Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
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Nous remercions la Dre Ana-Maria Zaske, opératrice de l’installation Atomic Force Microscope-UT Core au Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas, pour l’expertise apportée en AFM dans ce projet. Nous remercions également J. Wang les sources de financement des National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 et R01HL142704).

1. Préparation de l’hydrogel
REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire qui a été désinfectée à l’éthanol et stérilisée aux ultraviolets (UV) avant utilisation pour maintenir la stérilité. Les outils, tels que les pinces à épiler et les pipettes, doivent être pulvérisés avec de l’éthanol. Les solutions tampons doivent également être filtrées stériles.
<ol><li>Préparation de couvercles en verre revêtus d’aminosila...

L’objectif de la présente étude est de fournir un système in vitro efficace et efficient pour mieux comprendre l’impact des signaux mécaniques dans les CCN. En plus de suivre le protocole étape par étape mentionné ci-dessus, les chercheurs doivent garder à l’esprit que la culture cellulaire des CCN O9-1 est affectée par le type de couvercles en verre utilisés pour préparer les hydrogels. Par exemple, il a été noté que les cellules ensemencées sur un type spécifique de couvercle en verre (vo...

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont un groupe de cellules souches au cours de l’embryogenèse des vertébrés avec une capacité remarquable à migrer et à contribuer au développement de divers organes et tissus. Les CCN peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les neurones sensoriels, le cartilage, les os, les mélanocytes et les cellules musculaires lisses, en fonction de l’emplacement de l’origine axiale et du guidage environnemental local du CNC1,2. Avec la capacité de se différencier en un large éventail de types cellulaires, les anomalies génétiques qui provoquent un dérèglement à n’importe quel stade du développement de la crête neurale (NC) peuvent conduire à de nombreuses maladies congénitales2. Par exemple, les perturbations au cours de la formation, de la migration et du développement des CCN entraînent des troubles du développement connus collectivement sous le nom de neurocristopathies1,3. Ces maladies vont des défauts craniofaciaux dus à l’échec de la formation des CNC, tels que le syndrome de Treacher Collins, au développement de divers cancers dus à la capacité migratoire métastatique des CNC, comme on le voit dans le mélanome3,4,5,6. Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont fait des découvertes remarquables sur les rôles et les mécanismes des CCN dans le développement et les maladies, la majorité des résultats étant axés sur les signaux chimiques7,8. Plus récemment, il a été indiqué que les signaux mécaniques jouaient un rôle critique mais mal compris dans le développement de laCCN 9,10.
Les signaux environnementaux des CCN jouent un rôle essentiel au cours de leur développement, y compris la régulation de la différenciation des CNC en différents types de cellules. Les indices environnementaux, par exemple les indices physiques, influencent les comportements pivots et les réponses cellulaires, telles que la diversification fonctionnelle. La mécanotransduction permet aux cellules de détecter et de répondre à ces signaux pour maintenir divers processus biologiques2. Les CCN sont entourés de cellules voisines et de différents substrats, tels que la matrice extracellulaire (ECM), qui peuvent donner lieu à des stimuli mécaniques pour maintenir l’homéostasie et s’adapter aux changements par la détermination du destin, la prolifération et l’apoptose11. La mécanotransduction commence au niveau de la membrane plasmique où se produit la composante sensorielle des stimuli extracellulaires mécaniques, entraînant la régulation intracellulaire de la cellule12. Les intégrines, les adhérences focales et les jonctions de la membrane plasmique relaient les signaux mécaniques, tels que les forces de cisaillement, les contraintes et la rigidité des substrats environnants, en signaux chimiques pour produire des réponses cellulaires12. Le relais des signaux chimiques de la membrane plasmique à la régulation cellulaire finale est effectué via différentes voies de signalisation pour finaliser les processus vitaux pour l’organisme, tels que la différenciation.
Plusieurs études ont suggéré que la signalisation mécanique de la rigidité du substrat joue un rôle dans la différenciation cellulaire13,14. Par exemple, des études antérieures ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur des substrats mous avec une rigidité similaire à celle du tissu cérébral (de l’ordre de 0,1 à 1,0 kPa) entraînaient une différenciation des cellules neuronales15,16. Cependant, plus de CSM se différencient en cellules de type myocytaire lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats de 8 à 17 kPa imitant la rigidité du muscle, tandis qu’une différenciation de type ostéoblaste a été observée lorsque les CSM ont été cultivés sur des substrats rigides (25-40 kPa)15,16. L’importance de la mécanotransduction est mise en évidence par les irrégularités et les anomalies dans la voie de signalisation mécanique qui conduisent potentiellement à de graves défauts de développement et des maladies, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose17,18,19. Dans les cancers, le tissu mammaire normal est mou et le risque de cancer du sein augmente dans le tissu mammaire raide et dense, un environnement qui s’apparente davantage à des tumeurs mammaires15. Grâce à ces connaissances, les effets de la signalisation mécanique sur le développement de la CCN peuvent être étudiés par une simple manipulation de la rigidité du substrat à travers un système in vitro, offrant ainsi d’autres avantages et possibilités pour comprendre les principes fondamentaux de la progression et de l’étiologie de la maladie liée à la NC.
