Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Shriners Hospitals for Children SHC-84706 finanziert.

Alle folgenden chirurgischen und tierpflegerischen Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Temple University genehmigt. Das beschriebene Protokoll ist eine Überlebensoperation, und die Tiere wurden schließlich durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Natriumpentobarbital nach Ablauf ihrer Zeitpunkte eingeschläfert.
1. Präoperative Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie mindestens zwei gezogene Glasnadeln für die Virusinjektion mit 3,5 nL Glaskapillarpipetten vor. eine Na...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. 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Die induzierbare genetische Modulation der Gehirnaktivität mit injizierbaren chemogenetischen Modifikatoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der verschiedenen Mechanismen, die der Genesung von Rückenmarksverletzungen zugrunde liegen. Die Genauigkeit des Targetings für die induzierbaren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (DREADDs) wird weiter erhöht, wenn man bedenkt, dass die Fluoreszenzverfolgung die anatomische Präzision in der Histologie validiert. Dieser Artikel diskutiert eine zuverlässige...

Während Rückenmarksverletzung in der pädiatrischen Bevölkerung relativ selten vorkommt, ist sie besonders traumatisch und verursacht eine dauerhafte Behinderung, die eine immense logistische Voraussicht erfordert. Darüber hinaus wird ein höherer Anteil pädiatrischer Rückenmarksverletzungen als zervikal und vollständig eingestuft als in der erwachsenen Bevölkerung 1,2. Ein Kennzeichen aller Säugetierarten ist, dass sich Neugeborene deutlich besser von einer Rückenmarksverletzung erholen als erwachsene Tiere, und dies bietet die Möglichkeit, die treibenden Mechanismen für die Erholung in jüngeren Populationen zu bewerten 3,4,5. Trotzdem gibt es weniger multimodale Studien, die sich mit der Erforschung von Neugeborenen und Säuglingsnagetieren befassen, was zum Teil auf die zusätzliche Schwierigkeit zurückzuführen ist, ausgewählte Populationen von Neuronen in den viel engeren anatomischen Orientierungspunkten jüngerer Tiere genau anzuvisieren6. Dieser Artikel konzentriert sich auf die direkte Injektion von hocheffizienten anterograden und retrograden Adeno-assoziierten Vektoren in das Rückenmark der Ratte, um wichtige motorische Bahnen mit der Anwendung von Cre-abhängigen DREADDs zu modulieren, wodurch die Reichweite multimodaler Regenerationsstudien erweitert wird.
Virale Vektoren sind wichtige biologische Werkzeuge mit einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Einführung von genetischem Material, um Zielgene zu ersetzen, Wachstumsproteine hochzuregulieren und die anatomische Landschaft des ZNS 7,8,9 zu verfolgen. Viele der anatomischen Details der motorischen Bahnen der Wirbelsäule wurden mit klassischen Tracer, d.h. biotinyliertem Dextranamin, untersucht. Während traditionelle Tracer maßgeblich zur Aufdeckung der Neuroanatomie beigetragen haben, sind sie nicht ohne Nachteile: Sie markieren wahllos Signalwege, selbst wenn sie korrekt injiziert werden, und Studien haben gezeigt, dass sie von beschädigten Axonen aufgenommen werden10,11,12. Folglich könnte dies zu falschen Interpretationen in Regenerationsstudien führen, bei denen abgetrennte Axone mit regenerierenden Fasern verwechselt werden könnten.
Die folgende Methode nutzt das Zwei-Virus-Vektorsystem, das kürzlich in Modulationsstudien populär gemacht wurde, mit zwei verschiedenen viralen Vektoren in zwei getrennten Bereichen desselben Neurons13,14. Der erste ist ein Vektor, der die Zellkörper von Projektionsneuronen lokal infiziert. Der andere ist ein retrograder Vektor, der von den Axonendigungen der Projektionsneuronen transportiert wird (Abbildung 1). Der retrograde Vektor trägt Cre-Rekombinase, und der lokale Vektor enthält die "Cre-On"-Doppel-Flox-Sequenz, in der ein fluoreszierendes Protein (mCherry) kodiert ist. Das native Transgen, das sowohl hM3Dq als auch mCherry exprimiert, ist relativ zum Promotor invertiert und wird von zwei LoxP-Stellen flankiert (Abbildung 2). Daher wird mCherry nur in den doppelt transduzierten Projektionsneuronen exprimiert, bei denen die Cre-Rekombinase ein Rekombinationsereignis zwischen den LoxP-Stellen induziert, die Orientierung des Transgens in den entsprechenden Leserahmen umdreht und die Expression sowohl des DREADD als auch des fluoreszierenden Proteins ermöglicht. Sobald sich das virale Transgen in der richtigen Ausrichtung befindet, können die DREADDs vorübergehend eine Neuromodulation durch einen separat injizierten Liganden, d.h. Clozapin-N-Oxid, induzieren. Das Protokoll wurde entwickelt, um induzierbare Neuromodulationsforschung bei Neugeborenen zu authentifizieren, wobei DREADDS injiziert werden, um die CSTs selektiv zu modulieren. Das Zwei-Virus-System fungiert als Versicherungspolice und stellt sicher, dass jede DREADD-positive Zelle unter Fluoreszenz mit hoher Genauigkeit zurückverfolgt werden kann, um die Injektionen zu validieren.
