Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
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Agradecemos a la Dra. Ana-Maria Zaske, operadora de las instalaciones de Atomic Force Microscope-UT Core en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, por la experiencia aportada en AFM en este proyecto. También agradecemos a las fuentes de financiamiento de los Institutos Nacionales de Salud (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 y R01HL142704 a J. Wang).

1. Preparación de hidrogel
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una campana de cultivo celular que haya sido desinfectada con etanol y ultravioleta (UV) esterilizado antes de su uso para mantener la esterilidad. Las herramientas, como pinzas y pipetas, deben rociarse con etanol. Las soluciones tampón también deben ser filtradas estérilmente.
<ol><li>Preparación de fundas de vidrio recubiertas de aminosilano<ol>
<li>Coloque el número deseado de hojas de cubierta de vidrio en un tro...

El objetivo del estudio actual es proporcionar un sistema in vitro eficaz y eficiente para comprender mejor el impacto de las señales mecánicas en los NCC. Además de seguir el protocolo paso a paso mencionado anteriormente, los investigadores deben tener en cuenta que el cultivo celular de NCC O9-1 se ve afectado por el tipo de cubiertas de vidrio utilizadas para preparar hidrogeles. Por ejemplo, se observó que las células sembradas en un tipo específico de cubierta de vidrio (ver la Tabla de Mater...