Pour étudier l’impact des signaux mécaniques dans les CCN, nous avons établi un système in vitro efficace pour les CCN basé sur l’optimisation des méthodes précédemment publiées et l’évaluation des réponses des CCN à différents signaux mécaniques20,21. Un protocole détaillé a été fourni pour la préparation de la rigidité variable de l’hydrogel et l’évaluation de l’impact de la signalisation mécanique dans les CCN. Pour ce faire, les CCN O9-1 sont utilisés comme modèle CN pour étudier les effets et les changements en réponse aux hydrogels rigides par rapport aux hydrogels mous. Les NCC O9-1 sont une lignée cellulaire NC stable isolée à partir d’embryons de souris (E) au jour 8,5. Les NCC O9-1 imitent les NCC in vivo parce qu’ils peuvent se différencier en différents types de cellules dérivées de NC dans des milieux de différenciation définis22. Pour étudier la signalisation mécanique des CCN, un substrat matriciel a été fabriqué avec une élasticité accordable à partir de concentrations variables de solutions d’acrylamide et de bis-acrylamide pour obtenir la rigidité souhaitée, en corrélation avec la rigidité biologique du substrat20,21,23. Afin d’optimiser les conditions du substrat matriciel pour les CCN, en particulier les cellules O9-1, des modifications ont été apportées à partir du protocole20précédemment publié. Un changement apporté à ce protocole a été d’incuber des hydrogels dans du collagène I, dilués dans de l’acide acétique à 0,2 % au lieu de 50 mM d’HEPES, à 37 °C pendant la nuit. Le faible pH de l’acide acétique conduit à une distribution homogène et à une incorporation plus élevée de collagène I, permettant ainsi une fixation plus uniforme de la protéine ECM24. En outre, une combinaison de sérum de cheval et de sérum fœtal bovin (FBS) a été utilisée à des concentrations de 10% et 5% dans une solution saline tampon phosphate (PBS), respectivement, avant de stocker les hydrogels dans l’incubateur. Le sérum de cheval a été utilisé comme supplément supplémentaire au FBS en raison de sa capacité à favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires à la concentration de 10%25.
Avec cette méthode, un environnement biologique a été imité par le revêtement protéique ECM (par exemple, le collagène I) pour créer un environnement in vitro précis permettant aux CCN de croître et de survivre20,21. La rigidité des hydrogels préparés a été analysée quantitativement par microscopie à force atomique (AFM), une technique bien connue pour représenter le module élastique26. Pour étudier l’effet de différents niveaux de rigidité sur les CCN, des cellules O9-1 de type sauvage ont été cultivées et préparées sur des hydrogels pour la coloration par immunofluorescence (FI) contre l’actine filamenteuse (F-actine) afin de montrer les différences d’adhésion cellulaire et de morphologies en réponse aux changements de rigidité du substrat. En utilisant ce système in vitro, les chercheurs seront en mesure d’étudier les rôles de la signalisation mécanique dans les NCC et son interaction avec d’autres signaux chimiques afin de mieux comprendre la relation entre les NCC et la signalisation mécanique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules embryonnaires multipotentes vertébrées qui peuvent migrer et se différencier en un large éventail de types de cellules qui donnent naissance à divers organes et tissus. La rigidité des tissus produit une force mécanique, un indice physique qui joue un rôle essentiel dans la différenciation des CNC; toutefois, le mécanisme reste flou. La méthode décrite ici fournit des informations détaillées pour la génération optimisée d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, la mesure précise de cette rigidité et l’évaluation de l’impact des signaux mécaniques dans les cellules O9-1, une ligne NCC qui imite les CCN in vivo.
La rigidité de l’hydrogel a été mesurée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) et a indiqué différents niveaux de rigidité en conséquence. Les CCN O9-1 cultivés sur des hydrogels de rigidité variable ont montré une morphologie cellulaire et une expression génique différentes des fibres de stress, ce qui indiquait des effets biologiques variables causés par des changements de signal mécaniques. De plus, cela a établi que la variation de la rigidité de l’hydrogel a abouti à un système in vitro efficace pour manipuler la signalisation mécanique en modifiant la rigidité du gel et en analysant la régulation moléculaire et génétique dans les CCN. Les NCC O9-1 peuvent se différencier en un large éventail de types de cellules sous l’influence des milieux de différenciation correspondants, et il est pratique de manipuler les signaux chimiques in vitro. Par conséquent, ce système in vitro est un outil puissant pour étudier le rôle de la signalisation mécanique dans les CCN et son interaction avec les signaux chimiques, ce qui aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale et des maladies.

