Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة زمالة من مستشفيات شرينرز للأطفال SHC-84706.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الجراحية ورعاية الحيوانات التالية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة تمبل. البروتوكول الموصوف هو جراحة البقاء على قيد الحياة ، وتم قتل الحيوانات في النهاية عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم عند الانتهاء من نقاطها ال?...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+plasticity+and+sparing+of+function+after+spinal+cord+damage+in+neonatal+cats.">Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats.</a> Science. 217 (4559), 553-555 (1982).</li><li>Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+corticospinal+projections+after+large+lesions+of+the+cerebral+hemisphere+in+neonatal+rats.">Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats.</a> Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).</li><li>Commissiong, J. W., Toffano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+transection+at+different+postnatal+ages:+Recovery+of+motor+coordination+correlated+with+spinal+cord+catecholamines.">Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines.</a> Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).</li><li>Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+neuropathology+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+developing+and+adult+rats.">Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualizing+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>Pawliuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+sickle+cell+disease+in+transgenic+mouse+models+by+gene+therapy.">Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy.</a> Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).</li><li>Atasoy, D., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+tools+for+causal+cellular+and+neuronal+biology.">Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).</li><li>Brandt, H. M., Apkarian, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-dextran:+A+sensitive+anterograde+tracer+for+neuroanatomic+studies+in+rat+and+monkey.">Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey.</a> Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Reiner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).</li><li>Oguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+virus+vector+infection+to+the+prefrontal+network+of+the+macaque+brain.">Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain.</a> PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).</li><li>Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+corticospinal+tract+following+midthoracic+spinal+injury+in+the+postnatal+rat.">Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).</li><li>Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+young+rats.">Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).</li><li>Tillakaratne, N. J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+of+stepping+in+rats+after+a+complete+neonatal+spinal+cord+transection+is+not+due+to+regrowth+across+the+lesion+site.">Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site.</a> Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).</li><li>Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+analysis+of+motor+cortical+plasticity+after+cortical+lesions+in+newborn+rats.">Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats.</a> Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).</li><li>Gennaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stroke+in+the+developing+rat+motor+cortex+induces+age-+and+experience-dependent+maladaptive+plasticity+of+corticospinal+system.">Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).</li><li>Brichta, A. M., Grant, G., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitectural+organization+of+the+spinal+cord.">Cytoarchitectural organization of the spinal cord.</a> The rat nervous system. 2, 294-309 (1985).</li><li>Kjell, J., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+models+of+spinal+cord+injury:+From+pathology+to+potential+therapies.">Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).</li><li>Takeoka, A., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+local+proprioceptive+feedback+circuits+initiate+and+maintain+locomotor+recovery+after+spinal+cord+injury.">Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury.</a> Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).</li><li>Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+propriospinal+interneurons+in+recovery+from+spinal+cord+injury.">The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).</li><li>Ohne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+in+rats+with+cervical+spinal+cord+hemisection-neuroanatomical+validation.">Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation.</a> IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills.">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li><li>Sheikh, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrogradely+transportable+lentivirus+tracers+for+mapping+spinal+cord+locomotor+circuits.">Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487, 235-238 (2012).</li><li>Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+injection+of+a+lentiviral+vector+highlights+multiple+motor+pathways+in+the+rat+spinal+cord.">Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).</li><li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. J., Moon, L. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+A+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).</li><li>Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+as+a+tracer+for+labeling+axons:+Implications+for+axon+regeneration.">Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration.</a> Plos One. 9 (2), 87447 (2014).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Abdellatif, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+spinal+cord:+Comparison+between+lentiviral,+adenoviral,+and+retroviral+vector+delivery+systems.">delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).</li><li>Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+and+application+of+anterograde+transsynaptic+AAV+for+probing+neural+circuitry.">Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+after+cervical+spinal+cord+hemisection+in+rats:+A+comparison+of+juveniles+and+adults.">Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults.</a> Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).</li><li>Alstermark, B., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuits+for+skilled+reaching+and+grasping.">Circuits for skilled reaching and grasping.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Al&#237;as, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+subcortical+pathways+promote+recovery+of+skilled+hand+function+in+rats+after+corticospinal+and+rubrospinal+tract+injuries.">Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries.</a> Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).</li><li>Tohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+propriospinal+neurons+to+recovery+of+hand+dexterity+after+corticospinal+tract+lesions+in+monkeys.">Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).</li><li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion.">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion.</a> Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+circuits+from+the+sensory+and+motor+cortices+differentially+regulate+skilled+movements+through+distinct+spinal+interneurons.">Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons.</a> Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).</li><li>Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).</li></ol>

يعد التعديل الجيني المستحث لنشاط الدماغ باستخدام المعدلات الكيميائية الوراثية القابلة للحقن أداة قوية في دراسة الآليات المختلفة التي تكمن وراء التعافي من اصابات النخاع الشوكي. تزداد دقة استهداف المستقبلات المقترنة بالبروتين G (DREADDs) عند النظر في أن تتبع التألق يتحقق من الدقة التشريحية ف?...

