Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

Wir danken Dr. Ana-Maria Zaske, Betreiberin der Atomic Force Microscope-UT Core-Anlage am Health Sciences Center der University of Texas, für die in diesem Projekt beigebrachte Expertise in AFM. Wir danken auch den Finanzierungsquellen der National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 und R01HL142704 an J. Wang).

1. Hydrogel-Zubereitung
HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden, die vor Gebrauch mit Ethanol desinfiziert und ultraviolett (UV)-sterilisiert wurde, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Werkzeuge wie Pinzetten und Pipetten müssen mit Ethanol besprüht werden. Pufferlösungen müssen ebenfalls sterilfiltriert werden.
<ol><li>Herstellung von Aminosilan-beschichteten Glas-Deckgläsern<ol>
<li>Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasdeckgläsern auf ein S...

Ziel der aktuellen Studie ist es, ein effektives und effizientes In-vitro-System bereitzustellen, um die Auswirkungen mechanischer Signale in NCCs besser zu verstehen. Zusätzlich zur Befolgung des oben genannten Schritt-für-Schritt-Protokolls müssen die Forscher bedenken, dass die Zellkultur von O9-1-NCCs von der Art der Glasdeckgläser beeinflusst wird, die zur Herstellung von Hydrogelen verwendet werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Zellen, die auf einer bestimmten Art von Glasdeckglas gesät wurde...

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine Gruppe von Stammzellen während der Embryogenese von Wirbeltieren mit einer bemerkenswerten Fähigkeit zu wandern und zur Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe beizutragen. NCCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich sensorischer Neuronen, Knorpel, Knochen, Melanozyten und glatter Muskelzellen, abhängig von der Lage des axialen Ursprungs und der lokalen Umweltführung des NCC1,2. Mit der Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, können genetische Anomalien, die in jedem Stadium der Neuralleistenentwicklung (NC) eine Dysregulation verursachen, zu zahlreichen angeborenen Erkrankungen führen2. Zum Beispiel führen Störungen während der Bildung, Migration und Entwicklung von NCCs zu Entwicklungsstörungen, die zusammen als Neurokristopathien1,3bekannt sind. Diese Krankheiten reichen von kraniofazialen Defekten aufgrund eines Versagens der NCC-Bildung, wie dem Treacher-Collins-Syndrom, bis hin zur Entwicklung verschiedener Krebsarten aufgrund der metastasierenden Migrationsfähigkeit des NCC, wie sie beim Melanom3,4,5,6beobachtet wird . In den letzten Jahrzehnten haben Forscher bemerkenswerte Entdeckungen über die Rollen und Mechanismen von NCCs in der Entwicklung und bei Krankheiten gemacht, wobei sich die Mehrheit der Ergebnisse auf chemische Signale konzentriert7,8. In jüngerer Zeit wurde darauf hingewiesen, dass mechanische Signale eine kritische, aber wenig verstandene Rolle in der NCC-Entwicklungspielen 9,10.
