Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
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Agradecemos à Dra. Ana-Maria Zaske, operadora da instalação Atomic Force Microscópio-UT Core no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas, pela expertise em AFM neste projeto. Agradecemos também às fontes de financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).

1. Preparação de hidrogel
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas em uma capa de cultura celular que tenha sido desinfetada com etanol e ultravioleta (UV) esterilizada antes de usar para manter a esterilidade. Ferramentas, como pinças e pipetas, devem ser pulverizadas com etanol. As soluções tampão também devem ser filtradas estéreis.
<ol><li>Preparação de tampas de vidro revestidas de aminosilano<ol>
<li>Coloque o número desejado de tampas de vidro em um pedaço de limpeza de ...

O objetivo do presente estudo é fornecer um sistema in vitro eficaz e eficiente para entender melhor o impacto dos sinais mecânicos nos NCCs. Além de seguir o protocolo passo-a-passo mencionado acima, os pesquisadores precisam ter em mente que a cultura celular dos NCCs O9-1 é afetada pelo tipo de tampas de vidro usadas para preparar hidrogéis. Por exemplo, observou-se que as células semeadas em um tipo específico de mancha de vidro (ver a Tabela dos Materiais) sobreviveram e proliferaram...

As células de crista neural (NCCs) são um grupo de células-tronco durante a embriogênese vertebrada com uma notável capacidade de migrar e contribuir para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos. Os NCCs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares, incluindo neurônios sensoriais, cartilagem, osso, melanócitos e células musculares lisas, dependendo da localização de origem axial e da orientação ambiental local da NCC1,2. Com a capacidade de se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares, anormalidades genéticas que causam a desregulação em qualquer estágio do desenvolvimento da crista neural (NC) podem levar a inúmeras doenças congênitas2. Por exemplo, perturbações durante a formação, migração e desenvolvimento de DCNT levam a distúrbios do desenvolvimento conhecidos coletivamente como neurocristopatias1,3. Essas doenças vão desde defeitos craniofaciais devido à falha na formação do CCN, como a síndrome de Treacher Collins, até o desenvolvimento de vários cânceres devido à capacidade migratória metastática do CCN, como visto no melanoma3,4,5,6. Ao longo das últimas décadas, pesquisadores fizeram descobertas notáveis sobre os papéis e mecanismos das DCNT no desenvolvimento e nas doenças, com a maioria dos achados sendo focados em sinais químicos7,8. Mais recentemente, os sinais mecânicos foram indicados para desempenhar um papel crítico, mas mal compreendido no desenvolvimento do NCC9,10.
As sugestões ambientais das DCNT desempenham um papel crítico durante o seu desenvolvimento, incluindo a regulação da diferenciação do NCC em vários tipos de células. As sugestões ambientais, por exemplo, as pistas físicas, influenciam comportamentos fundamentais e respostas celulares, como a diversificação funcional. A mecanotransdução permite que as células osenceram e respondam a essas pistas para manter vários processos biológicos2. As NCCs são cercadas por células vizinhas e substratos diferentes, como a matriz extracelular (ECM), que pode dar origem a estímulos mecânicos para manter a homeostase e se adaptar às mudanças através da determinação do destino, proliferação e apoptose11. A mecanotransdução começa na membrana plasmática onde ocorre o componente sensorial dos estímulos extracelulares mecânicos, resultando na regulação intracelular da célula12. Integrinos, aderências focais e junções da membrana plasmática retransmitem sinais mecânicos, como forças de corte, estresse e rigidez de substratos circundantes, em sinais químicos para produzir respostas celulares12. O retransmissamento de sinais químicos da membrana plasmática para a regulação celular final é realizado através de diferentes vias de sinalização para finalizar processos vitais para o organismo, como a diferenciação.
Vários estudos sugerem que a sinalização mecânica da rigidez do substrato desempenha um papel na diferenciação celular13,14. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em substratos macios com rigidez semelhante à do tecido cerebral (na faixa de 0,1-1,0 kPa) resultaram na diferenciação celular neuronal15,16. No entanto, mais MSCs se diferenciam em células semelhantes a miócitos quando cultivados em substratos de 8-17 kPa imitando a rigidez do músculo, enquanto a diferenciação semelhante ao osteoblasto foi observada quando os MSCs foram cultivados em substratos rígidos (25-40 kPa)15,16. A significância da mecanotransdução é destacada pelas irregularidades e anormalidades na via de sinalização mecânica que potencialmente levam a graves defeitos e doenças do desenvolvimento, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose17,18,19. Nos cânceres, o tecido mamário normal é macio, e o risco de câncer de mama aumenta em tecido mamário rígido e denso, um ambiente mais parecido com os tumores mamários15. Com esse conhecimento, os efeitos da sinalização mecânica no desenvolvimento do NCC podem ser estudados através da simples manipulação da rigidez do substrato através de um sistema in vitro, proporcionando mais vantagens e possibilidades na compreensão dos fundamentos da progressão e etiologia da doença relacionada à NC.
