Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

Vi tackar Dr. Ana-Maria Zaske, operatör av Atomic Force Microscope-UT Core-anläggningen vid University of Texas Health Sciences Center, för den bidrog expertisen inom AFM i detta projekt. Vi tackar också finansieringskällorna från National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 och R01HL142704 till J. Wang).

1. Hydrogelberedning
OBS: Alla steg måste utföras i en cellodlingshuv som har desinficerats med etanol och ultraviolett (UV)-steriliserat före användning för att upprätthålla steriliteten. Verktyg, såsom pincett och pipetter, måste sprutas med etanol. Buffertlösningar måste också sterilt filtreras.
<ol><li>Beredning av aminosilanebelagda glasöverdrag<ol>
<li>Placera önskat antal glasöverdrag på en bit laboratorieservett. OBS: Förbered ytterligare 3-4 täckbesked för att ...

Målet med den aktuella studien är att tillhandahålla ett effektivt och effektivt in vitro-system för att bättre förstå effekten av mekaniska signaler i nccs. Förutom att följa det steg-för-steg-protokoll som nämns ovan måste forskare komma ihåg att cellkulturen hos O9-1 NCCs påverkas av den typ av glastäcke som används för att förbereda hydrogeler. Det noterades till exempel att celler som såtts på en viss typ av glastäcke (se tabellen över material) överlevde och spred si...