Die Umwelthinweise von NCCs spielen während ihrer Entwicklung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Regulierung der NCC-Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Umwelteinflüsse, z. B. physikalische Hinweise, beeinflussen das entscheidende Verhalten und die zellulären Reaktionen, wie z. B. die funktionelle Diversifizierung. Die Mechanotransduktion ermöglicht es den Zellen, diese Hinweise zu spüren und darauf zu reagieren, um verschiedene biologische Prozesse aufrechtzuerhalten2. NCCs sind von benachbarten Zellen und verschiedenen Substraten wie der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, die mechanische Reize hervorrufen können, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und sich durch Schicksalsbestimmung, Proliferation und Apoptose an die Veränderungen anzupassen11. Die Mechanotransduktion beginnt an der Plasmamembran, wo die sensorische Komponente mechanischer extrazellulärer Reize auftritt, was zur intrazellulären Regulation der Zelleführt 12. Integrine, fokale Adhäsionen und Verbindungen der Plasmamembran leiten mechanische Signale wie Scherkräfte, Spannung und Steifigkeit der umgebenden Substrate in chemische Signale um, um zelluläre Reaktionen zu erzeugen12. Die Weiterleitung chemischer Signale von der Plasmamembran zur endgültigen zellulären Regulation erfolgt über verschiedene Signalwege, um lebenswichtige Prozesse für den Organismus, wie z.B. die Differenzierung, abzuschließen.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass die mechanische Signalübertragung aus der Substratsteifigkeit eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt13,14. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die auf weichen Substraten mit einer Steifigkeit ähnlich der von Hirngewebe (im Bereich von 0,1-1,0 kPa) gezüchtet wurden, zu einer neuronalen Zelldifferenzierung führten15,16. Allerdings differenzieren sich mehr MSCs in myozytenähnliche Zellen, wenn sie auf 8-17 kPa-Substraten gezüchtet werden, die die Steifigkeit des Muskels nachahmen, während osteoblastenartige Differenzierung beobachtet wurde, wenn MSCs auf steifen Substraten kultiviert wurden (25-40 kPa)15,16. Die Bedeutung der Mechanotransduktion wird durch die Unregelmäßigkeiten und Anomalien im mechanischen Signalweg hervorgehoben, die möglicherweise zu schweren Entwicklungsdefekten und -krankheiten führen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Osteoporose17,18,19. Bei Krebserkrankungen ist normales Brustgewebe weich, und das Brustkrebsrisiko steigt in steifem und dichtem Brustgewebe, einer Umgebung, die eher Brusttumorenähnelt 15. Mit diesem Wissen können die Auswirkungen der mechanischen Signalgebung auf die NCC-Entwicklung durch einfache Manipulation der Substratsteifigkeit durch ein In-vitro-System untersucht werden, was weitere Vorteile und Möglichkeiten zum Verständnis der Grundlagen des NC-bedingten Krankheitsverlaufs und der Ätiologie bietet.
Um den Einfluss mechanischer Signale in NCCs zu untersuchen, haben wir ein effizientes In-vitro-System für NCCs etabliert, das auf der Optimierung zuvor veröffentlichter Methoden und der Bewertung der Reaktionen von NCCs auf verschiedene mechanische Signale basiert20,21. Es wurde ein detailliertes Protokoll für die unterschiedliche Vorbereitung der Hydrogelsteifigkeit und die Bewertung der Auswirkungen der mechanischen Signalgebung in NCCs bereitgestellt. Um dies zu erreichen, werden O9-1 NCCs als NC-Modell verwendet, um die Auswirkungen und Veränderungen als Reaktion auf steife gegenüber weichen Hydrogelen zu untersuchen. O9-1 NCCs sind eine stabile NC-Zelllinie, die am Tag 8.5 aus dem Mausembryo (E) isoliert wurde. O9-1 NCCs ahmen NCCs in vivo nach, weil sie sich in definierten Differenzierungsmedien in verschiedene NC-abgeleitete Zelltypen differenzieren können22. Um die mechanische Signalisierung von NCCs zu untersuchen, wurde ein Matrixsubstrat mit abstimmbarer Elastizität aus unterschiedlichen Konzentrationen von Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen hergestellt, um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen, die der biologischen Substratsteifigkeit20,21,23entspricht. Um die Bedingungen des Matrixsubstrats für NCCs, insbesondere O9-1-Zellen, zu optimieren, wurden Modifikationen aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll20vorgenommen. Eine Änderung in diesem Protokoll bestand darin, Hydrogele in Kollagen I, verdünnt in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, bei 37 ° C über Nacht zu inkubieren. Der niedrige pH-Wert der Essigsäure führt zu einer homogenen Verteilung und einem höheren Kollagen-I-Einbau, wodurch eine gleichmäßigere Bindung des ECM-Proteins24ermöglicht wird. Darüber hinaus wurde eine Kombination aus Pferdeserum und fetalem Rinderserum (FBS) in Konzentrationen von 10% bzw. 5% in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) verwendet, bevor die Hydrogele im Inkubator gelagert wurden. Pferdeserum wurde als zusätzliche Ergänzung zu FBS aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, die Zellproliferation und -differenzierung bei einer Konzentration von 10% zu fördern25.