Para estudar o impacto dos sinais mecânicos nas NCCs, estabelecemos um sistema in vitro eficiente para NCCs com base na otimização de métodos publicados anteriormente e na avaliação das respostas das NCCs a diferentes sinais mecânicos20,21. Foi fornecido um protocolo detalhado para a preparação e avaliação da rigidez do hidrogel variado e a avaliação do impacto da sinalização mecânica em NCCs. Para isso, os NCCs O9-1 são utilizados como modelo nc para estudar os efeitos e mudanças em resposta a hidrogéis rígidos versus macios. Os NCCs O9-1 são uma linha de células NC estável isolada do embrião do rato (E) no dia 8.5. Os NCCs O9-1 imitam NCCs in vivo porque podem se diferenciar em vários tipos de células derivadas do NC em mídia de diferenciação definida22. Para estudar a sinalização mecânica das NCCs, foi fabricado um substrato matricial com elasticidade tunable a partir de diferentes concentrações de acrilamida e soluções de biscrilamida para alcançar a rigidez desejada, correlacionando-se com a rigidez biológica do substrato20,21,23. Para otimizar as condições do substrato matricial para NCCs, especificamente células O9-1, foram feitas modificações a partir do protocolo20publicado anteriormente. Uma mudança feita neste protocolo foi a incubação de hidrogéis em colágeno I, diluídos em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES, a 37 °C durante a noite. O baixo pH do ácido acético leva a uma distribuição homogênea e maior incorporação de colágeno I, permitindo assim um apego mais uniforme da proteína ECM24. Além disso, foi utilizada uma combinação de soro de cavalo e soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 10% e 5% em soro tampão de fosfato (PBS), respectivamente, antes de armazenar os hidrogéis na incubadora. O soro de cavalo foi utilizado como suplemento adicional à FBS devido à sua capacidade de promover a proliferação celular e a diferenciação na concentração de 10%25.
Com este método, um ambiente biológico foi imitado pelo revestimento proteico ECM (por exemplo, Colágeno I) para criar um ambiente in vitro preciso para que os NCCs cresçam e sobrevivama 20,21. A rigidez dos hidrogéis preparados foi analisada quantitativamente via microscopia de força atômica (AFM), uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico26. Para estudar o efeito de diferentes níveis de rigidez em NCCs, as células do tipo selvagem O9-1 foram cultivadas e preparadas em hidrogéis para a coloração de imunofluorescência (IF) contra a actina filamentosa (F-actin) para mostrar as diferenças na adesão celular e morfologias em resposta às mudanças na rigidez substrato. Utilizando esse sistema in vitro, os pesquisadores poderão estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com outros sinais químicos para obter uma compreensão mais profunda da relação entre NCCs e sinalização mecânica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

As células de crista neural (NCCs) são células multipotentes embrionárias vertebrada que podem migrar e se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares que dão origem a vários órgãos e tecidos. A rigidez tecidual produz força mecânica, uma sugestão física que desempenha um papel crítico na diferenciação do NCC; no entanto, o mecanismo permanece incerto. O método descrito aqui fornece informações detalhadas para a geração otimizada de hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada, a medição precisa de tal rigidez e a avaliação do impacto dos sinais mecânicos em células O9-1, uma linha NCC que imita NCCs in vivo.
A rigidez do hidrogel foi medida por meio da microscopia de força atômica (AFM) e indicou diferentes níveis de rigidez em conformidade. Os NCCs O9-1 cultivados em hidrogéis de rigidez variada mostraram diferentes morfologia celular e expressão genética de fibras de estresse, o que indicou efeitos biológicos variados causados por alterações mecânicas de sinal. Além disso, isso estabeleceu que a variação da rigidez do hidrogel resultou em um sistema in vitro eficiente para manipular a sinalização mecânica alterando a rigidez do gel e analisando a regulação molecular e genética em NCCs. Os NCCs O9-1 podem se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares sob a influência dos meios de diferenciação correspondentes, e é conveniente manipular sinais químicos in vitro. Portanto, este sistema in vitro é uma poderosa ferramenta para estudar o papel da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com sinais químicos, o que ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento de crista neural e doenças.

