Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

हम इस परियोजना में AFM में योगदान विशेषज्ञता के लिए, टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में परमाणु बल माइक्रोस्कोप-यूटी कोर सुविधा के ऑपरेटर डॉ एना-मारिया Zaske का शुक्रिया अदा करते हैं । हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704, और R01HL142704 से जे वांग) के वित्तपोषण स्रोतों का भी धन्यवाद देते हैं।

1. हाइड्रोजेल तैयारी
नोट: सभी चरणों को सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए जिसे बंध्यता बनाए रखने के लिए उपयोग से पहले इथेनॉल और पराबैंगनी (यूवी) से कीटाणुरहित किया गया है। चिमटी और पिपेट जैसे उपक...

वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य एनसीसी में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक प्रभावी और कुशल इन विट्रो प्रणाली प्रदान करना है । ऊपर उल्लिखित कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का पालन करने के अ?...

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुकी भ्रूणजेनेसिस के दौरान स्टेम कोशिकाओं का एक समूह है जिसमें विभिन्न अंगों और ऊतकों के विकास में माइग्रेट करने और योगदान करने की उल्लेखनीय क्षमता है। एनसीसी अक्षीय मूल के स्थान और एनसीसी1,2के स्थानीय पर्यावरणीय मार्गदर्शन के आधार पर संवेदी न्यूरॉन्स, उपास्थि, हड्डी, मेलानोसाइट्स और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं। कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर करने की क्षमता के साथ, तंत्रिका क्रेस्ट (एनसी) विकास के किसी भी चरण में डिस्रेगुलेशन का कारण बनने वाली आनुवंशिक असामान्यताएं कई जन्मजात बीमारियों का कारण बन सकती हैं2। उदाहरण के लिए, एनसीसी के गठन, प्रवास और विकास के दौरान क्षोभ से विकासात्मक विकारों को सामूहिक रूप से न्यूरोक्रिस्टोपैथी1, 3के रूप में जानाजाताहै। ये बीमारियां एनसीसी गठन में विफलता के कारण क्रैनियोफेशियल दोषों से लेकर, जैसे कि टांगर कोलिंस सिंड्रोम, एनसीसी मेटास्टैटिक प्रवासी क्षमता के कारण विभिन्न कैंसर के विकास तक, जैसा कि मेलानोमा3,4,5, 6मेंदेखा गयाहै। पिछले कुछ दशकों में, शोधकर्ताओं ने विकास और रोगों में एनसीसी की भूमिकाओं और तंत्रों के बारे में उल्लेखनीय खोज की है, जिसमें अधिकांश निष्कर्ष रासायनिक संकेतों7,8पर केंद्रित हैं। हाल ही में, यांत्रिक संकेतों को एनसीसी विकास9,10में एक महत्वपूर्ण लेकिन खराब समझ में भूमिका निभाने के लिए संकेत दिया गया है ।
एनसीसी के पर्यावरणीय संकेत उनके विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें विभिन्न सेल प्रकारों में एनसीसी भेदभाव का नियमन शामिल है । पर्यावरणीय संकेत, उदाहरण के लिए, भौतिक संकेत, कार्यात्मक विविधीकरण जैसे निर्णायक व्यवहार और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। मशीनोट्रांजेक्शन कोशिकाओं को विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए उन संकेतों को समझने और उनका जवाब देने की अनुमति देता है2. एनसीसी पड़ोसी कोशिकाओं और विभिन्न सब्सट्रेट्स से घिरे हुए हैं, जैसे कि एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), जो होमोसैटसिस को बनाए रखने और भाग्य निर्धारण, प्रसार और एपोप्टोसिस11के माध्यम से परिवर्तनों के अनुकूल बनाने के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं को जन्म दे सकता है। मेकानोट्रांजेशन प्लाज्मा झिल्ली से शुरू होता है जहां यांत्रिक बाह्य उत्तेजनाओं का संवेदी घटक होता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल12का इंट्रासेलुलर विनियमन होता है। इन्टेग्रिन, फोकल आसंजन, और प्लाज्मा झिल्ली रिले यांत्रिक संकेतों के जंक्शन, जैसे कतरनी बल, तनाव, और आसपास के सब्सट्रेट्स की कठोरता, सेलुलर प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए रासायनिक संकेतों में12। प्लाज्मा झिल्ली से अंतिम सेलुलर विनियमन के लिए रासायनिक संकेतों के रीलिंग विभिन्न संकेत रास्ते के माध्यम से किया जाता है ताकि जीव के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को अंतिम रूप दिया जा सके, जैसे भेदभाव।