Mit dieser Methode wurde eine biologische Umgebung durch die ECM-Proteinbeschichtung (z. B. Kollagen I) nachgeahmt, um eine genaue In-vitro-Umgebung für NCCs zu schaffen, um zu wachsen und zu überleben20,21. Die Steifigkeit der präparierten Hydrogele wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls26,quantitativ analysiert. Um die Wirkung unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus auf NCCs zu untersuchen, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen kultiviert und auf Hydrogelen für die Immunfluoreszenz (IF) -Färbung gegen filamentöses Aktin (F-Aktin) vorbereitet, um die Unterschiede in der Zelladhäsion und Morphologie als Reaktion auf Veränderungen der Substratsteifigkeit zu zeigen. Mit diesem In-vitro-System werden die Forscher in der Lage sein, die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit anderen chemischen Signalen zu untersuchen, um ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen NCCs und mechanischer Signalgebung zu erlangen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Neuralleistenzellen (NCCs) sind embryonale multipotente Zellen von Wirbeltieren, die in eine Vielzahl von Zelltypen wandern und differenzieren können, aus denen verschiedene Organe und Gewebe hervorgehen. Gewebesteifigkeit erzeugt mechanische Kraft, ein physikalischer Hinweis, der eine entscheidende Rolle bei der NCC-Differenzierung spielt; Der Mechanismus bleibt jedoch unklar. Die hier beschriebene Methode liefert detaillierte Informationen für die optimierte Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit, die genaue Messung einer solchen Steifigkeit und die Bewertung der Wirkung mechanischer Signale in O9-1-Zellen, einer NCC-Linie, die in vivo NCCs nachahmt.
Die Hydrogelsteifigkeit wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen und zeigte entsprechend unterschiedliche Steifigkeitsstufen an. O9-1 NCCs, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, zeigten eine unterschiedliche Zellmorphologie und Genexpression von Stressfasern, was auf unterschiedliche biologische Effekte hinwies, die durch mechanische Signaländerungen verursacht wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Variation der Hydrogelsteifigkeit zu einem effizienten In-vitro-System führte, um die mechanische Signalgebung zu manipulieren, indem die Gelsteifigkeit verändert und die molekulare und genetische Regulation in NCCs analysiert wurde. O9-1 NCCs können sich unter dem Einfluss der entsprechenden Differenzierungsmedien in eine Vielzahl von Zelltypen differenzieren, und es ist praktisch, chemische Signale in vitrozu manipulieren. Daher ist dieses In-vitro-System ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit chemischen Signalen zu untersuchen, was den Forschern helfen wird, die molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung und -krankheiten besser zu verstehen.