Avaliação de preparação e rigidez de hidrogel através da AFM e do modelo Hertz Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para gerar hidrágundos de poliacrilamida de rigidez variada, regulando a razão de acrilamida e biscrilamida. No entanto, os hidrânuis de poliacrilamida não estão prontos para a adesão das células devido à falta de proteínas ECM. Assim, o sulfo-SANPAH, atuando como um linker, se liga covalentemente aos hidrogéis e reage com as aminas primárias das proteínas ECM para ...

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An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.

Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

O método auxilia no estudo da sinalização mecânica das células da crista neural e sua interação com sinais químicos. Também pode ajudar nos mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento da crista neural em doenças. Transferir os deslizamentos de tampa de vidro é o mais desafiador, por isso, transfira-os lentamente e atentamente para evitar quebrá-los e derrubá-los.Demonstrando o procedimento, seremos eu e a Dra. Comece colocando o número desejado de deslizamentos de tampa de vidro em um pedaço de limpeza de laboratório. Em seguida, esterilize cada deslizamento de cobertura passando-o para frente e para trás através da chama do queimador de álcool.Quando a tampa se esfriar, cubra o deslizamento de cobertura de 12 milímetros com aproximadamente 200 microliters e deslizamento de cobertura de 25 milímetros com 800 microliters de 0,1 hidróxido de sódio molar. Após cinco minutos, aspire hidróxido de sódio e deixe a tampa secar por cinco minutos para formar um filme uniforme. Uma vez que os deslizamentos de cobertura são secos, adicione aproximadamente 18 microliters de triexisilano aminopropil ou APTS em um deslizamento de cobertura de 12 milímetros e 150 microliters de APTS em um deslizamento de cobertura de 25 milímetros.Acesso de acesso APTS para permitir que o APTS residual seque por cinco minutos. Mais tarde, enxágue os deslizamentos de cobertura três vezes submergindo-os em água deionizada estéril por cinco minutos cada vez. Mova os deslizes de cobertura lavadas para uma placa de Petri fresca com o lado reativo voltado para cima.E trate os deslizamentos de cobertura encharcando bastante 0,5% glutaraldeído por 30 minutos. Depois de aspirar o glutaraldeído, enxágue os deslizamentos de cobertura uma vez com água desionizada por três minutos e seque o ar os deslizamentos de cobertura com o lado reativo para cima. Para preparar os deslizamentos de cobertura siliconizados, coloque o mesmo número de deslizamentos de cobertura como que a capa revestida de aminosilano desliza em uma placa de Petri forrada com para filme.Em seguida, trate os deslizamentos de cobertura de 12 milímetros com 40 microliters e deslizamentos de cobertura de 25 milímetros com 150 microliters de siltano diclorometano ou DCMS por cinco minutos. Lave os deslizamentos de cobertura com água deionizada estéril uma vez por um minuto antes de colocar os deslizamentos de cobertura reativa de frente para cima em um lenço de laboratório. Para preparar os hidrogéis, pipeta recém-preparada solução de gel de acrilamida sobre os deslizamentos de cobertura revestidos de aminosilano secos.Utilizando pinças curvas, transfira imediatamente o deslizamento de cobertura tratada DCMS em cima da solução de gel com o lado tratado tocando a solução de gel, assim, a solução de gel entre dois deslizamentos de cobertura. Uma vez que o gel seja polimerizado, separe o deslizamento de tampa tratada dcms com pinças curvas, deixando o gel preso ao deslizamento revestido de aminosilano. Em seguida, submergir o deslizamento de cobertura de 12 milímetros com o hidrogel anexado em uma placa pré-determinada de 4-well ou 24 poços coberto com 500 microliters de PBS estéril ou água desionizada e a cobertura de 25 milímetros em uma placa de 6 poços coberta com dois mililitros de PBS estéril ou água desionizada por 30 minutos.Depois de remover a solução de acrilamida em excesso, armazene os hidrogéis em PBS estéreis ou água deionizada à temperatura ambiente por 30 minutos. Mais tarde, aspire PBS ou água deionizada da placa do poço antes de adicionar solução Sulfo-succinimydyl ou