Name: an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Atomik Kuvvet Mikroskop-UT Çekirdek tesisinin işletmecisi Dr. Ana-Maria Zaske'ye bu projede AFM'ye katkı sağlayan uzmanlığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ve R01HL142704'ten J. Wang'a) finansman kaynaklarına teşekkür ederiz.

1. Hidrojel hazırlama
NOT: Tüm adımlar, steriliteyi korumak için kullanılmadan önce etanol ve ultraviyole (UV) ile dezenfekte edilmiş bir hücre kültürü davlumbazında yapılmalıdır. Cımbız ve pipet gibi aletler etanol ile püskürtülmelidir. Tampon çözeltileri de steril filtrelenmelidir.
<ol><li>Aminosilane kaplı cam kapakların hazırlanması<ol>
<li>İstediğiniz sayıda cam örtü parçasını bir laboratuvar mendilinin üzerine yerleştirin. NOT: Kolayca kırılırk...

Mevcut çalışmanın amacı, NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini daha iyi anlamak için etkili ve verimli bir in vitro sistem sağlamaktır. Yukarıda belirtilen adım adım protokolü takip ederek, araştırmacıların O9-1 NCC'lerin hücre kültürünün hidrojel hazırlamak için kullanılan cam kapakların türünden etkilendiğini akılda tutmaları gerekir. Örneğin, belirli bir cam kapak kapağı türüne tohumlanmış hücrelerin (Bkz. Malzeme Tablosu)hayatta kaldığı ve iyi ço...

Nöral kret hücreleri (NCC'ler), omurgalı embriyogenez sırasında çeşitli organ ve dokuların gelişimine katkıda bulunma ve göç etme yeteneğine sahip bir grup kök hücredir. NCC'ler, eksenel kökenlinin konumuna ve NCC1,2'ninyerel çevresel rehberliğine bağlı olarak duyusal nöronlar, kıkırdak, kemik, melanositler ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılık gösterilebilir. Çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşma yeteneği ile, nöral kret (NC) gelişiminin herhangi bir aşamasında düzensizliğe neden olan genetik anormallikler çok sayıda doğumsal hastalığa yol açabilir2. Örneğin, NCC'lerin oluşumu, göçü ve gelişimi sırasındaki pertürbasyonlar, toplu olarak nörokristopatiler olarak bilinen gelişimsel bozukluklara yol açar1,3. Bu hastalıklar, Treacher Collins sendromu gibi NCC oluşumundaki başarısızlığa bağlı kraniyofasiyal defektlerden, melanom3,4,5,6'dagörüldüğü gibi NCC metastatik göçmen yeteneğine bağlı çeşitli kanserleringelişmesinekadar uzanır. Son birkaç on yılda, araştırmacılar NCC'lerin gelişim ve hastalıklardaki rolleri ve mekanizmaları hakkında dikkat çekici keşifler yaptılar, bulguların çoğu kimyasal sinyallere odaklandı7,8. Daha yakın zamanda, mekanik sinyallerin NCC gelişiminde kritik ama iyi anlaşılmamış bir rol oynadığı belirtilmiştir9,10.
NCC'lerin çevresel ipuçları, NCC farklılaşmanın çeşitli hücre türlerine düzenlenmesi de dahil olmak üzere gelişimleri sırasında kritik bir rol oynar. Çevresel ipuçları, örneğin, fiziksel ipuçları, işlevsel çeşitlendirme gibi önemli davranışları ve hücresel yanıtları etkiler. Mechanotransduction, hücrelerin çeşitli biyolojik süreçleri sürdürmek için bu ipuçlarını hissetmelerini ve yanıt vermelerini sağlar2. NCC'ler komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) gibi farklı substratlarla çevrilidir, bu da homeostazı korumak ve kader belirleme, çoğalma ve kesmez yoluyla değişikliklere uyum sağlamak için mekanik uyaranlara yol açabilir11. Mechanotransduction, mekanik hücre dışı uyaranların duyusal bileşeninin meydana geldiği plazma zarında başlar ve hücre içi düzenleme ile sonuçlanır12. Plazma zarının bütünleşimleri, odak yapışmaları ve kavşakları, kesme kuvvetleri, stres ve çevredeki substratların sertliği gibi mekanik sinyalleri hücresel yanıtlar üretmek için kimyasal sinyallere röle eder12. Plazma membranından gelen kimyasal sinyallerin son hücresel düzenlemeye aktarılması, organizma için farklılaşma gibi hayati süreçleri sonuçlandırmak için farklı sinyal yolları aracılığıyla gerçekleştirilir.
