Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

우리는 이 프로젝트에서 AFM에 기여한 전문 지식을 위해 텍사스 대학 건강 과학 센터의 원자력 현미경-UT 코어 시설의 운영자인 아나 마리아 자스케 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 건강의 국가 학회 (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704, 및 R01HL142704에서 J. Wang)의 자금 출처에 감사드립니다.

1. 하이드로겔 준비
참고: 모든 단계는 멸균을 유지하기 위해 사용하기 전에 에탄올과 자외선(UV)에 소독된 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 핀셋과 파이펫과 같은 도구는 에탄올로 분사되어야 합니다. 버퍼 솔루션도 멸균 필터링되어야 합니다.
<ol><li>아미노살란 코팅 유리 커버립의 준비<ol>
<li>원하는 수의 유리 커버립을 실험실 닦아 조각에 놓습니다. 참고: 3-4 커버?...

현재 연구의 목표는 NNC에서 기계적 신호의 영향을 더 잘 이해하기 위해 효과적이고 효율적인 체외 시스템을 제공하는 것입니다. 위에서 언급한 단계별 프로토콜을 따르는 것 외에도, 연구자들은 O9-1 NcC의 세포 배양이 하이드로겔을 준비하는 데 사용되는 유리 커버립의 유형에 의해 영향을 받는다는 것을 명심해야 합니다. 예를 들어, 특정 유형의 유리 커버슬립(재료 표 참조)에 시드된 세포...

신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기및 조직의 개발에 기여하고 마이그레이션하고 기여하는 놀라운 능력을 가진 척추 동물 배아 발생 시 줄기 세포의 그룹입니다. NCC는 감각 뉴런, 연골, 뼈, 멜라닌세포 및 원활한 근육 세포를 포함한 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 축 기원의 위치와 NCC1,2의 국소 환경 지침에 따라 분화할 수있다. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력으로, 신경 문장(NC) 발달단계에서 난독증을 유발하는 유전적 이상이 수많은 선천성 질환으로 이어질 수있다 2. 예를 들어, NcC의 형성, 이동 및 발달 중 의 혼란은 신경근증증1,3로통칭되는 발달 장애로 이어진다. 이러한 질병은 트리처 콜린스 증후군과 같은 NCC 형성의 실패로 인한 두개골 면결에서 부터 흑색종3,4,5,6에서볼 수 있듯이 NCC 전이성 철새 능력으로 인한 다양한 암의 발달에 이르기까지 다양하다. 지난 수십 년 동안, 연구원은 개발 및 질병에 있는 NcC의 역할 그리고 기계장치에 관하여 현저한 발견을 했습니다, 사실 인정의 대다수는 화학신호에집중되고 있는7,8. 최근에는 NCC 개발9,10에서기계적 신호가 중요하지만 제대로 이해되지 않은 역할을 하도록 지시되었습니다.
NCC의 환경 단서는 다양한 세포 유형으로 NCC 분화의 규제를 포함하여 개발 중에 중요한 역할을합니다. 환경 단서, 예를 들어, 물리적 단서, 기능 적 다양화와 같은 중추적 인 행동 및 세포 반응에 영향을 미칩니다. 메카노트랜스듀션은 세포가 다양한 생물학적 과정을 유지하기 위해 이러한 단서를 감지하고 반응할 수있도록 2. NCC는 세포외 매트릭스(ECM)와 같은 주변 세포 및 상이한 기판에 둘러싸여 있어 항상성을 유지하고 운명 결정, 증식 및 세포멸을 통해 변화에 적응하기 위해 기계적 자극을 야기할 수있다. 메카노트랜스듀션은 기계적 세포외 자극의 감각 성분이 발생하는 플라즈마 멤브레인에서 시작하여세포(12)의세포내 조절을 초래한다. 플라즈마 멤브레인의 통합, 초점 접착 및 접합부는 전단력, 응력 및 주변 기판의 강성과 같은 기계적 신호를 화학 신호로 전달하여 세포반응(12)을생성한다. 플라즈마 멤브레인에서 최종 세포 조절에 이르는 화학 신호의 릴레이는 분화와 같은 유기체에 대한 중요한 프로세스를 마무리하기 위해 상이한 신호 경로를 통해 수행됩니다.