Préparation de l’hydrogel et évaluation de la rigidité par AFM et le modèle Hertz Ici, un protocole détaillé est fourni pour générer des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable en régulant le rapport entre l’acrylamide et le bis-acrylamide. Cependant, les hydrogels de polyacrylamide ne sont pas prêts pour l’adhésion des cellules en raison du manque de protéines ECM. Ainsi, le sulfo-SANPAH, agissant comme un liant, se lie de manière covalente aux hydrogels et réagit avec l...

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An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

La méthode aide à l’étude de la signalisation mécanique des cellules de la crête neurale et de son interaction avec les signaux chimiques. Il peut également aider dans les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale dans les maladies. Transférer les glissières de couvercle en verre est le plus difficile, donc les transférer lentement et attentivement pour éviter de les casser et de les laisser tomber.La démonstration de la procédure sera faite par moi et la Dre Sherry Zhao, boursière postdoctorale de mon laboratoire. Commencez par placer le nombre souhaité de couvercles de verre glissés sur un morceau de lingette de laboratoire. Ensuite, stérilisez chaque couvercle en le passant d’avant en arrière à travers la flamme du brûleur à alcool.Lorsque le couvercle glisse refroidit, couvrez le couvercle de 12 millimètres avec environ 200 microlitres et le couvercle de 25 millimètres avec 800 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire. Après cinq minutes, aspirer l’hydroxyde de sodium et laisser sécher à l’air libre pendant cinq minutes les glissements de couverture pour former un film uniforme. Une fois les feuillets de couverture séchés, ajoutez environ 18 microlitres de triéthoxysilane d’aminopropyle ou d’APTS sur un bordereau de couverture de 12 millimètres et 150 microlitres d’APTS sur un bordereau de couverture de 25 millimètres.Aspirer l’APTS d’accès pour permettre à l’APTS résiduel de sécher pendant cinq minutes. Plus tard, rincez les couvercles trois fois en les immergeant dans de l’eau désionisée stérile pendant cinq minutes à chaque fois. Déplacez les couvercles lavés vers une boîte de Petri fraîche avec le côté réactif vers le haut.Et traitez les glissements de couverture en trempant suffisamment de glutaraldéhyde à 0,5% pendant 30 minutes. Après avoir aspiré le glutaraldéhyde, rincez une fois le couvercle avec de l’eau désionisée pendant trois minutes et séchez à l’air le couvercle glisse avec le côté réactif vers le haut. Pour préparer les bordereaux de couverture siliconés, placez le même nombre de bordereaux de couverture que ce couvercle enduit d’aminosilane glisse dans une boîte de Petri recouverte de film para.Ensuite, traitez les feuillets de couverture de 12 millimètres avec 40 microlitres et les feuillets de couverture de 25 millimètres avec 150 microlitres de dichlorométhane silane ou de DCMS pendant cinq minutes. Lavez les feuillets de couverture avec de l’eau désionisée stérile une fois pendant une minute avant de placer les glissières réactives face vers le haut sur une lingette de laboratoire. Pour préparer les hydrogels, pipettez la solution de gel d’acrylamide fraîchement préparée sur les feuillets de couverture enduits d’aminosilane séchés.À l’aide d’une pince à épiler incurvée, transférez immédiatement le bordereau de couverture traité DCMS sur le dessus de la solution de gel avec le côté traité touchant la solution de gel, changeant ainsi la solution de gel entre deux glissements de couverture. Une fois le gel polymérisé, séparez le couvercle traité DCMS par une pince à épiler incurvée, en laissant le gel attaché au couvercle recouvert d’aminosilane. Ensuite, immergez le couvercle de 12 millimètres avec l’hydrogel attaché dans une plaque prédéterminée de 4 ou 24 puits recouverte de 500 microlitres de PBS stérile ou d’eau désionisée et le couvercle de 25 millimètres glisse dans une plaque de 6 puits recouverte de deux millilitres de PBS stérile ou d’eau désionisée pendant 30 minutes.Après avoir retiré l’excès de solution d’acrylamide, conservez les hydrogels dans du PBS stérile ou de l’eau désionisée à température ambiante pendant 30 minutes. Plus tard, aspirez le PBS ou l’eau désionisée de la plaque