Las células de la cresta neural (NCC) son un grupo de células madre durante la embriogénesis de vertebrados con una notable capacidad para migrar y contribuir al desarrollo de diversos órganos y tejidos. Los NCC pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas sensoriales, el cartílago, el hueso, los melanocitos y las células del músculo liso, dependiendo de la ubicación del origen axial y la orientación ambiental local del NCC1,2. Con la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células, las anomalías genéticas que causan desregulación en cualquier etapa del desarrollo de la cresta neural (NC) pueden conducir a numerosas enfermedades congénitas2. Por ejemplo, las perturbaciones durante la formación, migración y desarrollo de las NCC conducen a trastornos del desarrollo conocidos colectivamente como neurocristopatías1,3. Estas enfermedades van desde defectos craneofaciales debido a fallas en la formación de NCC, como el síndrome de Treacher Collins, hasta el desarrollo de varios cánceres debido a la capacidad migratoria metastásica de NCC, como se ve en el melanoma3,4,5,6. En las últimas décadas, los investigadores han hecho descubrimientos notables sobre los roles y mecanismos de los NCC en el desarrollo y las enfermedades, y la mayoría de los hallazgos se centran en las señales químicas7,8. Más recientemente, se ha indicado que las señales mecánicas desempeñan un papel crítico pero poco comprendido en el desarrollo de NCC9,10.
Las señales ambientales de los NCC juegan un papel crítico durante su desarrollo, incluida la regulación de la diferenciación de NCC en varios tipos de células. Las señales ambientales, por ejemplo, las señales físicas, influyen en los comportamientos fundamentales y las respuestas celulares, como la diversificación funcional. La mecanotransducción permite a las células detectar y responder a esas señales para mantener diversos procesos biológicos2. Los NCC están rodeados de células vecinas y diferentes sustratos, como la matriz extracelular (ECM), que puede dar lugar a estímulos mecánicos para mantener la homeostasis y adaptarse a los cambios a través de la determinación del destino, la proliferación y la apoptosis11. La mecanotransducción comienza en la membrana plasmática donde se produce el componente sensorial de los estímulos mecánicos extracelulares, dando lugar a la regulación intracelular de la célula12. Las integrinas, las adherencias focales y las uniones de la membrana plasmática transmiten señales mecánicas, como las fuerzas de cizallamiento, la tensión y la rigidez de los sustratos circundantes, en señales químicas para producir respuestas celulares12. La retransmisión de señales químicas desde la membrana plasmática hasta la regulación celular final se lleva a cabo a través de diferentes vías de señalización para finalizar procesos vitales para el organismo, como la diferenciación.
Varios estudios han sugerido que la señalización mecánica de la rigidez del sustrato juega un papel en la diferenciación celular13,14. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en sustratos blandos con una rigidez similar a la del tejido cerebral (en el rango de 0.1-1.0 kPa) resultaron en la diferenciación de células neuronales15,16. Sin embargo, más MSC se diferencian en células similares a los miocitos cuando se cultivan en sustratos de 8-17 kPa que imitan la rigidez del músculo, mientras que la diferenciación similar a los osteoblastos se observó cuando las MSC se cultivaron en sustratos rígidos (25-40 kPa)15,16. La importancia de la mecanotransducción se destaca por las irregularidades y anomalías en la vía de señalización mecánica que potencialmente conducen a defectos y enfermedades graves del desarrollo, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la osteoporosis17,18,19. En los cánceres, el tejido mamario normal es blando, y el riesgo de cáncer de mama aumenta en el tejido mamario rígido y denso, un ambiente que es más parecido a los tumores de mama15. Con este conocimiento, los efectos de la señalización mecánica en el desarrollo de NCC se pueden estudiar a través de la manipulación simple de la rigidez del sustrato a través de un sistema in vitro, proporcionando más ventajas y posibilidades para comprender los fundamentos de la progresión y etiología de la enfermedad relacionada con NC.
