliteit van neurale crest-cellen of NCC's met het gemodificeerde hydrogelsysteem werd beoordeeld door immunofluorescente kleuring voor AP-2.Een significante toename van AP-2-expressie in 09-1-cellen op het gemodificeerde hydrogelsysteem werd waargenomen. Bovendien vertoonden de 09-1-cellen verschillende morfologieën op basis van de hydrogels met lage of hoge stijfheid door verschillende hoeveelheden van de stressvezels. De anti-vinculine-expressie in 09-1 cellen gekweekt op de 40 kilopascals hydrogel was hoger dan die gekweekt op de hydrogel van één kilopascal, wat aangeeft dat de cellen die op zachtere substraten worden gekweekt minimale focale toevoegingscomplexen vormen dan het stijve substraat.De juiste wachttijd is cruciaal voor de polymerisatie van de hydrogels, omdat acrylamiden giftig zijn voor de cellen. Dompel de hydrogels minstens 30 minuten onder in PBS of gedeïoniseerd water om betere resultaten te garanderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling van neurale kuifcellen en bloedvaten in kippenembryo's met behulp van ChickGFP Neural Tube Enting en Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...