कई अध्ययनों से यह पता चला है कि सब्सट्रेट कठोरता से यांत्रिक संकेत कोशिका भेदभाव13,14में भूमिकानिभाताहै । उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क के ऊतकों (0.1-1.0 केपीए की सीमा में) के समान कठोरता के साथ नरम सब्सट्रेट्स पर उगाए जाने वाले मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) के परिणामस्वरूप न्यूरोनल सेल भेदभाव15,16हुआ। हालांकि, अधिक एमएससी 8-17 केपीए पर उगाए जाने पर मायोसाइट जैसी कोशिकाओं में अंतर करते हैं, जबकि ऑस्टियोब्लास्ट जैसे भेदभाव को देखा गया जब एमएससी को कठोर सब्सट्रेट्स (25-40 केपीए)15, 16पर सुसंस्कृत किया गया था। मेकेनोट्रांजडक्शन का महत्व यांत्रिक सिग्नलिंग मार्ग में अनियमितताओं और असामान्यताओं से उजागर होता है जो संभावित रूप से कैंसर, हृदय रोगों औरऑस्टियोपोरोसिस17, 18,19सहित गंभीर विकासात्मक दोषों और बीमारियों का कारणबनताहै। कैंसर में, सामान्य स्तन ऊतक नरम होता है, और स्तन कैंसर का खतरा कठोर और घने स्तन ऊतक में बढ़ जाता है, एक वातावरण जो स्तन ट्यूमर के समान है15। इस ज्ञान के साथ, एनसीसी विकास पर यांत्रिक संकेत के प्रभाव का अध्ययन इन विट्रो सिस्टम के माध्यम से सब्सट्रेट कठोरता के सरल हेरफेर के माध्यम से किया जा सकता है, जो नेकां से संबंधित रोग प्रगति और एटियोलॉजी के बुनियादी सिद्धांतों को समझने में आगे लाभ और संभावनाएं प्रदान करता है।
एनसीसी में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमने एनसीसी के लिए एक कुशल इन विट्रो प्रणाली स्थापित की, जो पहले प्रकाशित तरीकों के अनुकूलन और एनसीसी की प्रतिक्रियाओं के विभिन्न यांत्रिक संकेतों20,21के मूल्यांकन के आधार पर थी । एनसीसी में मैकेनिकल सिग्नलिंग के प्रभाव के हाइड्रोजेल कठोरता तैयारी और मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया था। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, O9-1 एनसीसी का उपयोग एनसी मॉडल के रूप में किया जाता है ताकि कठोर बनाम सॉफ्ट हाइड्रोगेल्स के जवाब में प्रभाव और परिवर्तनों का अध्ययन किया जा सके। O9-1 NCCs एक स्थिर नेकां सेल लाइन माउस भ्रूण (ई) से ८.५ दिन में अलग कर रहे हैं । O9-1 एनसीसी वीवो में एनसीसी की नकल करते हैं क्योंकि वे परिभाषित विभेदन मीडिया22में विभिन्न एनसी-व्युत्पन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं । एनसीसी के यांत्रिक संकेत का अध्ययन करने के लिए, एक मैट्रिक्स सब्सट्रेट को वांछित कठोरता प्राप्त करने के लिए एक्रिलामाइड और बीआईएस-एक्रिलामाइड समाधानों की अलग-अलग सांद्रता से ट्यूनेबल लोच के साथ गढ़ा गया था, जो जैविक सब्सट्रेट कठोरता20,21,23से संबंधित था। एनसीसी, विशेष रूप से O9-1 कोशिकाओं के लिए मैट्रिक्स सब्सट्रेट की शर्तों को अनुकूलित करने के लिए, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल20से संशोधन किए गए थे। इस प्रोटोकॉल में किया गया एक परिवर्तन कोलेजन I में हाइड्रोगेल को इनक्यूबेट करना था, जो रात 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएम एचईपीई के बजाय 0.2% एसिटिक एसिड में पतला था। एसिटिक एसिड के कम पीएच एक सजातीय वितरण और उच्च कोलेजन मैं निगमन की ओर जाता है, इस प्रकार ईसीएम प्रोटीन24के अधिक समान लगाव के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इनक्यूबेटर में हाइड्रोगेल के भंडारण से पहले, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में क्रमशः 10% और 5% की सांद्रता पर घोड़े सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का संयोजन किया गया था। 