Çeşitli çalışmalar, substrat sertliğinden mekanik sinyal vermenin hücre farklılaşmasında rol oynadığını ileri sürtünmektedir13,14. Örneğin, önceki çalışmalar, beyin dokusununkine benzer bir sertliğe sahip yumuşak substratlarda yetişen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) nöronal hücre farklılaşmasına neden olduğunu göstermiştir15,16. Bununla birlikte, daha fazla MSC, kas sertliğini taklit eden 8-17 kPa substratlarında büyüdüğünde miyosit benzeri hücrelere farklılık sağlarken, MSC'ler sert substratlar üzerinde kültürlendiğinde osteoblast benzeri farklılaşma gözlenmiştir (25-40 kPa)15,16. Mekanotransdüksiyonun önemi, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve osteoporoz17 , 18,19dahil olmak üzere ciddi gelişimsel kusurlara ve hastalıklara yol açabilecek mekanik sinyal yollarındaki düzensizlikler ve anormallikler ile vurgulanır. Kanserlerde normal meme dokusu yumuşaktır ve meme kanseri riski artar Sert ve yoğun meme dokusunda, meme tümörlerine daha çok benzeyen bir ortam15. Bu bilgi birikimi ile, mekanik sinyalizasyonun NCC gelişimi üzerindeki etkileri, bir in vitro sistem aracılığıyla substrat sertliğinin basit manipülasyonu ile incelenebilir ve NC ile ilgili hastalığın ilerlemesinin ve etiyolojisinin temellerini anlamada daha fazla avantaj ve olasılık sağlar.
NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini incelemek için, daha önce yayınlanan yöntemlerin optimizasyonuna ve NCC'lerin farklı mekanik sinyallere verdiği yanıtların değerlendirilmesine dayanan NCC'ler için verimli bir in vitro sistem kurduk20,21. NCC'lerde mekanik sinyalizasyonun etkisinin farklı hidrojel sertliği hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bunu başarmak için, O9-1 NCC'ler sert ve yumuşak hidrojellere yanıt olarak etkileri ve değişiklikleri incelemek için NC modeli olarak kullanılır. O9-1 NCC'ler, 8.5. günde fare embriyosundan (E) izole edilmiş kararlı bir NC hücre hattıdır. O9-1 NCC'ler, tanımlanmış farklılaşma ortamı22'deçeşitli NC türevli hücre türlerine farklılaşabildiğinden, NCC'leri in vivo olarak taklit eder. NCC'lerin mekanik sinyallerini incelemek için, istenen sertliği elde etmek için çeşitli akrilamid ve bis-akrilamid çözelti konsantrasyonlarından ayarlanabilir elastikiyetli bir matris substratı imal edildi, biyolojik substrat sertliği20 , 21,23ile ilişkili. NCC'ler, özellikle O9-1 hücreleri için matris substrat koşullarını optimize etmek için, daha önce yayınlanan protokol20'dendeğişiklikler yapıldı. Bu protokolde yapılan bir değişiklik, kollajen I'deki hidrojelleri kuluçkaya yatırmaktı, bir gecede 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitle seyreltildi. Asetik asidin düşük pH'ı homojen bir dağılıma ve daha yüksek kollajen I bünyesine yol açar, böylece ECM proteininin daha düzgün bir şekilde bağlanmasına izin verir24. Ek olarak, hidrojelleri inkübatörde depolamadan önce, fosfat tampon salininde (PBS) sırasıyla% 10 ve% 5 konsantrasyonlarında at serumu ve fetal sığır serumu (FBS) kombinasyonu kullanılmıştır. At serumu, % 1025konsantrasyonda hücre çoğalmasını ve farklılaşmayı teşvik etme yeteneği nedeniyle FBS'ye ek bir takviye olarak kullanılmıştır.