في حين أن اصابات النخاع الشوكي نادرة الحدوث نسبيا بين الأطفال ، إلا أنها مؤلمة بشكل خاص وتسبب إعاقة دائمة تتطلب بصيرة لوجستية هائلة. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف نسبة أعلى من اصابات النخاع الشوكي للأطفال على أنها عنق الرحم وكاملة مقارنة بالسكان البالغين 1,2. السمة المميزة لأنواع الثدييات هي أن حديثي الولادة يتعافون بشكل ملحوظ من اصابات النخاع الشوكي بشكل أفضل من البالغين ، وهذا يوفر فرصة لتقييم آليات القيادة للتعافي في السكان الأصغر سنا3،4،5. على الرغم من ذلك ، هناك عدد أقل من الدراسات متعددة الوسائط التي تتناول أبحاث القوارض حديثي الولادة والرضع ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبة الإضافية المتمثلة في استهداف مجموعات مختارة من الخلايا العصبية بدقة في المعالم التشريحية الأكثر إحكاما للحيوانات الأصغر سنا6. تركز هذه المقالة على الحقن المباشر للناقلات المرتبطة بالغدي التقدمي والرجعي عالي الكفاءة في الحبل الشوكي للفئران لتعديل المسارات الحركية الرئيسية مع تطبيق Cre-dependent-DREADDs ، مما يوسع نطاق دراسات التجديد متعدد الوسائط.
النواقل الفيروسية هي أدوات بيولوجية مهمة لها مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك إدخال المادة الوراثية لتحل محل الجينات المستهدفة ، وتنظيم بروتينات النمو ، وتتبع المشهد التشريحي للجهاز العصبي المركزي7،8،9. تمت دراسة العديد من التفاصيل التشريحية للمسارات الحركية الشوكية باستخدام المقتفيات الكلاسيكية ، أي أمين ديكستران البيوتينيل. في حين أن المتتبعات التقليدية كانت مفيدة في اكتشاف التشريح العصبي ، إلا أنها لا تخلو من عيوبها: فهي تسمي المسارات بشكل عشوائي حتى لو تم حقنها بشكل صحيح ، وقد وجدت الدراسات أنها تمتصها المحاور التالفة10،11،12. وبالتالي ، قد يؤدي ذلك إلى تفسيرات غير صحيحة في دراسات التجديد حيث يمكن الخلط بين المحاور المقطوعة وتجديد الألياف.
تستخدم الطريقة التالية نظام النواقل الفيروسية الثنائية الذي شاع مؤخرا في دراسات التشكيل ، مع ناقلين فيروسيين مختلفين في منطقتين منفصلتين من نفس الخلية العصبية13,14. الأول هو ناقل يصيب محليا أجسام الخلايا العصبية الإسقاطية. والآخر هو ناقل رجعي يتم نقله من النهايات المحورية للخلايا العصبية البارزة (الشكل 1). يحمل المتجه الرجعي Cre recombinase ، ويشتمل المتجه المحلي على تسلسل "Cre-On" مزدوج الفلوكس الذي يتم فيه تشفير بروتين الفلورسنت (mCherry). يتم عكس جين التحوير الأصلي الذي يعبر عن كل من hM3Dq و mCherry بالنسبة إلى المروج ويحيط به موقعان LoxP (الشكل 2). وبالتالي ، يتم التعبير عن mCherry فقط في الخلايا العصبية الإسقاطية المتحولة بشكل مضاعف حيث يحفز Cre recombinase حدث إعادة التركيب بين مواقع LoxP ، مما يؤدي إلى قلب اتجاه جين التحوير إلى إطار القراءة المناسب والسماح بالتعبير عن كل من DREADD والبروتين الفلوري. بمجرد أن يكون جين التحوير الفيروسي في الاتجاه الصحيح ، وعند الاقتضاء ، يمكن ل DREADDs أن تحفز بشكل عابر التعديل العصبي من خلال ليجند محقون بشكل منفصل ، أي كلوزابين-N-oxide. تم تصميم البروتوكول لمصادقة أبحاث التعديل العصبي المستحث في حديثي الولادة ، حيث يتم حقن DREADD لتعديل CSTs بشكل انتقائي. يعمل النظام ثنائي الفيروسات كبوليصة تأمين ، مما يضمن أن كل خلية إيجابية DREADD يمكن تتبعها تحت مضان بدقة عالية للتحقق من صحة الحقن.
تساعد هذه الطريقة أيضا على سد الفجوة في أبحاث حديثي الولادة. تقدم اصابات النخاع الشوكي للأطفال تحدياتها ، ويجب أن تؤكد الأبحاث التي تحلل التجديد أو الإنبات أو اللدونة على الاختلافات بين حديثي الولادة والبالغين3،15،16،17. من خلال تحسين الإجراء الجراحي وإجراء الدراسات التشريحية السابقة مع تلطيخ نيسل ، تم التحقق من صحة إحداثيات كل من حقن الجمجمة والعمود الفقري. كان الهدف هو توفير طريقة للحقن المزدوجة في الفئران حديثي الولادة مع زيادة الدقة والقدرة على البقاء.