10%25की एकाग्रता पर सेल प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देने की क्षमता के कारण घोड़े सीरम का उपयोग एफबीएस के अतिरिक्त पूरक के रूप में किया जाता था ।
इस विधि के साथ, एनसीसी के विकास और जीवित रहने के लिए20, 21के विकास और जीवित रहने के लिए ईसीएम प्रोटीन कोटिंग (जैसे, कोलेजन I) द्वारा एक जैविक वातावरण की नकल की गई थी। तैयार हाइड्रोगेल की कठोरता का मात्रात्मक रूप से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था, जो लोचदार मॉड्यूलस26को चित्रित करने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है। एनसीसी पर विभिन्न कठोरता के स्तर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के लिए हाइड्रोगेल पर तैयार किया गया था, जो सबस्ट्रेट कठोरता में परिवर्तन के जवाब में सेल आसंजन और मोर्फोलोजी में अंतर दिखाने के लिए फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) के खिलाफ धुंधला था। इस इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग की भूमिकाओं और एनसीसी और यांत्रिक सिग्नलिंग के बीच संबंधों की गहरी समझ हासिल करने के लिए अन्य रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने में सक्षम होंगे।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुकी भ्रूणीय बहुपंत कोशिकाएं हैं जो विभिन्न अंगों और ऊतकों को जन्म देने वाली कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में स्थानांतरित और अंतर कर सकती हैं। ऊतक कठोरता यांत्रिक बल, एक शारीरिक क्यू है कि एनसीसी भेदभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पैदा करता है; हालांकि, तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है । यहां वर्णित विधि अलग-अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोगेल के अनुकूलित उत्पादन, ऐसी कठोरता की सटीक माप और O9-1 कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का मूल्यांकन, एक एनसीसी लाइन है जो वीवो एनसीसी में नकल करती है, के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करती है।
हाइड्रोजेल कठोरता को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके मापा गया था और तदनुसार विभिन्न कठोरता के स्तर का संकेत दिया गया था। अलग-अलग कठोरता के हाइड्रोगेल पर सुसंस्कृत O9-1 एनसीसी ने विभिन्न सेल आकृति विज्ञान और तनाव फाइबर की जीन अभिव्यक्ति दिखाई, जिसने यांत्रिक संकेत परिवर्तनों के कारण विभिन्न जैविक प्रभावों का संकेत दिया। इसके अलावा, इसने स्थापित किया कि हाइड्रोजेल कठोरता को अलग-अलग करने के परिणामस्वरूप जेल कठोरता में फेरबदल करके यांत्रिक संकेतों में हेरफेर करने और एनसीसी में आणविक और आनुवंशिक विनियमन का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल के परिणामस्वरूप। O9-1 NCCs इसी भेदभाव मीडिया के प्रभाव में सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर कर सकते हैं, और विट्रो मेंरासायनिक संकेतों में हेरफेर करना सुविधाजनक है। इसलिए, यह इन विट्रो प्रणाली एनसीसी में यांत्रिक सिग्नलिंग की भूमिका और रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो शोधकर्ताओं को तंत्रिका क्रेस्ट विकास और रोगों के आणविक और आनुवंशिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगा।