몇몇 연구 결과는 기질 강성에서 기계신호가 세포 분화13,14에있는 역할을 한다는 것을 건의했습니다. 예를 들어, 이전 연구는 뇌 조직의 강성과 연약한 기판에서 자란 중간엽 줄기 세포(MSC)가 뇌 조직(0.1-1.0 kPa 범위)과 유사한 강성을 가진 것으로 나타났으며, 그 결과 뉴런 세포분화(15,16)가발생한것으로 나타났다. 그러나, 더 많은 MSC는 근육의 강성을 모방8-17 kPa 기판에 성장할 때 근구와 같은 세포로 분화하고, MSC가 뻣뻣한 기판 (25-40 kPa)에 배양될 때 골세포와 같은 분화를 관찰하였다15,16. 메카노트랜스덕션의 중요성은 잠재적으로 암, 심혈관 질환 및골다공증17,18,19를포함한 심각한 발달 결함 및 질병으로 이어질 수 있는 기계적 신호 경로의 요철 및 이상에 의해 강조된다. 암에서는 정상적인 유방 조직이 연약하며 유방암의 위험은 뻣뻣하고 조밀한 유방 조직에서 증가하며, 유방 종양에 더 유사한환경(15). 이러한 지식을 바탕으로 NCC 발달에 대한 기계적 신호의 효과는 체외 시스템을 통해 기질 강성의 간단한 조작을 통해 연구될 수 있으며, NC 관련 질병 진행 및 병인학의 기초를 이해하는 데 있어 추가적인 이점과 가능성을 제공한다.
NcC에서 기계 신호의 영향을 연구하기 위해, 우리는 이전에 발표 된 방법의 최적화및 다른 기계적신호20,21에대한 NcC의 응답의 평가를 기반으로 NcC에 대한 효율적인 시험관 시스템을 설립했다. 다양한 하이드로겔 강성 제제 및 NNC에서 의 기계적 신호의 영향에 대한 평가를 위한 상세한 프로토콜이 제공되었습니다. 이를 위해 O9-1 NCC는 NC 모델로 활용되어 경직대 소프트 하이드로겔에 대한 반응으로 효과와 변화를 연구한다. O9-1 NCC는 8.5일째에 마우스 배아(E)로부터 분리된 안정적인 NC 세포주이다. O9-1 NcC는 정의된 분화매체(22)에서다양한 NC 유래 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 생체 내에서 NcC를 모방한다. NcC의 기계적 신호를 연구하기 위해, 매트릭스 기판은 생물학적기질 강성(20,21,23)과상관관계가 있는 원하는 강성을 달성하기 위해 아크릴아미드및 비스 아크릴아미드 용액의 다양한 농도로부터 튜닝 가능한 탄성으로 제조되었다. NcC, 특히 O9-1 셀에 대한 매트릭스 기판의 조건을 최적화하기 위해 이전에 게시된프로토콜(20)에서수정하였다. 이 프로토콜에서 한 가지 변화는 콜라겐 I에서 하이드로겔을 배양하는 것이었는데, 50m HEPES 대신 0.2% 아세트산으로 희석되어 하룻밤 사이에 37°C에서 이루어졌다. 아세트산의 낮은 pH는 균일한 분포와 더 높은 콜라겐 I 통합으로 이어지므로 ECM단백질(24)의보다 균일한 부착을 가능하게 한다. 또한, 말 혈청과 태아소 혈청(FBS)의 조합은 인큐베이터에 하이드로겔을 저장하기 전에 인산염 완충식염수(PBS)에서 각각 10% 및 5%의 농도에서 사용되었다. 말 혈청은 10%25의농도에서 세포 증식 및 분화를 촉진하는 능력으로 인해 FBS에 대한 추가 보충제로 사용되었다.