بالنسبة للنموذج الحالي ، تم حقن الناقل المتقدم في أجسام الخلايا في القشرة الحركية الجسدية باستخدام bregma كمرجع18,19. فيما يتعلق بحقن العمود الفقري ، تم حقن الناقل الرجعي في الصفيحة V-VII ، حيث توجد نهايات محور CST20,21. هناك العديد من الأسئلة الأساسية الكامنة وراء كيفية تأثير نماذج معينة من الآفات على الحيوانات الأصغر سنا بشكل مختلف ، وكيف يختلف التعافي اللاحق عن الحيوان الأكبر سنا. توضح هذه الدراسة وسيلة قوية لدراسة إصابات عنق الرحم وإمكانية استعادة وظيفة الأطراف الأمامية في القوارض الوليدية. في المقابل ، تناولت غالبية الدراسات السابقة حركة التعافي بعد الإصابات القطنية أو الصدرية5،22،23،24. من خلال إقران الناقل الفيروسي المزدوج بتقنية الحقن الجديدة الموصوفة هنا ، يساعد هذا البروتوكول في التخفيف من بعض المشكلات (أي البقاء على قيد الحياة) التي قد تصيب تحقيقات القوارض الوليدية. هذه الطريقة قوية وعملية ومتعددة الاستخدامات: ستسمح الاختلافات الطفيفة في التقنية باستهداف مسارات مختلفة ، أي CST البطني ، CST الظهري ، والمسارات الظهرية الصاعدة.
بالنسبة لهذا النظام ، يتم حقن فيروس واحد يعمل محليا (على سبيل المثال ، AAV2) في منطقة أجسام الخلايا العصبية ذات الأهمية. يتم حقن فيروس ثان ينتقل بأثر رجعي ويتحكم في التعبير عن الفيروس المحلي في النهايات المحورية لتلك المجموعة العصبية. وبالتالي ، بحكم التعريف ، يتم تصنيف الخلايا العصبية القشرية الشوكية فقط. تم اختيار فيروس retroAAV-Cre مع محفز CMV نشط بشكل أساسي حيث يتم استخدام بلازميد المكوك لتوليد العديد من الأنماط المصلية AAV للتعبير المعتمد على Cre في عدة أنواع من الخلايا. بالنسبة للحقن القشرية ، تم اختيار AAV2 مع جين التحوير الذي يقوده المروج synapsin-1 للحد من أي تعبير عن الخلايا العصبية. نظرا لأن النظام الفيروسي 2 يعتمد بشكل أكبر على أصل وإنهاء السكان العصبيين ذوي الأهمية ، يمكن استخدام العديد من المروجين المختلفين ، إذا كان بإمكانهم دفع التعبير عن الجينات ذات الأهمية داخل السكان العصبيين محل الاهتمام. على سبيل المثال ، يمكن استبدال المروج العصبي المثير ، CamKII ، ب synapsin-1. بالإضافة إلى استخدام هذه الأنماط المصلية AAV ، يمكن أيضا تحقيق النقل الرجعي إلى غير ناضج ، وبدرجة أقل بكثير ، الخلايا العصبية الحركية القشرية الشوكية البالغة باستخدام فيروس lentivirus القابل للنقل الرجعي العالي (HiRet)25. تستخدم فيروسات HiRet lentivirus بروتين سكري خيمري لداء الكلب / VSV لاستهداف الامتصاص عند المشبك العصبي للنقل الرجعي. جنبا إلى جنب مع مروج Tet-On ، يدعم هذا النظام الفيروسي 2 التعبير المحرض بطريقة تعتمد على الرجعية26,27.
تدخل الفيروسات المرتجعة ناقلات في الفضاء المشبكي للخلية العصبية المستهدفة، مما يسمح بامتصاصها بواسطة محور الخلية ونقلها إلى جسم الخلية. في حين أن النواقل الفيروسية العدسية قد حققت نجاحا هائلا في السابق ، حيث وفرت تعبيرا طويل المدى في دراسات العلاج الجيني ، فقد تمحورت هذه الطريقة نحو النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لعدة أسباب بسيطة26,28: AAV أكثر اقتصادا وفعالية بالمثل ويمثل عبئا لوجستيا أقل ، نظرا لأنه يحتوي على مستوى أمان حيوي أقل 29,30,31,32 . في حين أن AAV2 ، النمط المصلي الأكثر استخداما ، يوضح نقلا قويا لمحاور CST ، قد يلاحظ الباحثون في المستقبل أن AAV1 يوفر بعض التنوع لأنه يصنف بشكل عابر ، وبالتالي يطرح العديد من التكرارات المحتملة في الدراسات المستقبلية33. التكيف النهائي هو تشفير الفيروس الرجعي مع Cre-recombinase بحيث يمكن إدخال العديد من النواقل التقدمية في وقت واحد ، وبالتالي تقليل نفايات الفيروسات الداخلية غير الضرورية وزيادة احتمالية تعبير DREADDs في الاتجاه الصحيح.
في النهاية ، يوضح هذا البروتوكول الحقن المتزامن في القشرة والعمود الفقري العنقي ، مستهدفا على وجه التحديد أجسام الخلايا والأطراف المحورية للقناة القشرية الشوكية ، على التوالي. يظهر النقل عالي الدقة في القشرة الدماغية والحبل الشوكي. في حين أن البروتوكول الموصوف كان مثاليا لفئران Sprague Dawley التي يبلغ عمرها 5 أيام ، إلا أنه مناسب لأيام ما بعد الولادة من 4 إلى 10 مع تعديلات طفيفة على التخدير وإحداثيات التجسيم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