Bu yöntemle, NCC'lerin büyümesi ve hayatta kalması için doğru bir in vitro ortam oluşturmak için ECM protein kaplaması (örneğin, Kollajen I) tarafından biyolojik bir ortam taklit edildi20,21. Hazırlanan hidrojellerin sertliği, elastik modül26'yıtasvir etmek için iyi bilinen bir teknik olan atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nicel olarak analiz edildi. Farklı sertlik seviyelerinin NCC'ler üzerindeki etkisini incelemek için, vahşi tip O9-1 hücreleri, substrat sertliğindeki değişikliklere yanıt olarak hücre yapışması ve morfolojilerindeki farklılıkları göstermek için filamentli aktilona (F-actin) karşı immünofluoresans (IF) lekelenmesi için hidrojeller üzerinde kültürlendi ve hazırlandı. Bu in vitro sistemi kullanan araştırmacılar, NCC'lerdeki mekanik sinyallemenin rollerini ve diğer kimyasal sinyallerle etkileşimini inceleyerek NCC'ler ve mekanik sinyaller arasındaki ilişkiyi daha derinlemesine anlayabilecekler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis-Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1763-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well cell culture plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>J61899-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM cantilever (spherical bead)</td>
			<td>Novascan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Catalyst NanoScope</td>
			<td></td>
			<td>Model: 8.15 SR3R1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>248614</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AP-2&#945; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-12726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Vinculin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I (100mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Model DMi8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin antibiotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile deionized water</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>U284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized o9-1/hydrogel system for studying mechanical signals in neural crest cells

Nöral kret hücreleri (NCC'ler), çeşitli organ ve dokulara yol açan çok çeşitli hücre tiplerine göç ürebilen ve farklılaşabilen omurgalı embriyonik multipotent hücrelerdir. Doku sertliği, NCC farklılaşmasında kritik bir rol oynayan fiziksel bir işaret olan mekanik kuvvet üretir; ancak mekanizma belirsizliğini koruyor. Burada açıklanan yöntem, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojellerin optimize edilmiş üretimi, bu sertliğin doğru ölçümü ve vivo NCC'leri taklit eden bir NCC hattı olan O9-1 hücrelerindeki mekanik sinyallerin etkisinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bilgi sağlar.
Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak ölçüldü ve buna bağlı olarak farklı sertlik seviyeleri belirtildi. Değişen sertlikte hidrojeller üzerinde kültürlenen O9-1 NCC'ler, mekanik sinyal değişikliklerinin neden olduğu çeşitli biyolojik etkilere işaret eden farklı hücre morfolojisi ve stres liflerinin gen ekspresyonunun farklı olduğunu göstermiştir. Dahası, bu, hidrojel sertliğinin değiştirilmesinin, jel sertliğini değiştirerek ve NCC'lerdeki moleküler ve genetik regülasyonu analiz ederek mekanik sinyali manipüle etmek için etkili bir in vitro sistemle sonuçlendiğini ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, bu in vitro sistem, NCC'lerde mekanik sinyalin rolünü ve kimyasal sinyallerle etkileşimini incelemek için güçlü bir araçtır, bu da araştırmacıların sinirsel tepe gelişimi ve hastalıklarının moleküler ve genetik mekanizmalarını daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.