Sulfo-SUNPAH para cobrir o gel inteiramente. E coloque os géis com a solução sob uma luz ultravioleta de 15 watts e 365 nanômetros descoberta por 10 minutos.Colete o máximo possível do Sulfo-SANPAH por solução inclinando a placa. E depois lave o gel duas a três vezes com HEPES de 15 milimões. Adicione 15 miligramas por mililitro Colágeno 1 diluído em ácido acético de 0,2% a cada poço contendo o hidrogel.E incubar os géis durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, realize a lavagem como descrito no manuscrito antes de incubar os hidrogéis com PBS contendo 10% de serum de cavalo e 5%FBS a 37 Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após duas horas de incubação, adicione 500 microliters de DMEM filtrado estéril com 10% FBS e estreptomicina de penicilina de 1%a cada poço e armazene os géis a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Quando a cultura celular estiver pronta, a placa aproximadamente 1,5 vezes 10 a quarta células 09-1 por centímetro quadrado no meio bazell. Use pinças para transportar os deslizamentos de cobertura para uma nova placa para minimizar sinais falsos das células cultivadas diretamente na placa. Em seguida, fixar as células usando 500 microliters de 4% paraformaldeído por 10 minutos antes de tratar as células com 500 microliters de 0,1%Triton X-100 à temperatura ambiente.Após 15 minutos, caminhe pelas células com 250 microliters de 10% de soro de burro. Colora as células para F-actin com felodipina em uma diluição de 1 a 400 em 250 microliters de soro de burro de 10%, seguido de incubação com DAPI por 10 minutos. Lave as células com PBS por dois minutos antes de adicionar três a quatro gotas de meio de montagem para cada poço.Em um microscópio de fluorescência, capture as imagens de pelo menos três quadros aleatórios por amostra de hidrogel produzindo canais individuais e mesclados. Na avaliação da rigidez do hidrogel através da microscopia da força atômica ou AFM, a inclinação da curva de força foi suave para hidrogéis macios, pois a força necessária da sonda AFM era menor. No entanto, em hidrogéis rígidos, a inclinação gerada era muito mais íngreme.As medidas afm foram então utilizadas para calcular a rigidez média dos hidrogéis do módulo elástico de Young em quilopascals. As características de crescimento das células P19 e 09-1 foram observadas em um hidrogéis quilopascal e 40 kilopascals de sistemas de controle e gel modificado. As células 09-1 cultivadas nos sistemas originais de gel resultaram em um maior número de células mortas.Em contraste, as células 09-1 cultivadas nos sistemas de gel modificados apresentaram crescimento celular saudável e apego suficiente ao substrato de hidrogéis com pequeno deck celular indicado por células redondas mínimas. As células P19 banhadas em ambos os sistemas de hidrogel apresentaram um excesso de células flutuantes redondas e a falta de anexos de substrato celular. A compatibilidade das células da crista neural ou NCCs com o sistema de hidrogel modificado foi avaliada por coloração imunofluorescente para AP-2.Observou-se aumento significativo da expressão AP-2 em células 09-1 banhadas no sistema de hidrogel modificado. Além disso, as células 09-1 apresentaram diferentes morfologias baseadas nos hidrogéis de baixa ou alta rigidez através de quantidades variadas das fibras de estresse. A expressão anti-vinculina em células 09-1 cultivadas no hidrogel de 40 quilopascal foi maior do que aquelas cultivadas no hidrogel quilopascal refletindo que as células cultivadas em substratos mais suaves formam complexos mínimos de adição focal do que o substrato rígido.O tempo de espera adequado é crucial para a polimerização dos hidrogéis, pois os acrilamidas são tóxicos para as células. Submergir os hidrogéis em PBS ou água desionizada por pelo menos 30 minutos para garantir melhores resultados.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Biologia do Desenvolvimento

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

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Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

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Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

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