تعد معالجة العقبات التي تقيد البحث على الفئران حديثي الولادة بنجاح أمرا مهما لدراسة الاختلافات في النتائج التي تظهر في إصابات الحبل الشوكي للأطفال (SCIs) مقارنة باصابات النخاع الشوكي للبالغين. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون إدخال العلاجات بشكل موثوق في الخلايا المستهدفة للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا صعبا ، ويمكن أن تؤدي عدم الدقة إلى الإضرار بفعالية الدراسة أو العلاج. يجمع هذا البروتوكول بين تقنية النواقل الفيروسية وتقنية جراحية جديدة لإدخال العلاجات الجينية بدقة في الفئران الوليدية في يوم ما بعد الولادة 5. هنا ، يتم إدخال فيروس مصمم للنقل الرجعي (retroAAV2) من Cre في النهايات المحورية للخلايا العصبية القشرية الشوكية في الحبل الشوكي ، حيث يتم نقله لاحقا إلى أجسام الخلايا. ثم يتم حقن مستقبل مصمم ذو اتجاه مقلوب مزدوج (DIO) يتم تنشيطه حصريا بواسطة فيروس (أدوية) مصمم (DREADD) في القشرة الحركية الجسدية للدماغ. تعزز تقنية العدوى المزدوجة هذه التعبير عن DREADDs فقط في الخلايا العصبية القشرية الشوكية المصابة (CST). وبالتالي ، فإن الحقن المشترك المتزامن للقشرة الحركية الجسدية ومحطات CST العنقية هو طريقة صالحة لدراسة التعديل الكيميائي الجيني للتعافي بعد نماذج اصابات النخاع الشوكي العنقي في الفئران الوليدية.