AFM ve Hertz modeli ile hidrojel hazırlama ve sertlik değerlendirmesi Burada akrilamid ve bis-akrilamid oranını düzenleyerek değişen sertlikte poliakrilamid hidrojeller üretmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bununla birlikte, poliakrilamid hidrojeller ECM proteinlerinin eksikliği nedeniyle hücrelerin yapıştırılmasına hazır değildir. Böylece, bir bağlayıcı olarak hareket eden sulfo-SANPAH, UV aktivasyonundan sonra sülfo-SANPAH'taki N-hidroksisuçinid es...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells at JoVE.com

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Yöntem, nöral kret hücrelerinin mekanik sinyallerinin ve kimyasal sinyallerle etkileşiminin incelenmesine yardımcı olur. Ayrıca hastalıklarda nöral kret gelişiminin moleküler ve genetik mekanizmalarına yardımcı olabilir. Cam kapak kaymalarını aktarmak en zor olanıdır, bu nedenle kırılmalarını ve düşmelerini önlemek için yavaşça ve dikkatlice aktarın.Prosedürü gösteren ben ve laboratuvarımdan doktora sonrası bir adam olan Dr. Sherry Zhao olacak. İstediğiniz sayıda cam kapak fişini bir laboratuvar mendili parçasına yerleştirerek başlayın. Daha sonra her kapak kaymasını alkol yakıcının alevinden ileri geri geçirerek sterilize edin.Kapak kaydığında, 12 milimetrelik kapak kaymasını yaklaşık 200 mikrolitre ve 25 milimetre kapak kaymasını 800 mikrolitre 0,1 molar sodyum hidroksit ile örtün. Beş dakika sonra, sodyum hidroksit aspire edin ve kapak kaymalarının eşit bir film oluşturmak için beş dakika boyunca kurumasını bekleyin. Kapak kaymaları kuruduktan sonra, 12 milimetrelik bir kapak kaymasına yaklaşık 18 mikrolitre aminopropil triethoxysilane veya APTS ve 25 milimetrelik kapak kaymasına 150 mikrolitre APTS ekleyin.Artık APTS'nin beş dakika kurumasını sağlamak için APTS'ye erişim apireti yapın. Daha sonra, kapak kaymalarını her seferinde beş dakika steril deiyonize suya batırarak üç kez durulayın. Yıkanmış kapak kaymalarını, reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde taze bir Petri kabına taşıyın.Ve kapak kaymalarını 30 dakika boyunca yeterli% 0.5 glutaraldehit içine batırarak tedavi edin. Glutaraldehiti aspire ettikten sonra, kapak kaymalarını üç dakika boyunca deiyonize suyla bir kez durulayın ve kapak kaymalarını reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde kurulayın. Silikon kaplı kapak kaymalarını hazırlamak için, aminosilane kaplı kapak kaymaları para filmi ile kaplı bir Petri kabına kaydığı için eşit sayıda kapak kayması yerleştirin.Daha sonra, 12 milimetrelik kapak kaymalarını 40 mikrolitre ve 25 milimetre kapak kaymalarını 150 mikrolitre dikloromethane silane veya DCMS ile beş dakika boyunca tedavi edin. Reaktif kapak kaymalarını laboratuvar silme işlemine yüzüstü yerleştirmeden önce kapak kaymalarını steril deiyonize suyla bir dakika boyunca yıkayın. Hidrojelleri hazırlamak için pipet, kurutulmuş aminosilane kaplı kapak kaymalarına taze hazırlanmış akrilamid jel çözeltisi.Kavisli cımbız kullanarak, DCMS işlem görmüş kapak fişini jel çözeltisinin üzerine derhal aktarın ve işlenmiş taraf jel çözeltiye dokunur, böylece jel çözeltisini iki kapak kayması arasında değiştirin. Jel polimerize edildikten sonra, DCMS işlem görmüş kapak kaymasını kavisli cımbızla ayırın ve jeli aminosilane kaplı kapak kaymasına bağlı bırakın. Daha sonra, 12 milimetrelik kapak kaymasını önceden belirlenmiş 4 kuyulu veya 24 kuyulu bir plaka ile 500 mikrolitre steril PBS veya deiyonize su ile kaplanmış ve 25 milimetrelik kapak kaymasını 30 dakika boyunca iki mililitre steril PBS veya deiyonize su ile kaplı 6 kuyulu bir plakaya batırın.Fazla akrilamid çözeltisini çıkardıktan sonra, hidrojelleri steril PBS veya deiyonize suda oda sıcaklığında 30 dakika saklayın. Daha sonra, jeli tamamen örtmek için