Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør for Atomic Force Microscope-UT Core-anlegget ved University of Texas Health Sciences Center, for den medvirkende ekspertisen i AFM i dette prosjektet. Vi takker også finansieringskildene fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).

1. Hydrogel forberedelse
MERK: Alle trinn må utføres i en cellekulturhette som har blitt desinfisert med etanol og ultrafiolett (UV)-sterilisert før bruk for å opprettholde steriliteten. Verktøy, som pinsett og pipetter, må sprøytes med etanol. Bufferløsninger må også sterilfiltreres.
<ol><li>Tilberedning av aminosilanebelagte glassdeksler<ol>
<li>Plasser ønsket antall glassdeksler på et stykke laboratorieserviett. MERK: Forbered ytterligere 3-4 deksler for å sikre tilstrekke...

Målet med den nåværende studien er å gi et effektivt in vitro-system for bedre å forstå effekten av mekaniske signaler i NCC. I tillegg til å følge den trinnvise protokollen nevnt ovenfor, må forskerne huske på at cellekulturen til O9-1 NCCs påvirkes av typen glassdeksler som brukes til å forberede hydrogeler. For eksempel ble det bemerket at celler frøet på en bestemt type glassdekslerlip (se materialtabellen) overlevde og spredte seg godt, mens dyrkede celler frøet på andre typ...