Para estudiar el impacto de las señales mecánicas en los NCC, establecimos un sistema in vitro eficiente para ncCs basado en la optimización de métodos previamente publicados y la evaluación de las respuestas de los NCCs a diferentes señales mecánicas20,21. Se proporcionó un protocolo detallado para la preparación de la rigidez variable del hidrogel y la evaluación del impacto de la señalización mecánica en los NCC. Para lograr esto, los NCC O9-1 se utilizan como modelo NC para estudiar los efectos y cambios en la respuesta a los hidrogeles rígidos frente a los blandos. Los NCC O9-1 son una línea celular NC estable aislada del embrión de ratón (E) en el día 8.5. Los NCC de O9-1 imitan a los NCC in vivo porque pueden diferenciarse en varios tipos de células derivadas de NC en medios de diferenciación definidos22. Para estudiar la señalización mecánica de los NCC, se fabricó un sustrato de matriz con elasticidad sintonizable a partir de concentraciones variables de soluciones de acrilamida y bisacrilamida para lograr la rigidez deseada, correlacionándose con la rigidez biológica del sustrato20,21,23. Para optimizar las condiciones de sustrato matricial para NCCs, específicamente células O9-1, se realizaron modificaciones a partir del protocolo20previamente publicado. Un cambio realizado en este protocolo fue incubar hidrogeles en colágeno I, diluidos en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES, a 37 °C durante la noche. El bajo pH del ácido acético conduce a una distribución homogénea y una mayor incorporación de colágeno I, lo que permite una unión más uniforme de la proteína ECM24. Además, se utilizó una combinación de suero de caballo y suero fetal bovino (FBS) en las concentraciones de 10% y 5% en solución salina tampón de fosfato (PBS), respectivamente, antes de almacenar los hidrogeles en la incubadora. El suero de caballo se utilizó como un suplemento adicional a FBS debido a su capacidad para promover la proliferación y diferenciación celular a la concentración de 10%25.
Con este método, un entorno biológico fue imitado por el recubrimiento de proteína ECM (por ejemplo, colágeno I) para crear un entorno in vitro preciso para que los NCC crezcan y sobrevivan20,21. La rigidez de los hidrogeles preparados se analizó cuantitativamente mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), una técnica bien conocida para representar el módulo elástico26. Para estudiar el efecto de diferentes niveles de rigidez en los NCC, se cultivaron células O9-1 de tipo salvaje y se prepararon en hidrogeles para la tinción de inmunofluorescencia (IF) contra la actina filamentosa (F-actina) para mostrar las diferencias en la adhesión celular y las morfologías en respuesta a los cambios en la rigidez del sustrato. Utilizando este sistema in vitro, los investigadores podrán estudiar las funciones de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con otras señales químicas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre los NCC y la señalización mecánica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Las células de la cresta neural (NCC) son células multipotentes embrionarias de vertebrados que pueden migrar y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células que dan lugar a diversos órganos y tejidos. La rigidez tisular produce fuerza mecánica, una señal física que juega un papel crítico en la diferenciación de NCC; sin embargo, el mecanismo sigue sin estar claro. El método descrito aquí proporciona información detallada para la generación optimizada de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable, la medición precisa de dicha rigidez y la evaluación del impacto de las señales mecánicas en las células de O9-1, una línea NCC que imita a los NCC in vivo.
La rigidez del hidrogel se midió mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) e indicó diferentes niveles de rigidez en consecuencia. Los NCC de O9-1 cultivados en hidrogeles de rigidez variable mostraron una morfología celular y una expresión génica diferentes de las fibras de estrés, lo que indicó efectos biológicos variables causados por cambios en las señales mecánicas. Además, esto estableció que la variación de la rigidez del hidrogel dio como resultado un sistema in vitro eficiente para manipular la señalización mecánica alterando la rigidez del gel y analizando la regulación molecular y genética en nccs. O9-1 NCCs pueden diferenciarse en una amplia gama de tipos de células bajo la influencia de los medios de diferenciación correspondientes, y es conveniente manipular señales químicas in vitro. Por lo tanto, este sistema in vitro es una herramienta poderosa para estudiar el papel de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con las señales químicas, lo que ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural y las enfermedades.