이 방법으로, 생물학적 환경은 ECM 단백질 코팅(예를 들어, 콜라겐 I)에 의해 모방되어NcC가 20,21로성장하고 생존할 수 있는 정확한 체외 환경을 조성하였다. 준비된 하이드로겔의 강성은 탄성 계수를 묘사하는 잘 알려진 기술인 원자력 현미경검사(AFM)를통해 정량적으로 분석되었다. NcC에 대한 상이한 강성 수준의 효과를 연구하기 위해 야생형 O9-1 세포는 기판 강성의 변화에 대응하여 세포 접착및 형태학의 차이를 보여주기 위해 면역형 형광(IF)을 위한 하이드로겔에 배양및 제조되었다. 이 체외 시스템을 활용하여 연구자들은 NcC에서 기계 신호의 역할과 다른 화학 신호와의 상호 작용을 연구하여 NcC와 기계 신호 사이의 관계를 더 깊이 이해할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기와 조직을 초래하는 세포 모형의 넓은 배열로 이동하고 분화할 수 있는 척추동물 배아 다능성 세포입니다. 조직 강성은 NCC 분화에서 중요한 역할을 하는 물리적 인 단서인 기계적 힘을 생성합니다. 그러나 메커니즘은 불분명합니다. 여기에 설명된 방법은 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 최적화된 생성, 이러한 강성의 정확한 측정, 그리고 생체 내 를 모방하는 NCC 라인인 O9-1 셀에서 기계적 신호의 영향 평가를 위한 상세한 정보를 제공한다.
하이드로겔 강성은 원자력 현미경검사(AFM)를 사용하여 측정되었으며 그에 따라 상이한 강성 수준을 나타냈다. 다양한 강성의 하이드로겔에 배양된 O9-1 NcC는 기계적 신호 변화로 인한 다양한 생물학적 효과를 나타내는 스트레스 섬유의 세포 형태와 유전자 발현을 상이하게 나타냈다. 더욱이, 하이드로겔 강성을 변화시켜 젤 강성을 변경하고 NcC의 분자 및 유전적 규제를 분석함으로써 기계적 신호를 조작하는 효율적인 체외 계통이 발생한다는 것을 확립했습니다. O9-1 NcC는 해당 분화 매체의 영향으로 광범위한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 생체 내에서화학 신호를 조작하는 것이 편리하다. 따라서, 이 체외 시스템은 NNC에서 기계 신호의 역할과 화학 신호와의 상호 작용을 연구하는 강력한 도구이며, 이는 연구원이 신경 문장 발달 및 질병의 분자 및 유전 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다.

AFM 및 Hertz 모델을 통한 하이드로겔 제제 및 강성 평가 여기서, 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 비율을 조절함으로써 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 그러나, 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 ECM 단백질의 부족으로 인한 세포의 접착을 위한 준비가 되어 있지 않다. 따라서, 설포-SANPAH는, 링커로서 작용하는, 하이드로...

