Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

אנו מודים לד"ר אנה-מריה זסקה, מפעילת מתקן הליבה של הכוח האטומי מיקרוסקופ-UT במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס, על המומחיות שנתרמה ב- AFM בפרויקט זה. אנו מודים גם למקורות המימון של המכונים הלאומיים לבריאות (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ו- R01HL142704 לג'יי וואנג).

1. הכנת הידרוג'ל
הערה: כל השלבים חייבים להתבצע במכסה המנוע של תרבית התא שחוטא באתנול וחיטוי אולטרה סגול (UV) לפני השימוש כדי לשמור על סטריליות. כלים, כגון פינצטה ופיפטות, חייבים להיות מרוססים באתנול. פתרונות מאגר חייבים להיות גם מסוננים סטריליים.
<ol><li>הכנת כיסויי זכוכית מצופים...

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מערכת במבחנה יעילה ויעילה כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs. בנוסף בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד שהוזכר לעיל, החוקרים צריכים לזכור כי התרבות התאית של O9-1 NCCs מושפעת מסוג כיסויי זכוכית המשמשים להכנת הידרוג'ל. לדוגמה, צוין כי תאים שנזרעו על סוג מסו...

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם קבוצה של תאי גזע במהלך עובר חוליות עם יכולת יוצאת דופן לנדוד ולתרום להתפתחות של איברים ורקמות שונים. NCCs יכול להבדיל לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים חושיים, סחוס, עצם, מלנוציטים ותאי שריר חלקים, בהתאם למיקום המקור האקסיאלי וההדרכה הסביבתית המקומית של NCC1,2. עם היכולת להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים, חריגות גנטיות הגורמות לדיסרגציה בכל שלב של התפתחות פסגת עצבים (NC) יכולות להוביל למחלות מולדות רבות2. לדוגמה, הפרעות במהלך היווצרות, הגירה, ופיתוח של NCCs להוביל להפרעות התפתחותיות המכונה באופן קולקטיבי נוירוקריסטופתיות1,3. מחלות אלה נעות בין פגמים craniofacial עקב כישלון בהיווצרות NCC, כגון תסמונת Treacher קולינס, להתפתחות של סוגי סרטן שונים עקב יכולת הנדידה גרורתית NCC, כפי שניתן לראות מלנומה3,4,5,6. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים גילו תגליות מדהימות על התפקידים והמנגנונים של NCCs בפיתוח ומחלות, כאשר רוב הממצאים התמקדו באותות כימיים7,8. לאחרונה, אותות מכניים צוינו לשחק תפקיד קריטי אך לא מובן בפיתוח NCC9,10.
הרמזים הסביבתיים של NCCs לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח שלהם, כולל הרגולציה של בידול NCC לסוגי תאים שונים. רמזים סביבתיים, למשל רמזים פיזיים, משפיעים על התנהגויות מרכזיות ותגובות תאיות, כגון גיוון תפקודי. Mechanotransduction מאפשר לתאים לחוש ולהגיב לרמזים אלה כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים שונים2. NCCs מוקפים בתאים שכנים ומצעים שונים, כגון מטריצה חוץ תאית (ECM), אשר יכול להוליד גירויים מכניים כדי לשמור על הומאוסטזיס ולהתאים את השינויים באמצעות קביעת גורל, התפשטות, אפופטוזיס11. Mechanotransduction מתחיל בקרום הפלזמה שבו המרכיב החושי של גירויים חוץ תאיים מכני מתרחש, וכתוצאה מכך את הוויסות התאי של התא12. אינטגרינים, הידבקויות מוקד וצמתים של ממסר קרום הפלזמה אותות מכניים, כגון כוחות גיסת, מתח, ואת נוקשות של המצעים שמסביב, לתוך אותות כימיים כדי לייצר תגובות תאיות12. העברת אותות כימיים מקרום הפלזמה לוויסות התאי הסופי מתבצעת באמצעות מסלולי איתות שונים כדי לסיים תהליכים חיוניים עבור האורגניזם, כגון בידול.
מספר מחקרים הראו כי איתות מכני מנוקשות מצע ממלא תפקיד בבידול התא13,14. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע mesenchymal (MSCs) גדל על מצעים רכים עם נוקשות דומה לזו של רקמת המוח (בטווח של 0.1-1.0 kPa) הביא בידול תאים עצביים15,16. עם זאת, יותר MSCs להבדיל לתוך תאים דמויי myocyte כאשר גדל על מצעים 8-17 kPa מחקה את נוקשות השריר, בעוד בידול דמוי osteoblast נצפתה כאשר MSCs היו תרבית על מצעים נוקשים (25-40 kPa)15,16. המשמעות של mechanotransduction מודגשת על ידי אי סדרים וחריגות במסלול איתות מכני שעלול להוביל פגמים התפתחותיים חמורים ומחלות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, אוסטאופורוזיס17,18,19. בסרטן, רקמת שד רגילה רכה, והסיכון לסרטן השד עולה ברקמת שד נוקשה וצפופה, סביבה הדומה יותר לגידולי השד15. עם ידע זה, ההשפעות של איתות מכני על פיתוח NCC ניתן ללמוד באמצעות מניפולציה פשוטה של נוקשות מצע באמצעות מערכת במבחנה, מתן יתרונות נוספים ואפשרויות בהבנת היסודות של התקדמות המחלה הקשורים NC ואטיולוגיה.