एएफएम और हर्ट्ज मॉडल के माध्यम से हाइड्रोजेल तैयारी और कठोरता मूल्यांकन यहां, एक्रिलैमाइड और बीआईएस-एक्रिलैमाइड के अनुपात को विनियमित करके अलग-अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोगेल उत्प...

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An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल यहां बहुपेंट O9-1 तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलैमाइड हाइड्रोगेल का उपयोग करके विट्रो में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए वर्णित हैं।

तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलित O9-1/हाइड्रोजेल सिस्टम

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

विधि तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के यांत्रिक संकेत और रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत के अध्ययन में एड्स । यह रोगों में तंत्रिका शिखा विकास के आणविक और आनुवंशिक तंत्र में भी सहायता कर सकता है। ग्लास कवर स्लिप को स्थानांतरित करना सबसे चुनौतीपूर्ण है इसलिए उन्हें तोड़ने और छोड़ने से रोकने के लिए धीरे-धीरे और ध्यान से स्थानांतरित करें।प्रक्रिया का प्रदर्शन मुझे और डॉ शेरी Zhao, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्टडॉक्टोरल फेलो होगा । प्रयोगशाला पोंछ के एक टुकड़े पर कांच कवर फिसल जाता है की वांछित संख्या रखकर शुरू करते हैं। फिर शराब बर्नर की लौ के माध्यम से इसे आगे और पीछे से गुजर कर प्रत्येक कवर स्लिप को निष्फल करें।जब कवर ठंडा हो जाता है, तो लगभग 200 माइक्रोलीटर और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप के साथ 0.1 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के 800 माइक्रोलीटर के साथ 12 मिलीमीटर कवर स्लिप को कवर करें। पांच मिनट के बाद, सोडियम हाइड्रोक्साइड को एस्पिरेट करें और कवर स्लिप को पांच मिनट के लिए सूखी हवा में जाने दें ताकि एक भी फिल्म बनाई जा सके । एक बार कवर स्लिप सूख जाने के बाद, 12 मिलीमीटर कवर स्लिप पर अमीनोप्रोपिल ट्राइएथॉक्सीलेन या एपीटीएस के लगभग 18 माइक्रोलीटर और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप पर एपीटीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।अवशिष्ट एपीटीएस को पांच मिनट तक सूखने की अनुमति देने के लिए एक्सेस एपीटीएस का उपयोग करें। बाद में, कवर स्लिप को हर बार पांच मिनट के लिए बाँझ डिएक्रिल पानी में जलमग्न करके तीन बार कुल्ला करें। धोया कवर स्लिप को प्रतिक्रियाशील पक्ष के साथ एक ताजा पेट्री डिश में ले जाएं।और 30 मिनट के लिए पर्याप्त 0.5% ग्लूटारल्डिहाइड में भिगोकर कवर स्लिप का इलाज करें। ग्लूटारल्डिहाइड को एस्पिराल्ड के बाद, कवर स्लिप को तीन मिनट के लिए डियोनाइज्ड पानी के साथ कुल्ला करें और हवा में प्रतिक्रियाशील पक्ष के साथ कवर स्लिप सूखी हो। सिलिकॉन कवर स्लिप तैयार करने के लिए, कवर स्लिप की बराबर संख्या रखें क्योंकि पैरा फिल्म के साथ लाइन में लगी पेट्री डिश में अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप होती है।इसके बाद 12 मिलीमीटर कवर स्लिप को 40 माइक्रोलीटर के साथ और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप को 150 माइक्रोलीटर डाइक्लोरोमेथेन सिलेन या डीसीएमएस के साथ पांच मिनट तक ट्रीट करें। एक मिनट के लिए एक बार बाँझ deionized पानी के साथ कवर स्लिप धोने से पहले प्रतिक्रियाशील कवर पर्चियों रखने से पहले एक प्रयोगशाला पोंछ पर चेहरा । हाइड्रोगेल्स तैयार करने के लिए, सूखे अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप पर पिपेट ने ताजा तैयार एक्रिलामाइड जेल समाधान किया।