de puits avant d’ajouter la solution de Sulfo-succinimydyl ou de Sulfo-SUNPAH pour couvrir complètement le gel. Et placez les gels avec la solution sous une lumière ultraviolette de 15 watts et 365 nanomètres à découvert pendant 10 minutes.Collectez autant de Sulfo-SANPAH par solution que possible en inclinant la plaque. Et puis lavez le gel deux à trois fois avec 15 millimolaires HEPES. Ajouter 15 milligrammes par millilitre de collagène 1 dilué dans de l’acide acétique à 0,2% à chaque puits contenant l’hydrogel.Et incubez les gels pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, effectuez le lavage comme décrit dans le manuscrit avant d’incuber les hydrogels avec du PBS contenant 10% de sérum de cheval et 5% de FBS à 37 Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après deux heures d’incubation, ajoutez 500 microlitres de DMEM stérile filtré avec 10% de FBS et 1% de streptomycine de pénicilline à chaque puits et stockez les gels à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Lorsque la culture cellulaire est prête, plaquer environ 1,5 fois 10 à la quatrième 09-1 cellules par centimètre carré dans le milieu bazell. Utilisez une pince à épiler pour transporter les glissements de couverture vers une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant des cellules cultivées directement sur la plaque. Ensuite, fixez les cellules en utilisant 500 microlitres de 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes avant de traiter les cellules avec 500 microlitres de 0,1% triton X-100 à température ambiante.Après 15 minutes, marchez les cellules avec 250 microlitres de sérum d’âne à 10%. Colorez les cellules pour la F-actine avec la félodipine à une dilution de 1 à 400 dans 250 microlitres de sérum d’âne à 10%, suivie d’une incubation avec DAPI pendant 10 minutes. Lavez les cellules avec du PBS pendant deux minutes avant d’ajouter trois à quatre gouttes de milieu de montage à chaque puits.Sur un microscope à fluorescence, capturez les images d’au moins trois images aléatoires par échantillon d’hydrogel produisant des canaux individuels et fusionnés. Dans l’évaluation de la rigidité de l’hydrogel par microscopie à force atomique ou AFM, la pente de la courbe de force était douce pour les hydrogels mous car la force requise de la sonde AFM était moindre. Cependant, sur les hydrogels rigides, la pente générée était beaucoup plus raide.Les mesures AFM ont ensuite été utilisées pour calculer la rigidité moyenne des hydrogels à partir du module d’élasticité de Young en kilopascals. Les caractéristiques de croissance des cellules P19 et 09-1 ont été observées dans des hydrogels d’un kilopascal et de 40 kilopascals de systèmes de contrôle et de gel modifié. Les cellules 09-1 cultivées sur les systèmes de gel d’origine ont entraîné un nombre plus élevé de cellules mortes.En revanche, les cellules 09-1 cultivées sur les systèmes de gel modifiés présentaient une croissance cellulaire saine et une fixation suffisante au substrat des hydrogels avec peu de pont cellulaire indiqué par un minimum de cellules rondes. Les cellules P19 plaquées sur les deux systèmes d’hydrogel présentaient un excès de cellules flottantes rondes et un manque de fixations de substrat cellulaire. La compatibilité des cellules de la crête neurale ou des CCN avec le système d’hydrogel modifié a été évaluée par coloration immunofluorescente de l’AP-2.Une augmentation significative de l’expression de l’AP-2 dans les cellules 09-1 plaquées sur le système d’hydrogel modifié a été observée. De plus, les cellules 09-1 présentaient des morphologies différentes basées sur les hydrogels de rigidité faible ou élevée à travers des quantités variables de fibres de stress. L’expression de l’anti-vinculine dans les cellules 09-1 cultivées sur l’hydrogel de 40 kilopascals était plus élevée que dans l’hydrogel d’un kilopascal, ce qui reflète le fait que les cellules cultivées sur des substrats plus mous forment des complexes d’addition focale minimes que le substrat rigide.Un temps d’attente approprié est crucial pour la polymérisation des hydrogels car les acrylamides sont toxiques pour les cellules. Immergez les hydrogels dans du PBS ou de l’eau désionisée pendant au moins 30 minutes pour assurer de meilleurs résultats.

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