כדי לחקור את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs, הקמנו מערכת במבחנה יעילה עבור NCCs המבוססת על אופטימיזציה של שיטות שפורסמו בעבר והערכה של התגובות של NCCs לאותות מכניים שונים20,21. פרוטוקול מפורט סופק להכנת נוקשות הידרוג'ל משתנה והערכה של ההשפעה של איתות מכני ב- NCCs. כדי להשיג זאת, O9-1 NCCs מנוצלים כמודל NC כדי ללמוד את ההשפעות והשינויים בתגובה הידרוג'ל נוקשה לעומת רך. O9-1 NCCs הם קו תא NC יציב מבודד מעובר העכבר (E) ביום 8.5. O9-1 NCCs מחקים NCCs ב- vivo מכיוון שהם יכולים להבדיל לסוגי תאים שונים שמקורם ב- NC במדיה מוגדרת של בידול22. כדי לחקור את האיתות המכני של NCCs, מצע מטריצה היה מפוברק עם גמישות טונה מריכוזים שונים של אקרילאמיד ופתרונות ביס-אקרילאמיד כדי להשיג את הנוקשות הרצויה, בקורלציה נוקשות המצע הביולוגי20,21,23. כדי למטב את התנאים של מצע מטריצה עבור NCCs, במיוחד תאי O9-1, שינויים נעשו מפרוטוקול20שפורסם בעבר . שינוי אחד שנעשה בפרוטוקול זה היה לדגור על הידרוג'לים בקולגן I, מדולל ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES, ב 37 °C (57 °F) לילה. ה- pH הנמוך של חומצה אצטית מוביל להפצה הומוגנית ושילוב קולגן I גבוה יותר, ובכך מאפשר התקשרות אחידה יותר של חלבון ECM24. בנוסף, שילוב של סרום סוס סרום בקר עוברי (FBS) שימש בריכוזים של 10% ו 5% מלוחים חוצץ פוספט (PBS), בהתאמה, לפני אחסון הידרוג'ל באינקובטור. סרום סוס שימש כתוספת נוספת FBS בשל יכולתו לקדם התפשטות תאים ובידול בריכוז של 10%25.
בשיטה זו, סביבה ביולוגית חיקה על ידי ציפוי חלבון ECM (למשל, קולגן I) כדי ליצור סביבת במבחנה מדויקת עבור NCCs לגדול ולשרוד20,21. נוקשות ההידרוגלים המוכנים נותחה כמותית באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), טכניקה ידועה לתיאור המודולוס האלסטי26. כדי לחקור את ההשפעה של רמות נוקשות שונות על NCCs, תאי O9-1 מסוג בר היו בתרבית והוכנו על הידרוג'לים עבור immunofluorescence (IF) מכתים נגד actin filamentous (F-actin) כדי להראות את ההבדלים הידבקות תאים ומורפולוגיות בתגובה לשינויים נוקשות מצע. תוך שימוש במערכת במבחנה זו, החוקרים יוכלו לחקור את התפקידים של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים אחרים כדי לקבל הבנה עמוקה יותר של היחסים בין NCCs ואיתות מכני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם תאים רב-תכליתיים עובריים בעלי חוליות שיכולים לנדוד ולהבדיל למגוון רחב של סוגי תאים המעוררים איברים ורקמות שונים. נוקשות רקמות מייצרת כוח מכני, סימן פיזי הממלא תפקיד קריטי בבידול NCC; עם זאת, המנגנון עדיין לא ברור. השיטה המתוארת כאן מספקת מידע מפורט עבור הדור הממוטב של הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה, מדידה מדויקת של נוקשות כזו, ואת ההערכה של ההשפעה של אותות מכניים בתאי O9-1, קו NCC המחקה ב NCCs vivo.
נוקשות הידרוג'ל נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והצביעה על רמות נוקשות שונות בהתאם. O9-1 NCCs תרבית על הידרוג'לים של נוקשות משתנה הראה מורפולוגיה תאים שונים ביטוי גנים של סיבי מתח, אשר הצביעו על השפעות ביולוגיות שונות הנגרמות על ידי שינויים באותות מכניים. יתר על כן, זה קבע כי שינוי נוקשות הידרוג'ל הביא מערכת במבחנה יעילה כדי לתפעל איתות מכני על ידי שינוי נוקשות ג'ל וניתוח הרגולציה המולקולרית והגנטית ב NCCs. O9-1 NCCs יכול להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים תחת השפעת מדיית הבידול המתאימה, וזה נוח לתפעל אותות כימיים במבחנה. לכן, מערכת במבחנה זו היא כלי רב עוצמה לחקור את התפקיד של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים, אשר יסייע לחוקרים להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות ציצית עצבית ומחלות.