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An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

이 방법은 신경 문장 세포의 기계적 신호 및 화학 신호와의 상호 작용에 대한 연구를 돕습니다. 그것은 또한 질병에 있는 신경 문장 발달의 분자 그리고 유전 기계장치에 원조할 수 있습니다. 유리 커버 전표를 옮기는 것이 가장 어렵기 때문에 깨지고 떨어뜨리는 것을 방지하기 위해 천천히 세심하게 옮기는 것이 가장 어렵습니다.절차를 시연하는 것은 저와 제 실험실의 박사 후 연구원인 셰리 자오 박사가 될 것입니다. 먼저 원하는 수의 유리 커버 전표를 실험실 닦아 조각에 놓는 것으로 시작합니다. 그런 다음 각 커버 슬립을 알코올 버너의 불꽃을 앞뒤로 전달하여 소독합니다.커버가 식으면 약 200 마이크로리터와 25mm 커버 슬립으로 12mm 커버 슬립을 덮고 800 마이크로리터의 수산화나트륨을 덮습니다. 5분 후, 수산화 나트륨을 흡인시키고 커버가 5분 동안 공기가 건조하여 균일한 필름을 형성하도록 합니다. 커버 슬립이 건조되면, 12mm 커버 슬립에 약 18 마이크로리터의 아미노프로필 트리톡시실란 또는 APTS를 추가하고 25mm 커버 슬립에 APTS 150 마이크로리터를 추가합니다.잔류 APTS가 5분 동안 건조할 수 있도록 APTS에 액세스합니다. 나중에 커버를 세 번 헹구면 매번 5분 동안 멸균 된 탈온 물에 잠급됩니다. 씻은 커버 슬립을 신선한 페트리 요리로 옮기고 반응성이 있는 면을 향하게 합니다.그리고 30 분 동안 충분한 0.5 %의 글루타랄데히드에 담그어 커버 슬립을 처리합니다. 글루타랄데히드를 한 번 헹구고, 3분 동안 산화된 물로 뚜껑을 헹구고, 공기가 반응성 쪽으로 덮개 미끄러짐을 건조시합니다. 실리콘 커버 슬립을 준비하려면, 파라 필름이 늘어선 페트리 접시에 아미노실란 코팅 커버 슬립과 동일한 수의 커버 슬립을 놓습니다.그런 다음 12mm 커버 슬립에 40 마이크로리터와 25mm 커버 슬립을 디클로로메탄 실레인 또는 DCMS 150 마이크로리터로 5분간 처리합니다. 커버 슬립을 멸균 된 물로 1 분 동안 한 번 씻은 후 반응형 커버 슬립을 실험실 닦아에 향하게하십시오. 하이드로겔을 준비하기 위해, 파이펫은 말린 아미노실란 코팅 커버 슬립에 갓 준비된 아크릴아미드 젤 용액을 장착했습니다.곡선 핀셋을 사용하여, 즉시 젤 용액위에 DCMS 처리 커버 슬립을 전달하여 젤 용액을 만지는 처리된 측으로 두 개의 커버 슬립 사이에 젤 용액을 변경합니다. 젤이 중합되면 DCMS 처리 커버 슬립을 곡선 핀셋으로 분리하여 아미노인 코팅 커버 슬립에 부착된 젤을 남깁니다. 다음으로, 소정의 4웰 또는 24웰 플레이트에 부착된 하이드로겔로 12mm 커버 슬립을 침수하여 멸균 PBS 또는 탈온화 된 물 500 마이크로 리터로 덮여 있으며 25 mm 커버 슬립은 멸균 PBS 또는 탈온 화 물 2 밀리리터로 덮인 6 웰 플레이트에 미끄러집니다.과도한 아크릴아미드 용액을 제거한 후, 하이드로겔을 멸균 PBS 또는 탈온수에 30분 동안 보관하십시오. 나중에, 젤을 완전히 커버하기 위해 Sulfo-succinimydyl 또는 Sulfo-SUNPAH 용액을 추가하기 전에 우물 판에서 PBS 또는 탈이온된 물을 흡인한다. 그리고 15 와트, 365 나노 미터 자외선 아래 용액으로 젤을 10 분 동안 덮어 놓습니다.플레이트를 기울여 용액당 가능한 한 많은 Sulfo-SANPAH를 수집합니다. 그리고 15 밀리몰러 HEPES로 젤을 2~ 3회 세척합니다. 