घुमावदार चिमटी का उपयोग करके, तुरंत जेल समाधान के शीर्ष पर डीसीएमएस इलाज कवर स्लिप को स्थानांतरित करें, जिसमें जेल समाधान को छूने वाले पक्ष के साथ इस प्रकार सैंडविचिंग दो कवर स्लिप के बीच जेल समाधान को बदल देता है। एक बार जेल बहुलक होने के बाद, घुमावदार चिमटी के साथ डीसीएमएस इलाज कवर स्लिप को अलग करें, जिससे अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप से जुड़े जेल को छोड़ दिया जाए। इसके बाद, एक पूर्व निर्धारित 4-अच्छी तरह से या 24-अच्छी तरह से बाँझ PBS या deionized पानी के ५०० माइक्रोलीटर के साथ कवर प्लेट में संलग्न हाइड्रोजेल के साथ 12 मिलीमीटर कवर पर्ची जलमग्न और एक 6 अच्छी तरह से बाँझ PBS या 30 मिनट के लिए deionized पानी के दो मिलीलीटर के साथ कवर प्लेट में 25 मिलीमीटर कवर पर्ची ।अतिरिक्त एक्रिलैमाइड समाधान को हटाने के बाद, हाइड्रोगेल्स को बाँझ पीबीएस या कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पानी को डिवोनाइज्ड स्टोर करें। बाद में, जेल को पूरी तरह से कवर करने के लिए सल्फो-सक्सिनीमिडिल या सल्फो-सनपा समाधान जोड़ने से पहले पीबीएस या कुएं की प्लेट से पानी को अपमानित करें। और 15 वाट के तहत समाधान के साथ जैल रखें, 365 नैनोमीटर पराबैंगनी प्रकाश 10 मिनट के लिए खुला।प्लेट को झुकाकर जितना संभव हो सके प्रति घोल सल्फो-सैंपाएच का जितना हिस्सा इकट्ठा करें। और फिर 15 मिलीमोलर एचईपी के साथ दो से तीन बार जेल धोएं। हाइड्रोगेल युक्त प्रत्येक कुएं में 0.2% एसिटिक एसिड में पतला मिलीलीटर कोलेजन 1 प्रति मिलीलीटर 1 जोड़ें।और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर रात भर जैल इनक्यूबेट । अगले दिन, 37 सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 10% घोड़े सीरम और 5% एफबीएस वाले पीबीएस के साथ हाइड्रोगेल्स को इनक्यूबेट करने से पहले पांडुलिपि में वर्णित वॉश करें। दो घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ बाँझ फ़िल्टर किए गए डीएमईएम के 500 माइक्रोलीटर को प्रत्येक कुएं में जोड़ें और जैल को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर स्टोर करें।जब सेल संस्कृति तैयार होती है, तो लगभग 1.5 गुना 10 से चौथे 09-1 कोशिकाओं को बाज़ेल माध्यम में चुकता किया जाता है। प्लेट पर सीधे उगाई जाने वाली कोशिकाओं से झूठे संकेतों को कम करने के लिए कवर स्लिप को एक नई प्लेट में परिवहन करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फिर, कमरे के तापमान पर 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं के इलाज से पहले 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें।15 मिनट के बाद, 10% गधे सीरम के 250 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को चलें। 10% गधे सीरम के 250 माइक्रोलीटर में 1 से 400 के कमजोर पड़ने पर फेलोडिपाइन के साथ एफ-ऐक्टिन के लिए कोशिकाओं को दाग दें, इसके बाद 10 मिनट के लिए DAPI के साथ इनक्यूबेशन। प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ते माध्यम की तीन से चार बूंदें जोड़ने से पहले दो मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं ।फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर, व्यक्तिगत और विलय चैनलों का उत्पादन करने वाले हाइड्रोगेल नमूने के अनुसार कम से कम तीन यादृच्छिक फ्रेम की छवियों को कैप्चर करें। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी या एएफएम के माध्यम से हाइड्रोजेल के कठोरता आकलन में, बल वक्र की ढलान नरम हाइड्रोगेल के लिए कोमल थी क्योंकि एएफएम जांच से आवश्यक बल कम था। हालांकि, कड़े हाइड्रोगेल पर, उत्पन्न ढलान बहुत अधिक था।