Hydrogelvorbereitung und Steifigkeitsbewertung durch AFM und das Hertz-Modell Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit bereitgestellt, indem das Verhältnis von Acrylamid und Bisacrylamid reguliert wird. Die Polyacrylamid-Hydrogele sind jedoch aufgrund des Mangels an ECM-Proteinen nicht bereit für die Adhäsion von Zellen. So bindet Sulfo-SANPAH, das als Linker fungiert, kovalent an die Hydrogele und reagiert mit den primären Amin...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Die Methode hilft bei der Untersuchung der mechanischen Signalübertragung der Neuralleistenzellen und ihrer Wechselwirkung mit chemischen Signalen. Es kann auch bei den molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung bei Krankheiten helfen. Das Übertragen der Glasabdeckungsrutschen ist die größte Herausforderung, daher übertragen Sie sie langsam und aufmerksam, um ein Brechen und Herunterfallen zu verhindern.Das Verfahren werden von mir und Dr. Sherry Zhao, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Glasabdeckungsrutschen auf ein Stück Labortuch. Sterilisieren Sie dann jeden Deckzettel, indem Sie ihn durch die Flamme des Alkoholbrenners hin und her führen.Wenn der Deckel abkühlt, bedecken Sie den 12 Millimeter Abdeckslip mit ca. 200 Mikrolitern und den 25 Millimeter Deckschlupf mit 800 Mikrolitern 0,1 molarem Natriumhydroxid. Nach fünf Minuten Natronlauge absaugen und den Deckel fünf Minuten an der Luft trocknen lassen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden. Sobald die Deckblätter getrocknet sind, fügen Sie etwa 18 Mikroliter Aminopropyltriethoxysilan oder APTS auf einen 12-Millimeter-Deckzettel und 150 Mikroliter APTS auf einen 25-Millimeter-Deckzettel hinzu.Aspirat greifen Sie auf APTS zu, damit das verbleibende APTS fünf Minuten lang trocknen kann. Später spülen Sie die Abdeckungsrutschen dreimal aus, indem Sie sie jedes Mal fünf Minuten lang in steriles deionisiertes Wasser tauchen. Bewegen Sie die gewaschenen Bezugsrutschen mit der reaktiven Seite nach oben in eine frische Petrischale.Und behandeln Sie die Abdeckungsrutschen, indem Sie 30 Minuten lang genügend 0,5% Glutaraldehyd einweichen. Nach dem Absaugen des Glutaraldehyds spülen Sie die Abdeckungsrutschen einmal mit entionisiertem Wasser für drei Minuten ab und trocknen Sie die Abdeckung mit der reaktiven Seite nach oben an der Luft. Um die silikonisierten Abdeckzettel vorzubereiten, legen Sie die gleiche Anzahl von Abdeckzetteln wie die mit Aminosilan beschichteten Deckblätter in eine mit Parafolie ausgekleidete Petrischale.Behandeln Sie dann die 12-Millimeter-Abdeckzettel mit 40 Mikrolitern und 25-Millimeter-Deckblättern mit 150 Mikrolitern Dichlormethansilan oder DCMS für fünf Minuten. Waschen Sie die Bezugsslips einmal für eine Minute mit sterilem entionisiertem Wasser, bevor Sie die reaktiven Cover-Slips mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen. Zur Herstellung der Hydrogele werden frisch zubereitete Acrylamid-Gellösung auf die getrockneten Aminosilan-beschichteten Deckblätter pipettiert.Mit einer gekrümmten Pinzette den DCMS-behandelten Deckslip sofort auf die Gellösung aufbringen, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen zwei Deckblättern gewechselt wird. Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckschlicker mit einer gekrümmten Pinzette, wobei das Gel an dem mit Aminosilan beschichteten Deckslip befestigt bleibt. Als nächstes tauchen Sie den 12-Millimeter-Deckslip mit dem angebrachten Hydrogel in eine vorgegebene 4-Well- oder 24-Well-Platte, die mit 500 Mikrolitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, und den 25-Millimeter-Abdeckungsrutsch in eine 6-Well-Platte, die mit zwei Millilitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, für 30 Minuten.Nach dem Entfernen der überschüssigen Acrylamidlösung lagern Sie die Hydrogele 30 Minuten lang in sterilem PBS oder entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Später saugen Sie PBS oder deionisiertes Wasser aus der Brunnenplatte ab, bevor Sie Sulfo-Succinimydyl- oder Sulfo-SUNPAH-Lösung hinzufügen, um das Gel vollständig zu bedecken. Und legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 Watt, 365 Nanometer ultraviolettes Licht, das für 10 Minuten unbedeckt ist.Sammeln Sie so viel von der Sulfo-SANPAH pro Lösung wie möglich, indem Sie die Platte kippen. Und dann waschen Sie das Gel zwei- bis dreimal mit 15 Millimolar HEPES. Fügen Sie 15 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1, verdünnt in 0,2% Essigsäure, zu jeder Vertiefung hinzu, die das Hydrogel enthält.Und inkubieren Sie die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Führen Sie am nächsten Tag die Wäsche wie im Manuskript beschrieben durch, bevor Sie die Hydrogele mit PBS inkubieren, das 10% Pferdeserum und 5% FBS bei 37 Celsius und 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Stunden Inkubation werden 500 Mikroliter steril gefiltertes DMEM mit jeweils 10% FBS und 1% Penicillin Streptomycin zugegeben und die Gele bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelagert.Wenn die Zellkultur fertig ist, platten Sie ungefähr 1,5 mal 10 bis die vierte 09-1 Zelle pro Zentimeter Im Quadrat im Bazell-Medium. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Abdeckungsrutschen auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von den Direkt auf der Platte gezüchteten Zellen zu minimieren. Fixieren Sie dann die Zellen mit 500 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur behandeln.Nach 15 Minuten gehen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 10% Eselserum. Färben Sie die Zellen auf F-Aktin mit Felodipin in einer Verdünnung von 1 bis 400 in 250 Mikrolitern 10% Eselserum, gefolgt von einer Inkubation mit DAPI für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen zwei Minuten lang mit PBS, bevor Sie drei bis vier Tropfen Montagemedium zu jeder Vertiefung geben.Erfassen Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop die Bilder von mindestens drei zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe, die einzelne und verschmolzene Kanäle erzeugen. Bei der Steifigkeitsbewertung des Hydrogels durch Rasterkraftmikroskopie oder AFM war die Neigung der Kraftkurve für weiche Hydrogele schonend, da die erforderliche Kraft von der AFM-Sonde geringer war. Bei steifen Hydrogelen war die erzeugte Steigung jedoch viel steiler.Die AFM-Messungen wurden dann verwendet, um die durchschnittliche Steifigkeit von Hydrogelen aus dem Elastizitätsmodul von Young in Kilopascal zu berechnen. Die Wachstumseigenschaften von P19- und 09-1-Zellen wurden in einem Kilopascal und 40 Kilopascal Hydrogelen von Kontroll- und modifizierten Gelsystemen beobachtet. Die 09-1-Zellen, die auf den ursprünglichen Gelsystemen gezüchtet wurden, führten zu einer höheren Anzahl toter Zellen.Im Gegensatz dazu zeigten die 09-1-Zellen, die auf den modifizierten Gelsystemen gezüchtet wurden, ein gesundes Zellwachstum und eine ausreichende Bindung an das Hydrogelsubstrat mit wenig Zelldeck, das durch minimale runde Zellen angezeigt wurde. Die P19-Zellen, die auf beiden Hydrogelsystemen plattiert waren, zeigten einen Überschuss an runden schwimmenden Zellen und einen Mangel an Zellsubstratansätzen. Die Kompatibilität von Neuralleistenzellen oder NCCs mit dem modifizierten Hydrogelsystem wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für AP-2 bewertet.Ein signifikanter Anstieg der AP-2-Expression in 09-1 Zellen, die auf dem modifizierten Hydrogelsystem plattiert waren, wurde beobachtet. Darüber hinaus zeigten die 09-1-Zellen unterschiedliche Morphologien, die auf den Hydrogelen mit niedriger oder hoher Steifigkeit durch unterschiedliche Mengen der Spannungsfasern basierten. Die Anti-Vinculin-Expression in 09-1-Zellen, die auf dem 40-Kilopascal-Hydrogel gezüchtet wurden, war höher als die auf dem einen Kilopascal-Hydrogel gezüchteten Zellen, was widerspiegelt, dass die auf weicheren Substraten gezüchteten Zellen minimale fokale Additionskomplexe bilden als das steife Substrat.Eine angemessene Wartezeit ist entscheidend für die Polymerisation der Hydrogele, da Acrylamide für die Zellen toxisch sind. Tauchen Sie die Hydrogele mindestens 30 Minuten lang in PBS oder entionisiertes Wasser, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...