הכנת הידרוג'ל והערכת נוקשות באמצעות AFM ומודל הרץ כאן, פרוטוקול מפורט מסופק כדי ליצור הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה על ידי ויסות היחס של אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד. עם זאת, הידרוג'לים polyacrylamide אינם מוכנים להידבקות של תאים בשל היעדר חלבוני ECM. לכן, סולפו-SANPAH, הפועל כמקשר, נקשר באופ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

השיטה מסייעת בחקר האיתות המכני של תאי הסמל העצבי והאינטראקציה שלו עם אותות כימיים. זה יכול גם לסייע במנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות הסמל העצבי במחלות. העברת פתקי כיסוי הזכוכית היא המאתגרת ביותר ולכן מעבירים אותם לאט ובתשומת לב כדי למנוע שבירה והורדתם.אם נדגים את ההליך, אני וד"ר שרי זאו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל על ידי הצבת המספר הרצוי של כיסוי זכוכית מחליק על פיסת מגבון מעבדה. לאחר מכן לעקר כל פיסת כיסוי על ידי העברתו הלוך ושוב דרך הלהבה של מבער האלכוהול.כאשר החלקות הכיסוי מתקררות, מכסים את החלקת הכיסוי של 12 מ"מ עם כ -200 מיקרוליטרים וכיסוי 25 מ"מ להחליק עם 800 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת. לאחר חמש דקות, לשאוף נתרן הידרוקסיד ולאפשר את החלקות הכיסוי לאוויר יבש במשך חמש דקות כדי ליצור סרט אחיד. לאחר כיסוי החלקות מיובשים, להוסיף כ 18 microliters של אמינופרופיל triethoxysilane או APTS על תלוש כיסוי 12 מילימטר ו 150 microliters של APTS על תלוש כיסוי 25 מילימטר.שאפו גישה APTS כדי לאפשר APTS שיורית להתייבש במשך חמש דקות. מאוחר יותר, לשטוף את כיסוי מחליק שלוש פעמים על ידי שקוע אותם במים deionized סטרילי במשך חמש דקות בכל פעם. מעבירים את פתקי הכיסוי השטופים לצלחת פטרי טרייה כשהצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה.ולטפל בתלושי הכיסוי על ידי השריה במספיק 0.5% גלוטרדהיד במשך 30 דקות. לאחר שאיפת glutaraldehyde, לשטוף את החלקות הכיסוי פעם אחת עם מים deionized במשך שלוש דקות אוויר יבש את הכיסוי מחליק עם הצד תגובתי למעלה. כדי להכין את כיסוי סיליקון מחליק, מניחים את המספר השווה של פתקי כיסוי כמו כי aminosilane מצופה כיסוי מחליק בצלחת פטרי מרופד בסרט para.לאחר מכן, לטפל 12 מילימטר כיסוי מחליק עם 40 microliters 25 מילימטר כיסוי מחליק עם 150 microliters של סילאן דיכלורומתאן או DCMS במשך חמש דקות. לשטוף את כיסוי מחליק עם מים deionized סטרילי פעם אחת במשך דקה אחת לפני הנחת כיסוי תגובתי מחליק עם הפנים כלפי מעלה על מגבון מעבדה. כדי להכין את ההידרוג'ל, פיפטה מוכנה טרי פתרון ג'ל אקרילאמיד על החלקי כיסוי מצופים aminosilane מיובש.באמצעות פינצטה מעוקלת, העבר מיד את החלק הכיסוי המטופל DCMS על גבי פתרון הג'ל כאשר הצד המטופל נוגע בתמיסת הג'ל ובכך סנדוויץ ' לשנות את פתרון הג'ל בין שתי תלושי כיסוי. לאחר הג'ל הוא פולימר, להפריד את DCMS מטופל כיסוי להחליק עם פינצטה מעוקלת, משאיר את הג'ל מחובר לכיסוי מצופה aminosilane. לאחר מכן, שקועים בתלוש הכיסוי של 12 מ"מ עם ההידרוג'ל המצורף בלוח קבוע מראש של 4 בארות או 24 בארות המכוסה ב-500 מיקרוליטרים של PBS סטריליים או מים שעברו דה-תיופח, וכיסוי 25 מ"מ בצלחת של 6 בארות מכוסה בשני מיליליטר של PBS סטרילי או מים שעברו דה-תיוין במשך 30 דקות.לאחר הסרת תמיסת אקרילאמיד עודף, לאחסן את hydrogels PBS סטרילי או מים deionized בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מאוחר יותר, שאפו PBS או מים deionized מצלחת הבאר לפני הוספת סולפו-סוקינימידיל או פתרון סולפו-SUNPAH כדי לכסות את הג'ל לחלוטין. ומניחים את הג'לים עם הפתרון תחת 15 וואט, 365 ננומטר אור אולטרה סגול נחשף במשך 10 דקות.