Neurala vapenceller (NCCs) är en grupp stamceller under ryggradsdjur embryogenes med en anmärkningsvärd förmåga att migrera och bidra till utvecklingen av olika organ och vävnader. NCCs kan skilja sig åt i olika celltyper, inklusive sensoriska nervceller, brosk, ben, melanocyter och släta muskelceller, beroende på platsen för axiellt ursprung och den lokala miljövägledningen för NCC1,2. Med förmågan att differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper kan genetiska avvikelser som orsakar dysregulation i något skede av neural crest (NC) utveckling leda till många medfödda sjukdomar2. Till exempel leder störningar under bildandet, migrationen och utvecklingen av nccs till utvecklingsstörningar som kollektivt kallas neurokristopater1,3. Dessa sjukdomar sträcker sig från kraniofacial defekter på grund av misslyckande i NCC-bildandet, såsom Treacher Collins syndrom, till utvecklingen av olika cancerformer på grund av NCC metastaserad migrationsförmåga, som ses i melanom3,4,5,6. Under de senaste decennierna har forskare gjort anmärkningsvärda upptäckter om nccs roller och mekanismer i utveckling och sjukdomar, med de flesta resultaten fokuserade på kemiska signaler7,8. På senare tid har mekaniska signaler indikerats spela en kritisk men dåligt förstådd roll i NCC-utveckling9,10.
De nationella centralbankernas miljösignaler spelar en avgörande roll under deras utveckling, inklusive regleringen av NCC-differentiering i olika celltyper. Miljösignaler, t.ex. fysiska signaler, påverkar pivotala beteenden och cellulära svar, såsom funktionell diversifiering. Mekanotransduktion gör det möjligt för celler att känna av och svara på dessa signaler för att upprätthålla olika biologiska processer2. NCCs är omgivna av närliggande celler och olika substrat, såsom den extracellulära matrisen (ECM), som kan ge upphov till mekaniska stimuli för att upprätthålla homeostas och anpassa sig till förändringarna genom ödesbestämning, spridning och apoptos11. Mekanotransduktion börjar vid plasmamembranet där den sensoriska komponenten i mekaniska extracellulära stimuli uppstår, vilket resulterar i intracellulär reglering av cellen12. Integriner, fokala vidhäftningar och korsningar av plasmamembranrelä mekaniska signaler, såsom skjuvningskrafter, stress och styvheten hos omgivande substrat, till kemiska signaler för att producera cellulära svar12. Reläing av kemiska signaler från plasmamembranet till den slutliga cellregleringen utförs via olika signalvägar för att slutföra vitala processer för organismen, såsom differentiering.
Flera studier har föreslagit att mekanisk signalering från substratstelhet spelar en roll i celldifferentiering13,14. Till exempel har tidigare studier visat att mesenkymala stamceller (MSCs) odlade på mjuka substrat med en styvhet som liknar den hos hjärnvävnad (i intervallet 0,1-1,0 kPa) resulterade i neuronal celldifferentiering15,16. Emellertid, mer MSCs differentieras i myocyt-liknande celler när odlade på 8-17 kPa substrat som efterliknar styvheten i muskeln, medan osteoblast-liknande differentiering observerades när MSCs odlades på styva substrat (25-40 kPa)15,16. Betydelsen av mekanotransduktion belyses av oegentligheter och avvikelser i den mekaniska signalvägen som potentiellt leder till allvarliga utvecklingsdefekter och sjukdomar, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar och osteoporos17,18,19. Vid cancer är normal bröstvävnad mjuk, och risken för bröstcancer ökar i stel och tät bröstvävnad, en miljö som mer liknar brösttumörer15. Med denna kunskap kan effekterna av mekanisk signalering på NCC-utveckling studeras genom enkel manipulering av substratstelhet genom ett in vitro-system, vilket ger ytterligare fördelar och möjligheter att förstå grunderna i NC-relaterad sjukdomsprogression och etiologi.
För att studera effekten av mekaniska signaler i nccs etablerade vi ett effektivt in vitro-system för nccs baserat på optimering av tidigare publicerade metoder och utvärdering av nccs svar på olika mekaniska signaler20,21. Ett detaljerat protokoll tillhandahölls för varierande hydrogel styvhet förberedelse och utvärdering av effekterna av mekanisk signalering i NCCs. För att uppnå detta används O9-1 NCCs som NC-modell för att studera effekterna och förändringarna som svar på styva kontra mjuka hydrogeler. O9-1 NCCs är en stabil NC-cellinje isolerad från musembryon (E) dag 8.5. O9-1 NCCs efterliknar nccs in vivo eftersom de kan skilja sig åt i olika NC-härledda celltyper i definierade differentieringsmedier22. För att studera den mekaniska signalningen av nccs tillverkades ett matrissubstrat med tunable elasticitet från varierande koncentrationer av akrylamid och bis-akrylamidlösningar för att uppnå önskad styvhet, korrelera till den biologiska substratstyvheten20,21,23. För att optimera villkoren för matrissubstrat för NCCs, särskilt O9-1 celler, gjordes ändringar från det tidigare publicerade protokollet20. En förändring som gjordes i detta protokoll var att inkubera hydrogeler i kollagen I, utspädd i 0,2% ättiksyra istället för 50 mM HEPES, vid 37 °C över natten. Det låga pH-värdet av ättiksyra leder till en homogen fördelning och högre kollagen I-inkorporering, vilket möjliggör en mer enhetlig fastsättning av ECM-proteinet24. Dessutom användes en kombination av hästserum och fetala bovin serum (FBS) i koncentrationerna av 10% respektive 5% i fosfatbuffert saltlösning (PBS), innan hydrogelerna i inkubatorn förvarades. Hästserum användes som ett extra komplement till FBS på grund av dess förmåga att främja cellproliferation och differentiering vid koncentrationen av 10%25.
Med denna metod efterliknades en biologisk miljö av ECM-proteinbeläggningen (t.ex. kollagen I) för att skapa en exakt in vitro-miljö för nccs att växa och överleva20,21. Styvheten hos de beredda hydrogelerna analyserades kvantitativt via atomkraftmikroskopi (AFM), en välkänd teknik för att skildra den elastiska modulus26. För att studera effekten av olika styvhetsnivåer på NCCs odlades och framställdes vilda O9-1-celler på hydrogeler för immunofluorescens (IF) färgning mot filamentös aktin (F-aktin) för att visa skillnaderna i cell vidhäftning och morfologier som svar på förändringar i substrate styvhet. Med hjälp av detta in vitro-system kommer forskare att kunna studera rollerna för mekanisk signalering i NCC och dess interaktion med andra kemiska signaler för att få en djupare förståelse för förhållandet mellan NCCs och mekanisk signalering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Neurala vapenceller (NCCs) är ryggradsdjur embryonala multipotenta celler som kan migrera och differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper som ger upphov till olika organ och vävnader. Vävnadsstelhet ger mekanisk kraft, en fysisk signal som spelar en avgörande roll i NCC-differentiering; Mekanismen är dock fortfarande oklar. Metoden som beskrivs här ger detaljerad information för optimerad generering av polyakrylamidhydrogeler med varierande styvhet, noggrann mätning av sådan styvhet och utvärdering av effekten av mekaniska signaler i O9-1-celler, en NCC-linje som efterliknar in vivo NCCs.
Hydrogel styvhet mättes med hjälp av atomkraft mikroskopi (AFM) och anges olika styvhet nivåer i enlighet därmed. O9-1 NCCs odlade på hydrogeler av varierande styvhet visade olika cell morfologi och gen uttryck av stress fibrer, som anges varierande biologiska effekter orsakas av mekaniska signal förändringar. Dessutom fastställde detta att varierad hydrogelstyvhet resulterade i ett effektivt in vitro-system för att manipulera mekanisk signalering genom att ändra gelstyvhet och analysera den molekylära och genetiska regleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan differentieras till ett brett spektrum av celltyper under påverkan av motsvarande differentieringsmedium, och det är bekvämt att manipulera kemiska signaler in vitro. Därför är detta in vitro-system ett kraftfullt verktyg för att studera den mekaniska signaleringens roll i NCCs och dess interaktion med kemiska signaler, vilket hjälper forskare att bättre förstå de molekylära och genetiska mekanismerna för neural vapenutveckling och sjukdomar.