Neural crest celler (NCCs) er en gruppe stamceller under virveldyr embryogenese med en bemerkelsesverdig evne til å migrere og bidra til utvikling av ulike organer og vev. NCCer kan skille seg ut i forskjellige celletyper, inkludert sensoriske nevroner, brusk, bein, melanocytter og glatte muskelceller, avhengig av plasseringen av aksial opprinnelse og den lokale miljøveiledningen til NCC1,2. Med evnen til å skille seg ut i et bredt spekter av celletyper, kan genetiske abnormiteter som forårsaker dysregulering på et hvilket som helst stadium av nevral kam (NC) utvikling føre til mange medfødte sykdommer2. For eksempel fører perturbasjoner under dannelsen, migrasjonen og utviklingen av NCCer til utviklingsforstyrrelser kjent samlet som nevrokritiske1,3. Disse sykdommene spenner fra kraniofaciale defekter på grunn av svikt i NCC-dannelse, som Treacher Collins syndrom, til utvikling av ulike kreftformer på grunn av NCC metastatisk migrasjonsevne, sett i melanom3,4,5,6. I løpet av de siste tiårene har forskere gjort bemerkelsesverdige funn om NCCs roller og mekanismer i utvikling og sykdommer, der de fleste funnene er fokusert på kjemiske signaler7,8. Mer nylig har mekaniske signaler blitt indikert for å spille en kritisk, men dårlig forstått rolle i NCC utvikling9,10.
Miljøsignalene til NCCer spiller en kritisk rolle under utviklingen, inkludert regulering av NCC-differensiering i ulike celletyper. Miljøsignaler, for eksempel fysiske signaler, påvirker pivotal atferd og cellulære responser, for eksempel funksjonell diversifisering. Mechanotransduction gjør det mulig for celler å føle og reagere på disse signalene for å opprettholde ulike biologiske prosesser2. NCCer er omgitt av nærliggende celler og forskjellige substrater, for eksempel den ekstracellulære matrisen (ECM), som kan gi opphav til mekaniske stimuli for å opprettholde homeostase og tilpasse seg endringene gjennom skjebnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mekanotransduksjon begynner ved plasmamembranen der den sensoriske komponenten av mekaniske ekstracellulære stimuli oppstår, noe som resulterer i intracellulær regulering av celle12. Integrins, fokale vedheft og veikryss i plasmamembranreléet mekaniske signaler, for eksempel skjærekrefter, stress og stivheten til omkringliggende substrater, til kjemiske signaler for å produsere cellulære responser12. Videresending av kjemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære reguleringen utføres via forskjellige signalveier for å fullføre vitale prosesser for organismen, for eksempel differensiering.
Flere studier har antydet at mekanisk signalering fra substratstivhet spiller en rolle i celledifferensiering13,14. For eksempel har tidligere studier vist at mesenchymale stamceller (MSC) vokst på myke substrater med en stivhet som ligner på hjernevev (i området 0,1-1,0 kPa) resulterte i nevronal celledifferensiering15,16. Imidlertid skiller flere MSCer seg inn i myokyttlignende celler når de vokser på 8-17 kPa-substrater som etterligner muskelens stivhet, mens osteoblastlignende differensiering ble observert når MSCer ble dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen av mekanotransduksjon fremheves av uregelmessigheter og abnormiteter i den mekaniske signalveien som potensielt fører til alvorlige utviklingsfeil og sykdommer, inkludert kreft, kardiovaskulære sykdommer og osteoporose17,18,19. I kreft er normalt brystvev mykt, og risikoen for brystkreft øker i stivt og tett brystvev, et miljø som er mer lik brystsvulster15. Med denne kunnskapen kan effekten av mekanisk signalering på NCC-utvikling studeres gjennom enkel manipulering av substratstivhet gjennom et in vitro-system, noe som gir ytterligere fordeler og muligheter til å forstå det grunnleggende om NC-relatert sykdomsprogresjon og etiologi.
For å studere effekten av mekaniske signaler i NCCer etablerte vi et effektivt in vitro-system for NCCer basert på optimalisering av tidligere publiserte metoder og evaluering av NCCs respons på ulike mekaniske signaler20,21. Det ble gitt en detaljert protokoll for varierende hydrogelstivhetsforberedelse og evaluering av virkningen av mekanisk signalering i NCCer. For å oppnå dette benyttes O9-1 NCC som NC-modell for å studere effekter og endringer som følge av stive kontra myke hydrogeler. O9-1 NCCs er en stabil NC celle linje isolert fra musen embryo (E) på dag 8.5. O9-1 NCCer etterligner NCCer in vivo fordi de kan skille seg ut i ulike NC-avledede celletyper i definert differensieringsmedie22. For å studere mekanisk signalering av NCCer ble et matrisesubstrat fremstilt med justerbar elastisitet fra varierende konsentrasjoner av akrylamid- og bisakrylamidløsninger for å oppnå ønsket stivhet, korrelert med den biologiske substratstivheten20,21,23. For å optimalisere betingelsene for matriseunderlag for NCCer, spesielt O9-1-celler, ble det gjort endringer fra den tidligere publiserte protokollen20. En endring i denne protokollen var å inkubere hydrogeler i kollagen I, fortynnet i 0,2% eddiksyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C over natten. Den lave pH av eddiksyre fører til en homogen fordeling og høyere kollagen I inkorporering, og dermed muliggjør en mer jevn vedlegg av ECM protein24. I tillegg ble en kombinasjon av hesteserum og fostal bovin serum (FBS) brukt i konsentrasjonene på henholdsvis 10% og 5% i fosfatbuffersalt (PBS), før de lagret hydrogelene i inkubatoren. Hesteserum ble brukt som et ekstra supplement til FBS på grunn av sin evne til å fremme celleproliferasjon og differensiering ved konsentrasjonen på 10%25.
Med denne metoden ble et biologisk miljø etterlignet av ECM-proteinbelegget (f.eks. kollagen I) for å skape et nøyaktig in vitro-miljø for NCCer å vokse og overleve20,21. Stivheten til de forberedte hydrogelene ble kvantitativt analysert via atomkraftmikroskopi (AFM), en kjent teknikk for å skildre den elastiske modulus26. For å studere effekten av ulike stivhetsnivåer på NCCer ble ville O9-1-celler dyrket og forberedt på hydrogeler for immunfluorescens (IF) farging mot filamentøs aktin (F-aktin) for å vise forskjellene i celleadhesjon og morfologier som svar på endringer i substratstivhet. Ved hjelp av dette in vitro-systemet vil forskerne kunne studere rollene til mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med andre kjemiske signaler for å få en dypere forståelse av forholdet mellom NCCer og mekanisk signalering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Neural crest celler (NCCs) er virveldyr embryonale multipotente celler som kan migrere og skille seg inn i et bredt utvalg av celletyper som gir opphav til ulike organer og vev. Vevsstivhet produserer mekanisk kraft, et fysisk signal som spiller en kritisk rolle i NCC-differensiering; Mekanismen er imidlertid fortsatt uklar. Metoden beskrevet her gir detaljert informasjon for optimalisert generering av polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet, nøyaktig måling av slik stivhet og evaluering av virkningen av mekaniske signaler i O9-1 celler, en NCC-linje som etterligner in vivo NCCs.
Hydrogelstivhet ble målt ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM) og indikerte forskjellige stivhetsnivåer tilsvarende. O9-1 NCC dyrket på hydrogeler av varierende stivhet viste forskjellig cellemorfologi og genuttrykk av stressfibre, noe som indikerte varierende biologiske effekter forårsaket av mekaniske signalendringer. Videre slo dette fast at varierende hydrogelstivhet resulterte i et effektivt in vitro-system for å manipulere mekanisk signalering ved å endre gelstivhet og analysere den molekylære og genetiske reguleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan skille seg ut i et bredt spekter av celletyper under påvirkning av de tilsvarende differensieringsmediene, og det er praktisk å manipulere kjemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-systemet et kraftig verktøy for å studere rollen som mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med kjemiske signaler, noe som vil hjelpe forskere til å bedre forstå de molekylære og genetiske mekanismene for nevral kamutvikling og sykdommer.