לאסוף כמה שיותר של סולפו-SANPAH לכל פתרון ככל האפשר על ידי הטיית הצלחת. ואז לשטוף את הג'ל פעמיים עד שלוש פעמים עם HEPES 15 מילימולר. הוסיפו 15 מיליגרם לקולגן מיליליטר 1 מדולל ב-0.2% חומצה אצטית לכל באר המכילה את ההידרוג'ל.ודגר את הג'לים בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת, בצע את הכביסה כמתואר בכתב היד לפני דגירה הידרוג'ל עם PBS המכיל 10% סרום סוס ו 5% FBS ב 37 צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר שעתיים של דגירה, להוסיף 500 microliters של DMEM מסונן סטרילי עם 10% FBS ו 1%פניצילין סטרפטומיצין לכל באר ולאחסן את הג'לים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כאשר תרבית התא מוכנה, צלחת בערך 1.5 כפול 10 עד הרביעי 09-1 תאים לסנטימטר בריבוע במדיום בזל. השתמש פינצטה כדי להעביר את פתקי הכיסוי לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מהתאים שגדלו ישירות על הצלחת. לאחר מכן, לתקן את התאים באמצעות 500 microliters של 4%paraformaldehyde במשך 10 דקות לפני טיפול בתאים עם 500 microliters של 0.1% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.לאחר 15 דקות, ללכת בתאים עם 250 microliters של סרום חמור 10%. להכתים את התאים עבור F-actin עם felodipine בדילול של 1 עד 400 ב 250 microliters של סרום חמור 10%, ואחריו דגירה עם DAPI במשך 10 דקות. לשטוף את התאים עם PBS במשך שתי דקות לפני הוספת שלוש עד ארבע טיפות של הרכבה בינונית לכל באר.במיקרוסקופ פלואורסצנטי, ללכוד את התמונות של לפחות שלוש מסגרות אקראיות לכל מדגם הידרוג'ל לייצר ערוצים בודדים וממוזגים. בהערכת הנוקשות של ההידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי או AFM, השיפוע של עקומת הכוח היה עדין להידרוג'לים רכים מכיוון שהכוח הנדרש מהגשושית AFM היה פחות. עם זאת, על הידרוג'ל נוקשה, המדרון שנוצר היה הרבה יותר תלול.מדידות AFM שימשו אז לחישוב הנוקשות הממוצעת של הידרוג'לים מהמודולות האלסטיות של יאנג בקילפסקלים. מאפייני הצמיחה של תאי P19 ו- 09-1 נצפו בקילפסקיל אחד ו -40 קילופסקל הידרוג'לים של שליטה ומערכות ג'ל מותאמות. 09-1 תאים גדלו על מערכות הג'ל המקוריות הביא מספר גבוה יותר של תאים מתים.לעומת זאת, תאי 09-1 שגדלו במערכות הג'ל המותאמות הציגו צמיחת תאים בריאה וחיבור מספיק למצע ההידרוגלס עם סיפון התא הקטן המצוין על ידי תאים עגולים מינימליים. תאי P19 מצופים בשתי מערכות הידרוג'ל הציגו עודף של תאים צפים עגולים וחוסר קבצים מצורפים למצע התא. התאימות של תאי ציצית עצבית או NCCs עם מערכת הידרוג'ל שונה הוערך על ידי כתמים immunofluorescent עבור AP-2.נצפתה עלייה משמעותית בביטוי AP-2 בתאי 09-1 מצופים במערכת ההידרוג'ל שהשתנתה. בנוסף, 09-1 תאים הציגו morphologies שונים המבוססים על הידרוג'ל נוקשות נמוכה או גבוהה באמצעות כמויות שונות של סיבי הלחץ. הביטוי האנטי-וינקולין בתאי 09-1 שגדלו על הידרוג'ל 40 קילופסקל היה גבוה יותר מאלה שגדלו על הידרוג'ל קילופסקל אחד המשקף כי התאים הגדלים על מצעים רכים יותר יוצרים מתחמי תוספת מוקד מינימליים מאשר המצע נוקשה.זמן המתנה מתאים הוא חיוני עבור פילמור של הידרוג'ל כמו אקרילאמידים רעילים לתאים. שקועים הידרוג'ל ב- PBS או במים שעברו דה-יונים למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח תוצאות טובות יותר.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...