밀리리터 콜라겐 1당 15밀리그램을 0.2%의 아세트산으로 희석하여 하이드로겔을 함유하고 있는 각 웰에 추가합니다.그리고 밤새 젤을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날, 원고에 설명된 대로 세척을 수행한 후 PBS로 하이드로겔을 배양하기 전에 37°C와 이산화탄소 5%에 10%의 말 세럼과 5%의 FBS를 함유하고 있습니다. 2시간 동안 배양한 후, 멸균 걸러진 DMEM 500마이크로리터를 각각 10%의 FBS와 1%페니실린 연쇄상 구균에 넣고 젤을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 보관합니다.세포 배양이 준비되면, 바젤 배지에서 제곱된 제4 09-1 세포에 약 1.5배 10배. 핀셋을 사용하여 덮개 전표를 새 플레이트로 운반하여 플레이트에 직접 자라는 세포의 거짓 신호를 최소화합니다. 이어서, 실온에서 0.1%트리톤 X-100의 500 마이크로리터로 세포를 치료하기 전에 10분 동안 4%파라포름알데히드의 500마이크로리터를 사용하여 세포를 수정한다.15 분 후, 10 %의 당나귀 세럼의 250 마이크로 리터와 세포를 걸어. 10%의 당나귀 세럼의 250 마이크로리터에서 1~400의 희석시, 10분 동안 DAPI를 사용하여 인큐베이션을 통해 F-actin세포를 염색합니다. PBS로 셀을 2분간 세척한 후 각 웰에 3~4방울의 장착 매체를 추가합니다.형광 현미경에서, 개인 및 병합 채널을 생산하는 하이드로겔 샘플 당 적어도 세 개의 임의 프레임의 이미지를 캡처합니다. 원자력 현미경 또는 AFM을 통한 하이드로겔의 강성 평가에서, AFM 프로브에서 필요한 힘이 적기 때문에 힘 곡선의 경사가 부드러운 하이드로겔에 대해 순화했다. 그러나, 뻣뻣한 하이드로겔에, 생성 된 경사는 훨씬 가파른했다.그런 다음 AFM 측정을 사용하여 킬로파스칼의 Young의 탄성 계측기에서 하이드로겔의 평균 강성을 계산했습니다. P19 및 09-1 세포의 성장 특성은 1킬로파스칼 및 40킬로파스칼 하이드로겔의 제어 및 변형된 젤 시스템에서 관찰되었다. 원래 젤 시스템에서 자란 09-1 세포는 죽은 세포의 높은 수를 초래했다.대조적으로 변형된 겔 시스템에서 자란 09-1 세포는 최소한의 둥근 세포로 표시된 작은 세포 갑판을 가진 하이드로겔 기판에 건강한 세포 성장과 충분한 부착을 나타냈다. 두 하이드로겔 시스템에 도금된 P19 세포는 둥근 부동 셀의 과잉 및 세포 기판 부착물의 부족을 표시했다. 변형된 하이드로겔 시스템과 신경 문장 세포 또는 NcC의 호환성은 AP-2에 대한 면역 형광 염색에 의해 평가되었다.수정된 하이드로겔 계열에 도금된 09-1 세포에서 AP-2 발현의 현저한 증가가 관찰되었다. 또한, 09-1 세포는 다양한 양의 응력 섬유를 통해 저강성 또는 높은 강성 하이드로겔에 기초하여 상이한 형태를 나타냈다. 40킬로파스칼 하이드로겔에서 자란 09-1 세포의 안티빈큘린 발현은 부드러운 기판에서 자란 세포가 뻣뻣한 기판보다 최소한의 초점 추가 복합체를 형성한다는 것을 반영하는 1킬로파스칼 하이드로겔에서 자란 세포보다 높았다.아크릴아미드가 세포에 독성이기 때문에 하이드로겔의 중합화에 적합한 대기 시간이 매우 중요하다. 더 나은 결과를 보장하기 위해 PBS 또는 탈이온 된 물에 하이드로 겔을 30 분 이상 잠급하십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

병아리GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...