Preparación de hidrogel y evaluación de rigidez a través de AFM y el modelo Hertz Aquí, se proporciona un protocolo detallado para generar hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable mediante la regulación de la proporción de acrilamida y bisacrilamida. Sin embargo, los hidrogeles de poliacrilamida no están listos para la adhesión de las células debido a la falta de proteínas ECM. Por lo tanto, sulfo-SANPAH, actuando como un enlazador, se une covalentemente a los hidrogeles y reacciona ...

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An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.

Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

El método ayuda en el estudio de la señalización mecánica de las células de la cresta neural y su interacción con las señales químicas. También puede ayudar en los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural en enfermedades. Transferir los resbalones de la cubierta de vidrio es lo más difícil, por lo tanto, transfiéralos lenta y atentamente para evitar que se rompan y caigan.Demostrando el procedimiento seremos yo y la Dra. Sherry Zhao, becaria postdoctoral de mi laboratorio. Comience colocando el número deseado de resbalones de cubierta de vidrio en un trozo de toallita de laboratorio. Luego esterilice cada deslizamiento de la cubierta pasándolo de un lado a otro a través de la llama del quemador de alcohol.Cuando la cubierta se deslice se enfríe, cubra el deslizamiento de la cubierta de 12 milímetros con aproximadamente 200 microlitros y el deslizamiento de la cubierta de 25 milímetros con 800 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.1. Después de cinco minutos, aspire el hidróxido de sodio y deje que los resbalones de la cubierta se sequen al aire durante cinco minutos para formar una película uniforme. Una vez que se sequen los resbalones de la cubierta, agregue aproximadamente 18 microlitros de aminopropil trietoxisilano o APTS en un resbalón de cubierta de 12 milímetros y 150 microlitros de APTS en un resbalón de cubierta de 25 milímetros.Aspirar el acceso APTS para permitir que el APTS residual se seque durante cinco minutos. Más tarde, enjuague los deslizamientos de la cubierta tres veces sumergiéndolos en agua desionizada estéril durante cinco minutos cada vez. Mueva los resbalones de la cubierta lavada a una placa de Petri fresca con el lado reactivo hacia arriba.Y trate los resbalones de la cubierta remojando suficiente glutaraldehído al 0,5% durante 30 minutos. Después de aspirar el glutaraldehído, enjuague los resbalones de la cubierta una vez con agua desionizada durante tres minutos y seque al aire los resbalones de la cubierta con el lado reactivo hacia arriba. Para preparar los resbalones de cubierta siliconados, coloque el mismo número de resbalones de cubierta que los resbalones de cubierta recubiertos de aminosilano en una placa de Petri forrada con para película.Luego, trate los deslizamientos de cubierta de 12 milímetros con 40 microlitros y los deslizamientos de cubierta de 25 milímetros con 150 microlitros de silano de diclorometano o DCMS durante cinco minutos. Lave los resbalones de la cubierta con agua desionizada estéril una vez durante un minuto antes de colocar los resbalones de la cubierta reactiva boca arriba en una toallita de laboratorio. Para preparar los hidrogeles, pipetee la solución de gel de acrilamida recién preparada sobre los resbalones de la cubierta recubierta de aminosilano seco.Usando pinzas curvas, transfiera inmediatamente el deslizamiento de la cubierta tratada con DCMS sobre la solución de gel con el lado tratado tocando la solución de gel, intercalando así cambiar la solución de gel entre dos deslizamientos de cubierta. Una vez polimerizado el gel, separe el deslizamiento de la cubierta tratada con DCMS con pinzas curvas, dejando el gel unido al deslizamiento de la cubierta recubierta de aminosilano. A continuación, sumerja el resbalón de la cubierta de 12 milímetros con el hidrogel conectado en una placa predeterminada de 4 o 24 pocillos cubierta con 500 microlitros de PBS estéril o agua desionizada y el deslizamiento de la cubierta de 25 milímetros en una placa de 6 pocillos cubierta con dos mililitros de PBS estéril o agua desionizada durante 30 minutos.Después de eliminar el exceso de solución de acrilamida, guarde los hidrogeles en PBS estéril o agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Más tarde, aspire PBS o agua desionizada de la placa del pozo antes de agregar la solución de Sulfo-succinimidil o Sulfo-SUNPAH para cubrir el gel por completo. Y coloque los geles con la solución bajo una luz ultravioleta de 15 vatios y 365 nanómetros descubierta durante 10 minutos.Recolecte la mayor cantidad posible de Sulfo-SANPAH por solución inclinando la placa. Y luego lave el gel dos o tres veces con HEPES de 15 milimolares. Añadir 15 miligramos por mililitro de colágeno 1 diluido en ácido acético al 0,2% a cada pocillo que contenga el hidrogel.E incubar los geles durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, realice el lavado como se describe en el manuscrito antes de incubar los hidrogeles con PBS que contiene 10% de suero de caballo y 5% de FBS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de dos horas de incubación, agregue 500 microlitros de DMEM filtrado estéril con 10% FBS y 1% de estreptomicina de penicilina a cada pozo y almacene los geles a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Cuando el cultivo celular esté listo, placa aproximadamente 1.5 veces 10 a la cuarta 09-1 células por centímetro cuadrado en el medio bazell. Use pinzas para transportar los resbalones de la cubierta a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células que crecen directamente en la placa. Luego, fije las células usando 500 microlitros de 4% de paraformaldehído durante 10 minutos antes de tratar las células con 500 microlitros de 0.1% Triton X-100 a temperatura ambiente.Después de 15 minutos, camine las células con 250 microlitros de suero de burro al 10%. Teñir las células para F-actina con felodipina a una dilución de 1 a 400 en 250 microlitros de suero de burro al 10%, seguido de incubación con DAPI durante 10 minutos. Lave las células con PBS durante dos minutos antes de agregar de tres a cuatro gotas de medio de montaje a cada pozo.En un microscopio de fluorescencia, capture las imágenes de al menos tres fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel que produce canales individuales y combinados. En la evaluación de la rigidez del hidrogel a través de microscopía de fuerza atómica o AFM, la pendiente de la curva de fuerza fue suave para los hidrogeles blandos ya que la fuerza requerida de la sonda AFM fue menor. Sin embargo, en hidrogeles rígidos, la pendiente generada fue mucho más pronunciada.Las mediciones de AFM se utilizaron para calcular la rigidez promedio de los hidrogeles del módulo elástico de Young en kilopascales. Las características de crecimiento de las células P19 y 09-1 se observaron en hidrogeles de un kilopascale y 40 kilopascales de control y gel modificado. Las células 09-1 cultivadas en los sistemas de gel originales dieron como resultado un mayor número de células muertas.En contraste, las células 09-1 cultivadas en los sistemas de gel modificado exhibieron un crecimiento celular saludable y suficiente unión al sustrato de hidrogeles con poca cubierta celular indicada por células redondas mínimas. Las células P19 chapadas en ambos sistemas de hidrogel mostraron un exceso de células flotantes redondas y una falta de accesorios de sustrato celular. La compatibilidad de las células de la cresta neural o NCC con el sistema de hidrogel modificado se evaluó mediante tinción inmunofluorescente para AP-2.Se observó un aumento significativo en la expresión de AP-2 en células 09-1 chapadas en el sistema de hidrogel modificado. Además, las células 09-1 exhibieron diferentes morfologías basadas en los hidrogeles de baja o alta rigidez a través de cantidades variables de las fibras de estrés. La expresión de anti-vinculina en 09-1 células cultivadas en el hidrogel de 40 kilopascales fue mayor que las cultivadas en el hidrogel de un kilopascale, lo que refleja que las células cultivadas en sustratos más blandos forman complejos de adición focal mínimos que el sustrato rígido.El tiempo de espera adecuado es crucial para la polimerización de los hidrogeles, ya que las acrilamidas son tóxicas para las células. Sumerja los hidrogeles en PBS o agua desionizada durante al menos 30 minutos para garantizar mejores resultados.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

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Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

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