Hydrogelberedning och styvhetsbedömning genom AFM och Hertz-modellen Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att generera polyakrylamidhydrogeler med varierande styvhet genom att reglera förhållandet mellan akrylamid och bisakryamid. Polyakrylamidhydrogelerna är dock inte redo för vidhäftning av celler på grund av bristen på ECM-proteiner. Således binder sulfo-SANPAH, som fungerar som en länkare, kovalent till hydrogelerna och reagerar med de primära aminer av ECM-proteiner för ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Detaljerade steg-för-steg protokoll beskrivs här för att studera mekaniska signaler in vitro med hjälp av multipotenta O9-1 neurala vapenceller och polyakrylamid hydrogeler av varierande styvhet.

Ett optimerat O9-1/Hydrogel-system för att studera mekaniska signaler i neurala vapenceller

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Metoden hjälper till att studera den mekaniska signalningen av neurala vapenceller och dess interaktion med kemiska signaler. Det kan också hjälpa till i de molekylära och genetiska mekanismerna i neurala vapen utveckling i sjukdomar. Överför glasskyddssneden är den mest utmanande och överför dem därför långsamt och uppmärksamt för att förhindra att de går sönder och tappar dem.Jag och dr Sherry Zhao, postdoktor från mitt laboratorium. Börja med att placera önskat antal glasskyddsslir på en bit laboratorieservett. Sterilisera sedan varje täcksläpning genom att passera den fram och tillbaka genom alkoholbrännarens flamma.När locket sjunker, täck 12 millimeters täckslip med cirka 200 mikroliter och 25 millimeters täckglidning med 800 mikroliter av 0,1 molar natriumhydroxid. Efter fem minuter aspirera natriumhydroxid och låt locket lufttorka i fem minuter för att bilda en jämn film. När täcksnedlarna torkas, tillsätt cirka 18 mikroliter aminopropyltrietoxisalane eller APTS på en 12 millimeters täckglidning och 150 mikroliter APTS på en 25 millimeters täckglidning.Aspirate åtkomst APTS så att resterna APTS kan torka i fem minuter. Skölj senare locket tre gånger genom att sänka dem i sterilt avjoniserat vatten i fem minuter varje gång. Flytta de tvättade täcksneden till en färsk Petri-skål med den reaktiva sidan vänd uppåt.Och behandla täcksnedstegen genom att blötlägga i tillräckligt med 0,5% glutaraldehyd i 30 minuter. Efter att ha aspirerat glutaraldehyden, skölj täcksneddragen en gång med avjoniserat vatten i tre minuter och lufttorka locket glider med den reaktiva sidan upp. För att förbereda de silikoniserade täcksedlarna, placera lika många täcksläckningar som det aminosilanebelagda locket glider i en Petri-maträtt fodrad med parafilm.Behandla sedan 12 millimeters täcksnedgångar med 40 mikroliter och 25 millimeters täckglidningar med 150 mikroliter diklormetansilian eller DCMS i fem minuter. Tvätta täcksedlarna med sterilt avjoniserat vatten en gång i en minut innan du placerar de reaktiva täcksnedstegen med framsidan uppåt på en laboratorieservett. För att förbereda hydrogelerna, pipetten nyberedd akrylamidgellösning på de torkade aminosilanebelagda täcksläckorna.Använd böjda pincett, överför omedelbart den DCMS-behandlade täcksläcket ovanpå gellösningen med den behandlade sidan vidrör gellösningen och byt gelélösningen så att sandwiching ändrar gellösningen mellan två täcksnedslag. När gelén har polymeriserats, separera den DCMS-behandlade täckglidningen med böjda pincett och lämna gelén fäst vid den aminosilanebelagda täckglidningen. Sänk sedan ned 12 millimeters täcksläp med den bifogade hydrogelen i en förutbestämd 4-brunns- eller 24-välplatta täckt med 500 mikroliter steril PBS eller avjoniserat vatten och 25 millimeters lock glider i en 6-välplatta täckt med två milliliter steril PBS eller avjoniserat vatten i 30 minuter.Efter att ha avlägsnat överflödig akrylamidlösning, förvara hydrogelerna i steril PBS eller avjoniserat vatten i rumstemperatur i 30 minuter. Senare, aspirera PBS eller avjoniserat vatten från brunnsplattan innan du tillsätter Sulfo-succinimydyl eller Sulfo-SUNPAH lösning för att täcka gelén helt. Och placera gelerna med lösningen under ett ultraviolett ljus på 15 watt, 365 nanometer som avtäckts i 10 minuter.Samla så mycket