Hydrogel forberedelse og stivhetsvurdering gjennom AFM og Hertz-modellen Her er det gitt en detaljert protokoll for å generere polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet ved å regulere forholdet mellom akrylamid og bis-akrylamid. Polyakrylamidhydrogelene er imidlertid ikke klare for vedheft av celler på grunn av mangel på ECM-proteiner. Dermed binder sulfo-SANPAH, som fungerer som en linker, kovalente til hydrogelene og reagerer med de primære aminer av ECM-proteiner for å tillate ved...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Detaljerte trinnvise protokoller er beskrevet her for å studere mekaniske signaler in vitro ved hjelp av multipotente O9-1 nevrale kamceller og polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet.

Et optimalisert O9-1/Hydrogel-system for å studere mekaniske signaler i nevrale kamceller

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Metoden hjelper i studiet av mekanisk signalering av nevrale kamceller og dens interaksjon med kjemiske signaler. Det kan også hjelpe i de molekylære og genetiske mekanismene til nevral kamutvikling i sykdommer. Overfør glassdekselslippene er den mest utfordrende, og overfør dem derfor sakte og oppmerksomt for å forhindre brudd og slippe dem.Å demonstrere prosedyren vil være meg og Dr.Sherry Zhao, en postdoktor fra laboratoriet mitt. Begynn med å plassere ønsket antall glassdekselslipper på et stykke laboratorieserviett. Steriliser deretter hvert deksel ved å sende det frem og tilbake gjennom flammen til alkoholbrenneren.Når dekselet glir ned, dekk 12 millimeter dekselslippet med ca. 200 mikroliter og 25 millimeter dekselglidning med 800 mikroliter 0,1 molar natriumhydroksid. Etter fem minutter, aspirer natriumhydroksid og la dekselet gli for å lufttørke i fem minutter for å danne en jevn film. Når dekselskliene er tørket, tilsett ca. 18 mikroliter aminopropyltrietoksysilane eller APTS på en 12 millimeter dekselslipp og 150 mikroliter APTS på en 25 millimeter dekselslipp.Aspirate tilgang APTS for å tillate gjenværende APTS å tørke i fem minutter. Skyll senere dekselet tre ganger ved å senke dem ned i sterilt deionisert vann i fem minutter hver gang. Flytt de vaskede dekselslippene til en frisk Petri-tallerken med den reaktive siden vendt opp.Og behandle dekselet slips ved å suge i nok 0,5% glutaraldehyd i 30 minutter. Etter å ha aspirert glutaraldehyden, skyll dekselet en gang med deionisert vann i tre minutter og lufttørk dekselet glir med den reaktive siden opp. For å forberede de silikoniserte dekselslippene, plasser like mange dekselslipper som at aminosilanebelagte deksel glir i en Petri-tallerken foret med parafilm.Behandle deretter 12 millimeter dekselslipper med 40 mikroliter og 25 millimeter dekselslipper med 150 mikroliter dichloromethane silan eller DCMS i fem minutter. Vask dekselslippene med sterilt deionisert vann en gang i ett minutt før du plasserer de reaktive dekselslippene med forsiden opp på en laboratorieserviett. For å forberede hydrogelene, pipette nylaget akrylamidgeloppløsning på de tørkede aminosilanebelagte dekselslippene.Bruk buede pinsett til å overføre den DCMS-behandlede dekselslipsen umiddelbart på toppen av geloppløsningen med den behandlede siden som berører geloppløsningen, og smør dermed gelløsningen mellom to dekselslipper. Når gelen er polymerisert, skille DCMS behandlet deksel slip med buede pinsett, slik at gelen festet til aminosilane belagt deksel slip. Senk deretter 12 millimeter dekselslipsen med den vedlagte hydrogelen i en forhåndsbestemt 4-brønns eller 24-brønnsplate dekket med 500 mikroliter sterilt PBS eller deionisert vann og 25 millimeter dekselslips i en 6-brønns plate dekket med to milliliter sterilt PBS eller deionisert vann i 30 minutter.Etter fjerning av overflødig akrylamidoppløsning, oppbevar hydrogelene i steril PBS eller deionisert vann ved romtemperatur i 30 minutter. Senere aspirerer du PBS eller deionisert vann fra brønnplaten før du tilsetter Sulfo-succinimydyl- eller Sulfo-SUNPAH-oppløsning for å dekke gelen helt. Og plasser gelene med løsningen under et 15 watt, 365 nanometer ultrafiolett lys avdekket i 10 minutter.Samle så mye av Sulfo-SANPAH