يجب أن يؤدي الحقن والنقل الناجح للناقل الفيروسي إلى نقل الخلايا العصبية أحادية الجانب في الحبل الشوكي والقشرة الحركية. يوضح الشكل 4 وضع العلامات على الخلايا العصبية من الطبقة V CST في القشرة الحركية لقسم إكليلي في الدماغ يعبر عن حقن Cre-dependentent-DREADDs-mCherry بالاشتراك مع حقن العمود ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

يوضح هذا البروتوكول طريقة جديدة لتطبيق العلاجات الجينية على مجموعات فرعية من الخلايا في الفئران حديثي الولادة في سن ما بعد الولادة من 5 إلى 10 أيام عن طريق حقن معدل كيميائي وراثي تقدمي في القشرة الحركية الجسدية و Cre recombinase قابل للنقل إلى الوراء في الحبل الشوكي العنقي.

استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران الوليدية باستخدام ناقل فيروسي مزدوج باستخدام جراحة الدماغ والعمود الفقري المشتركة

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

هذا هو البروتوكول الأول الذي يوضح العدوى المشتركة الناجحة للجهاز القشري الشوكي في الفئران الوليدية. يوفر مخططا دقيقا للتحقيق في كيفية مساهمة المجموعات الفرعية الفردية للخلايا في الثدييات الشابة في التعافي من إصابة الحبل الشوكي. مثل تقنيات النواقل الفيروسية المزدوجة الأخرى ، تسمح هذه الطريقة للمستخدم بتحويل مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية بدقة ، مما يسمح للباحثين بتحديد فعالية التقنيات الكيميائية الوراثية المختلفة في تعزيز التعافي.نتوقع من الباحثين الذين ليسوا على دراية بهذه التقنية أن يكافحوا من أجل تحديد موقع تشريح العمود الفقري المناسب. ولذا فإننا نشجعك على عد الأجزاء الفقرية باستمرار في كثير من الأحيان والرجوع دائما إلى معالمك. بعد التأكد من عمق التخدير في جرو Sprague Dawley الوليدي ، حدد المنطقة التي سيتم إجراء الشق فيها عن طريق الضغط على الملقط في خط الوسط أعلى فروة الرأس ، والشعور بالخيط السهمي.إمساك الجلد مشدودا لضمان شق نظيف ومستقيم ودقيق ، قم بعمل شق بطول سنتيمتر واحد على طول مستوى الخياطة السهمي بدءا من الخط الأول مباشرة. بعد ذلك ، حدد bregma عن طريق فحص الملقط بلطف على طول سطح الجمجمة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لخطوط الخياطة والمسافة البادئة التي يسببها الملقط الذي يمتد على طول العظام الجدارية والجبهية. الحفاظ على الفتحة عن طريق تطبيق السنانير المرجحة على جانب الاهتمام.قم بإزالة التهاب الأعصاب باستخدام مزيج من الأطراف القطنية والمقص الدقيق لزيادة التعرض للبريجما لزيادة الدقة. تأكد من أن الدرز الإكليلي في رؤية واضحة بما يكفي لتوفير قالب تقريبي للحقن اللاحقة. باستخدام المقص الصغير ، قم بقطع جزء من ثلاثة في اثنين ملليمتر تقريبا من عظم الجمجمة الجبهي الأيسر المجاور مباشرة للبريغما.قم بإزالة أي حطام أو سائل دماغي ودم بأطراف قطنية. لحقن الفيروس ، ضع الإبرة في مكانها وقم ببرمجة الحاقن لحقن ميكرولتر واحد بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. عند الانتهاء من الحقن ، اترك الإبرة تستقر في القشرة لمدة ثلاث دقائق.كرر الحقن في الإحداثيات الأخرى لما مجموعه ثلاث حقن على طول القشرة فيما يتعلق بالبريغما ، وكلها على عمق 0.6 ملم. بعد الانتهاء من الحقن ، خياطة فروة الرأس ونقل الحيوان إلى طاولة العمليات الأخرى لاستئصال الصفيحة الفقرية عنق الرحم. جس قاعدة الجمجمة باستخدام الأصابع لتحديد موقع الشق.امسك الجلد مشدودا عن طريق وضع التوتر بالإبهام والسبابة. باستخدام شفرة رقم 11 ، ابدأ الشق عند خط الوسط من واحد إلى ملليمترين خلف قاعدة الجمجمة وقم بتمديد الشق الخلفي بمقدار سنتيمتر واحد لكشف العضلة السطحية. باستخدام النقطة الحادة للشفرة ، قم بإجراء سلسلة من الجروح برفق على طول خط الوسط للعضلة السطحية لكشف تجويف العمود الفقري وعضلات العمود الفقري العميقة.