av Sulfo-SANPAH per lösning som möjligt genom att luta plattan. Och tvätta sedan gelén två till tre gånger med 15 millimolar HEPES. Tillsätt 15 milligram per milliliter Kollagen 1 utspädd i 0,2% ättiksyra till varje brunn som innehåller hydrogelen.Och inkubera gelerna över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Nästa dag, utför tvätten som beskrivs i manuskriptet innan du inkuberar hydrogelerna med PBS som innehåller 10% hästserum och 5%FBS vid 37 Celsius och 5% koldioxid. Efter två timmars inkubation tillsätt 500 mikroliter sterilt filtrerat DMEM med 10% FBS och 1% penicillin streptomycin till varje brunn och lagra gelerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.När cellkulturen är klar, plätera cirka 1,5 gånger 10 till den fjärde 09-1-cellerna per centimeter i kvadrat i bazellmediet. Använd pincett för att transportera täcksläparna till en ny platta för att minimera falska signaler från cellerna som odlas direkt på plattan. Fixera sedan cellerna med 500 mikroliter av 4% paraformaldehyd i 10 minuter innan du behandlar cellerna med 500 mikroliter på 0,1% Triton X-100 vid rumstemperatur.Efter 15 minuter, gå cellerna med 250 mikroliter av 10% åsne serum. Färga cellerna för F-aktin med kattodipin vid en utspädning av 1 till 400 i 250 mikroliter av 10% åsneserum, följt av inkubation med DAPI i 10 minuter. Tvätta cellerna med PBS i två minuter innan du lägger till tre till fyra droppar monteringsmedium till varje brunn.På ett fluorescensmikroskop, fånga bilderna av minst tre slumpmässiga ramar per hydrogelprov som producerar enskilda och sammanslagna kanaler. I styvhetsbedömningen av hydrogelen genom atomkraftmikroskopi eller AFM var kraftkurvans lutning skonsam för mjuka hydrogeler eftersom den erforderliga kraften från AFM-sonden var mindre. Men på styva hydrogeler var den genererade sluttningen mycket brantare.AFM-mätningarna användes sedan för att beräkna den genomsnittliga styvheten hos hydrogeler från Youngs elastiska modul i kilopascals. Tillväxtegenskaperna hos P19- och 09-1-celler observerades i en kilopascal och 40 kilopascals hydrogeler av kontroll och modifierade gelsystem. De 09-1 celler som odlades på de ursprungliga gelsystemen resulterade i ett högre antal döda celler.Däremot uppvisade de 09-1 celler som odlades på de modifierade gelsystemen en sund celltillväxt och tillräcklig fastsättning på hydrogelernas substrat med lite celldäck som indikerades av minimala runda celler. P19-cellerna pläterade på båda hydrogelsystemen uppvisade ett överskott av runda flytande celler och brist på cellsubstrattillbehör. Kompatibiliteten hos neurala crest celler eller NCCs med modifierade hydrogel systemet bedömdes av immunofluorescent färgning för AP-2.En betydande ökning av AP-2 uttryck i 09-1 celler pläterade på det modifierade hydrogel systemet observerades. Dessutom uppvisade 09-1-cellerna olika morfologier baserade på låg eller hög styvhet hydrogeler genom olika mängder av stressfibrerna. Antivinkulinuttrycket i 09-1 celler som odlades på 40 kilopascals hydrogel var högre än de som odlades på en kilopascal hydrogel vilket återspeglar att cellerna som odlas på mjukare substrat bildar minimala fokala tillsatskomplex än det styva substratet.Lämplig väntetid är avgörande för polymerisationen av hydrogelerna eftersom akrylamider är giftiga för cellerna. Sänk ner hydrogelerna i PBS eller avjoniserat vatten i minst 30 minuter för att säkerställa bättre resultat.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic tillvägagångssätt för att bedöma Bildande av neurala anslutningar i en samodlingssystemet

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiserad tillvägagångssätt för multispecies Rening av mammaliska manliga cellceller genom mekanisk vävnadsdissociation och flödescytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollerad kortikal effekt modell av mus hjärnskada med terapeutisk transplantation av humana inducerade pluripotenta stamceller-härledda neurala celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolering, kultur och adipogenic Induktion av neurala Crest Original Fett-Härledda stamceller från periaorektisk fettvävnad

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...