per løsning som mulig ved å vippe platen. Og vask deretter gelen to til tre ganger med 15 millimolar HEPES. Tilsett 15 milligram per milliliter Kollagen 1 fortynnet i 0,2% eddiksyre til hver brønn som inneholder hydrogelen.Og inkuber gelene over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste dag, utfør vasken som beskrevet i manuskriptet før du inkuberer hydrogelene med PBS som inneholder 10% hesteserum og 5% FBS ved 37 Celsius og 5% karbondioksid. Etter to timer med inkubasjon, tilsett 500 mikroliter sterilt filtrert DMEM med 10% FBS og 1% penicillin streptomycin til hver brønn og lagre gelene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Når cellekulturen er klar, plate ca 1,5 ganger 10 til fjerde 09-1 celler per centimeter kvadrert i bazellmediet. Bruk pinsett til å transportere dekselslippene til en ny plate for å minimere falske signaler fra cellene som vokser direkte på platen. Fest deretter cellene ved hjelp av 500 mikroliter 4% paraformaldehyd i 10 minutter før du behandler cellene med 500 mikroliter 0,1% Triton X-100 ved romtemperatur.Etter 15 minutter, gå cellene med 250 mikroliter av 10% esel serum. Flekk cellene for F-aktin med felodipin ved en fortynning på 1 til 400 i 250 mikroliter med 10% eselserum, etterfulgt av inkubasjon med DAPI i 10 minutter. Vask cellene med PBS i to minutter før du legger til tre til fire dråper monteringsmedium til hver brønn.På et fluorescensmikroskop, ta bilder av minst tre tilfeldige rammer per hydrogelprøve som produserer individuelle og sammenslåtte kanaler. I stivhetsvurderingen av hydrogelen gjennom atomkraftmikroskopi eller AFM var hellingen av kraftkurven skånsom for myke hydrogeler da den nødvendige kraften fra AFM-sonden var mindre. Men på stive hydrogeler var den genererte skråningen mye brattere.AFM-målingene ble deretter brukt til å beregne gjennomsnittlig stivhet av hydrogeler fra Youngs elastiske modulus i kilopascals. Vekstegenskapene til P19 og 09-1 celler ble observert i en kilopascal og 40 kilopascals hydrogeler av kontroll og modifiserte gelsystemer. 09-1-cellene som vokste på de opprinnelige gelsystemene resulterte i et høyere antall døde celler.I motsetning til de 09-1 cellene som vokste på de modifiserte gelsystemene, viste sunn cellevekst og tilstrekkelig feste til hydrogelsubstratet med lite celledekk indikert av minimale runde celler. P19-cellene belagt på begge hydrogelsystemene viste et overskudd av runde flytende celler og mangel på cellesubstratfester. Kompatibiliteten til nevrale kamceller eller NCCer med det modifiserte hydrogelsystemet ble vurdert ved immunfluorescerende farging for AP-2.En betydelig økning i AP-2-uttrykket i 09-1 celler belagt på det modifiserte hydrogelsystemet ble observert. I tillegg viste 09-1-cellene forskjellige morfologier basert på de lave eller høye stivhetshydrgelene gjennom varierende mengder av stressfibrene. Anti-vinculin-uttrykket i 09-1 celler dyrket på 40 kilopascals hydrogel var høyere enn de som vokste på den ene kilopasale hydrogelen som reflekterer at cellene som vokser på mykere substrater danner minimale fokale tilsetningskomplekser enn det stive substratet.Passende ventetid er avgjørende for polymerisering av hydrogelene, da akrylamider er giftige for cellene. Senk hydrogelene ned i PBS eller avionisert vann i minst 30 minutter for å sikre bedre resultater.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic Approach for Assessing Dannelse av nevronkoblinger i en Co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer i kyllingembryoer ved hjelp av ChickGFP Neural Tube Grafting og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollert kortikale Impact modell av mus hjerneskade med terapeutisk transplantasjon av Human indusert pluripotent Stem Cell-avledet nevrale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Disseksjon, kultur og analyse av primær skallen neural Crest celler fra mus for studiet av Neural Crest Cell delaminering og migrasjon

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolasjon, kultur og adipogen induksjon av Neural Crest Original Adipose-Avledet stamceller fra periaortisk fettvev

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...