ثم استخدم زوجا من الملقط لنشر العضلات المفتوحة وتصور النافذة الجراحية. بمجرد انكشاف عضلات العمود الفقري العميقة ، أدخل المبعدات في النافذة الجراحية واسحب النافذة الجراحية إلى سبعة إلى ثمانية ملليمترات في العرض ، مما يسمح برؤية العمود الفقري دون عائق. حدد الفقرة العنقية الثانية من خلال عمليتها الشائكة البارزة التي تبرز ظهريا وتغلف عضلة كبيرة على شكل قبة.باستخدام الحافة المسطحة لمكشطة العظام ، اكشط برفق عضلة العمود الفقري العميقة على الجانبين لتعريض الفقرات C3 إلى C7. ابدأ الإنسي وكشط أفقيا على طول الاتجاه الموازي للصفائح الفقرية لضمان التعرض المناسب ، مما يسمح بتمييز واضح للصفائح الفقرية. السيطرة على أي نزيف مع أطراف القطن.باستخدام C2 كدليل عند حساب مستويات العمود الفقري ، قم بقص الحواف الجانبية للصفائح الغضروفية بعناية عند C6 و C7 باستخدام مقص صغير. باستخدام زوج من الملقط الناعم ، قم بإزالة الجزء المقطوع بعناية من الصفيحة لكشف الحبل الشوكي ، وتأكد من أن نافذة العمود الفقري كبيرة بما يكفي لاستيعاب موقع الحقن المطلوب. ضع الحيوان في حامل الجمجمة المجسم وضع قطعة من الشاش ملفوفة تحت جذع الحيوان لرفع أرباعه الخلفية.قبل البدء في الحقن ، قم بتنظيف نافذة العمود الفقري من أي دم أو سائل دماغي نخاعي عن طريق وضع أطراف قطنية ومثلثات سوجي برفق على المنطقة ، مع الحرص على عدم إهانة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك ، قم بإنشاء حاجز حول محيط النافذة عن طريق وضع قطعة صغيرة من القطن القابل للامتصاص في الأجزاء الجانبية من نافذة العمود الفقري لمنع انسداد موقع الحقن عن طريق النزيف المستمر أو تسرب السائل الدماغي النخاعي. للحقن المباشر في الحبل الشوكي، استخدم طرف إبرة حقن الزجاج لتقريب خط الوسط للحبل الشوكي عن طريق تحديد الشريان الشوكي.بعد ذلك ، ضع الإبرة خلف الصفيحة C5 مباشرة عند خط الوسط التقريبي واستخدمها كنقطة مرجعية. ثم ، باستخدام المناور الدقيق ، حرك الإبرة أفقيا إلى اليمين بمقدار 0.3 ملم وخفض الإبرة حتى تلامس سطح الحبل الشوكي. من هذا العمق ، يغرق الإبرة.0.6 ملليمتر في الحبل الشوكي. حقن ميكرولتر واحد من الفيروس المرتبط بالغدي الرجعي الذي يحمل جين Cre recombinase بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. ثم انتظر لمدة دقيقتين حتى ينتشر الفيروس في الحبل الشوكي قبل سحب الإبرة ببطء.يظهر هنا وضع العلامات على الخلايا العصبية القشرية الشوكية من الطبقة الخامسة في القشرة الحركية لقسم إكليلي في الدماغ يعبر عن DREADDs المعتمدة على Cre mCherry المحقونة بالاشتراك مع حقن العمود الفقري المقابل ل Cre الرجعي. ستساعد القدرة على استهداف مجموعات عصبية معينة على تحديد الفروق الدقيقة التي تقود الانتعاش وتوفير المزيد من الدقة لعلاج إصابة الحبل الشوكي الأساسية في الجهاز العصبي النامي. مهدت هذه الطريقة الطريق لنا للتحقيق في جدوى استخدام DREADDs المثيرة كوسيلة لعلاج إصابة الحبل الشوكي في الفئران اليافعة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

التجسيمي جراحة الآفات Excitotoxic من مناطق محددة في الدماغ في الجرذ الكبار

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

من جانب واحد قطع السبيل الهرمي للالقشري المسالك في الجرذان لتقييم العلاج الذي يحفز المرونة العصبية

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselective Biolistic استهداف عضوي في الدماغ شرائح باستخدام بندقية الجينات المعدلة

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

تسجيل إيغ في التحرك بحرية الفئران حديثي الولادة باستخدام طريقة رواية

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

التصوير الانتشار المتقدم في الحصين من الفئران مع إصابات الدماغ صدمة خفيفة

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

تحديد الوضع الوظيفي للمسار القشري الشوكي في غضون أسبوع واحد من السكتة الدماغية

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر في القشرة الحركية للفئران

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...