Sulfo-succinimydyl veya Sulfo-SUNPAH çözeltisi eklemeden önce kuyu plakasından PBS veya deiyonize su epire edin. Ve çözeltili jelleri 10 dakika boyunca açık 15 watt, 365 nanometre ultraviyole ışığın altına yerleştirin.Plakayı yatırarak çözelti başına mümkün olduğunca Sulfo-SANPAH toplayın. Ve sonra jeli 15 milimolar HEPES ile iki ila üç kez yıkayın. Hidrojel içeren her kuyuya mililitre başına 15 miligram ekleyin Kollajen 1% 0.2 asetik asitte seyreltilmiş.Ve jelleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatır. Ertesi gün, hidrojelleri% 10 at serumu ve 37 Santigrat'ta% 5 FBS ve% 5 karbondioksit içeren PBS ile kuluçkaya yatırmadan önce el yazmasında açıklandığı gibi yıkamayı gerçekleştirin. İki saatlik inkübasyondan sonra, her kuyuya%10 FBS ve %1 penisilin streptomisi ile 500 mikrolitre steril filtreli DMEM ekleyin ve jelleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte saklayın.Hücre kültürü hazır olduğunda, bazell ortamında santimetre başına yaklaşık 1,5 çarpı 10 ila dördüncü 09-1 hücreyi plakalayın. Doğrudan tabağa yetiştirilen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için kapak kaymalarını yeni bir tabağa taşımak için cımbız kullanın. Daha sonra, 500 mikrolitre %4 paraformaldehit kullanarak hücreleri oda sıcaklığında %0,1 Triton X-100'lük 500 mikrolitre ile tedavi etmeden önce 10 dakika sabitleyin.15 dakika sonra, % 10 eşek serumunun 250 mikrolitresi ile hücreleri gezdirin. F-actin hücrelerini% 10 eşek serumunun 250 mikrolitresinde 1 ila 400 seyreltmede felodipinin ile lekeleyin, ardından 10 dakika boyunca DAPI ile inkübasyon yapın. Her kuyuya üç ila dört damla montaj ortamı eklemeden önce hücreleri PBS ile iki dakika yıkayın.Floresan mikroskopta, hidrojel numune başına en az üç rastgele karenin görüntülerini yakalayın ve bireysel ve birleştirilmiş kanallar üretin. Hidrojelin atomik kuvvet mikroskopisi veya AFM yoluyla sertlik değerlendirmesinde, AFM probundan gerekli kuvvet daha az olduğu için kuvvet eğrisinin eğimi yumuşak hidrojeller için yumuşaktı. Bununla birlikte, sert hidrojellerde, üretilen eğim çok daha dikti.AFM ölçümleri daha sonra Young'ın kilopaskallerdeki elastik modülünden hidrojellerin ortalama sertliğini hesaplamak için kullanıldı. P19 ve 09-1 hücrelerinin büyüme özellikleri bir kilopaskal ve 40 kilopaskal hidrojel kontrol ve modifiye jel sistemlerinde gözlendi. Orijinal jel sistemlerinde yetişen 09-1 hücreleri daha fazla sayıda ölü hücre ile sonuçlandı.Buna karşılık modifiye jel sistemlerinde yetişen 09-1 hücreleri sağlıklı hücre büyümesi ve minimum yuvarlak hücrelerle belirtilen az hücre destesi ile hidrojel substrata yeterli bağlanma gösterdi. Her iki hidrojel sistemde de kaplanmış P19 hücreleri, yuvarlak yüzen hücrelerin fazlalığını ve hücre substrat ataşmanlarının eksikliğini gösterdi. Nöral kret hücrelerinin veya NCC'lerin modifiye hidrojel sistemi ile uyumluluğu AP-2 için immünoflooresan boyama ile değerlendirildi.Modifiye hidrojel sistem üzerine kaplanmış 09-1 hücrede AP-2 ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlenmiştir. Ek olarak, 09-1 hücreleri, stres liflerinin değişen miktarları aracılığıyla düşük veya yüksek sertlikteki hidrojellere dayanan farklı morfolojiler sergiledi. 40 kilopaskal hidrojel üzerinde yetiştirilen 09-1 hücredeki anti-vinkülin ekspresykülü, daha yumuşak substratlarda yetişen hücrelerin sert substrattan minimum odak ekleme kompleksleri oluşturduğunu yansıtan bir kilopaskal hidrojelde yetişenlerden daha yüksekti.Akrilamidler hücreler için toksik olduğu için hidrojellerin polimerizasyonu için uygun bekleme süresi çok önemlidir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için hidrojelleri PBS veya deiyonize suya en az 30 dakika batırın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...