एएफएम माप का उपयोग किलोपास्कल में युवा के लोचदार मॉड्यूल से हाइड्रोगेल्स की औसत कठोरता की गणना करने के लिए किया जाता था। पी 19 और 09-1 कोशिकाओं की विकास विशेषताओं को एक किलोपास्कल और 40 किलोपास्कल हाइड्रोगेल में नियंत्रण और संशोधित जेल प्रणालियों में देखा गया। मूल जेल प्रणालियों पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं के परिणामस्वरूप मृत कोशिकाओं की संख्या अधिक होती है।इसके विपरीत संशोधित जेल प्रणालियों पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं ने स्वस्थ कोशिका विकास और हाइड्रोगेल के लिए पर्याप्त लगाव को न्यूनतम गोल कोशिकाओं द्वारा इंगित छोटे सेल डेक के साथ सब्सट्रेट किया। दोनों हाइड्रोजेल सिस्टम पर चढ़ाया P19 कोशिकाओं दौर अस्थाई कोशिकाओं की एक अतिरिक्त और सेल सब्सट्रेट अनुलग्नकों की कमी प्रदर्शित की । संशोधित हाइड्रोजेल प्रणाली के साथ तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं या एनसीसी की अनुकूलता का आकलन एपी-2 के लिए इम्यूनोफ्लोरेटेंट स्टेनिंग द्वारा किया गया था।संशोधित हाइड्रोगेल प्रणाली पर चढ़ाया 09-1 कोशिकाओं में एपी-2 अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई । इसके अतिरिक्त, 09-1 कोशिकाओं ने तनाव फाइबर की अलग-अलग मात्रा के माध्यम से कम या उच्च कठोरता हाइड्रोगेल के आधार पर विभिन्न मॉर्फोलोजी का प्रदर्शन किया। 40 किलोपाल हाइड्रोगेल पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं में एंटी-विनक्यूलिन अभिव्यक्ति एक किलोपास्कल हाइड्रोगेल पर उगाए गए लोगों की तुलना में अधिक थी जो यह दर्शाती है कि नरम सब्सट्रेट्स पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं कठोर सब्सट्रेट की तुलना में न्यूनतम फोकल इसके अलावा परिसर बनाती हैं।हाइड्रोगेल के बहुलीकरण के लिए उपयुक्त प्रतीक्षा समय महत्वपूर्ण है क्योंकि एक्रिलैमाइड कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं। बेहतर परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस या डिपोनाइज्ड पानी में हाइड्रोगेल को कम से कम 30 मिनट के लिए जलमग्न करें।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

एक सह-संस्कृति प्रणाली में neuronal कनेक्शन के गठन का आकलन करने के लिए एक optogenetic दृष्टिकोण

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

चिकजीएफपी न्यूरल ट्यूब ग्राफ्टिंग और कार्बोसाइन डाई डीआईआई इंजेक्शन का उपयोग करके चिकन भ्रूण के भीतर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

बेसिक और preclinical अनुसंधान के लिए एक संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली में मानव pluripotent और तंत्रिका स्टेम सेल संवर्धन

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

मैकेनिकल टिशू डिसोसिएशन और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा स्तनधारी नर मृदा कोशिकाओं की बहुपक्षीय शोधन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

विकास में रीयल-टाइम कल्पना करने के लिए बहु फोटॉन समय चूक इमेजिंग: Zebrafish भ्रूण में न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं पलायन का दृश्य

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं के चिकित्सीय प्रत्यारोपण के साथ माउस मस्तिष्क चोट के नियंत्रित Cortical प्रभाव मॉडल

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

तंत्रिका क्रेस्ट सेल Delamination और प्रवास के अध्ययन के लिए माउस से प्राथमिक कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का विच्छेदन, संस्कृति और विश्लेषण

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट मूल आदिपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल का अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...