Diese Methode hilft auch, die Lücke in der Neugeborenenforschung zu schließen. Pädiatrische Rückenmarksverletzung stellt ihre Herausforderungen dar, und Forschung, die Regeneration, Keimung oder Plastizität analysiert, sollte die Unterschiede zwischen Neugeborenen und Erwachsenen betonen 3,15,16,17. Durch die Optimierung des chirurgischen Eingriffs und die Durchführung früherer anatomischer Studien mit Nissl-Färbung wurden die Koordinaten sowohl für die kranialen als auch für die spinalen Injektionen validiert. Ziel war es, eine Methode zur doppelten Injektion in eine neugeborene Ratte mit erhöhter Genauigkeit und Überlebensfähigkeit bereitzustellen.
Für das aktuelle Modell wurde der anterograde Vektor in die Zellkörper des somatomotorischen Kortex injiziert, wobei Bregma als Referenz18,19 verwendet wurde. In Bezug auf die Wirbelsäuleninjektionen wurde der retrograde Vektor in Laminae V-VII injiziert, wo sich die CST-Axonendigungenbefinden 20,21. Es gibt viele grundlegende Fragen, die zugrunde liegen, wie bestimmte Läsionsmodelle jüngere Tiere unterschiedlich beeinflussen und wie die anschließende Erholung von einem älteren Tier abweicht. Diese Studie zeigt ein robustes Mittel zur Untersuchung von Gebärmutterhalsverletzungen und der Wiederherstellbarkeit der Funktion der Vordergliedmaßen bei neonatalen Nagetieren. Im Gegensatz dazu befasste sich die Mehrzahl der bisherigen Studien mit der Fortbewegung der Erholung nach Lenden- oder Thoraxverletzungen 5,22,23,24. Durch die Paarung des doppelviralen Vektors mit der hier beschriebenen neuartigen Injektionstechnik trägt dieses Protokoll dazu bei, bestimmte Probleme (z. B. die Überlebensfähigkeit) zu mildern, die die Untersuchung von Nagetieren bei Neugeborenen beeinträchtigen können. Diese Methode ist robust, praktisch und vielseitig: Leichte Variationen in der Technik ermöglichen es, verschiedene Bahnen anzuvisieren, d.h. ventrale CST, dorsale CST und die aufsteigenden dorsalen Pfade.
Für dieses System wird ein lokal wirkendes Virus (z.B. AAV2) in die Region der interessierenden neuronalen Zellkörper injiziert. Ein zweites retrograd transportiertes Virus, das die Expression des lokalen Virus steuert, wird an den Axon-Terminals für diese neuronale Population injiziert. Daher werden definitionsgemäß nur kortikospinale Neuronen markiert. Das retroAAV-Cre-Virus wurde mit einem konstitutiv aktiven CMV-Promotor ausgewählt, da das Shuttle-Plasmid verwendet wird, um mehrere AAV-Serotypen für die Cre-abhängige Expression in verschiedenen Zelltypen zu erzeugen. Für kortikale Injektionen wurde AAV2 mit dem Transgen gewählt, das vom Synapsin-1-Promotor angetrieben wird, um die Expression auf Neuronen zu beschränken. Da das 2-virale System mehr auf den Ursprung und die Beendigung der interessierenden neuronalen Population angewiesen ist, könnten mehrere verschiedene Promotoren verwendet werden, wenn sie die Expression der interessierenden Gene innerhalb der interessierenden neuronalen Population steuern können. Zum Beispiel könnte der exzitatorische neuronale Promotor CamKII das Synapsin-1 ersetzen. Neben der Verwendung dieser AAV-Serotypen kann auch ein retrograder Transport in unreife und in viel geringerem Maße adulte kortikospinale Motoneuronen mit dem hochretrograden transportablen Lentivirus (HiRet)25 erreicht werden. HiRet-Lentiviren verwenden ein chimäres Tollwut/VSV-Glykoprotein, um die Aufnahme an der Synapse für den retrograden Transport zu steuern. In Kombination mit einem Tet-On-Promotor unterstützt dieses 2-virale System die induzierbare Expression in retrograder Abhängigkeit26,27.
Retrograde Viren schleusen Vektoren in den synaptischen Raum eines Zielneurons ein, so dass es vom Axon dieser Zelle aufgenommen und in den Zellkörper transportiert werden kann. Während lentivirale Vektoren in der Vergangenheit enormen Erfolg hatten und eine langfristige Expression in Gentherapiestudien ermöglichten, konzentrierte sich diese Methode aus einigen einfachen Gründen auf Adeno-assoziierte virale Vektoren26,28: AAV ist wirtschaftlicher, ähnlich effektiv und stellt einen geringeren logistischen Aufwand dar, da es eine niedrigere Biosicherheitsstufe aufweist 29,30,31,32 . Während AAV2, der am häufigsten verwendete Serotyp, eine robuste Transfektion von CST-Axonen zeigt, könnten zukünftige Forscher feststellen, dass AAV1 eine gewisse Vielseitigkeit bietet, da es transynaptisch markiert und somit mehrere mögliche Iterationen in zukünftigen Studien hervorbringt33. Die letzte Anpassung besteht darin, das retrograde Virus mit Cre-Rekombinase zu kodieren, so dass mehrere anterograde Vektoren gleichzeitig eingeführt werden können, wodurch unnötiger interner Virusabfall reduziert und die Wahrscheinlichkeit maximiert wird, dass die DREADDs in der richtigen Ausrichtung exprimieren.
Letztendlich zeigt dieses Protokoll die gleichzeitige Injektion in den Kortex und die Halswirbelsäule, die spezifisch auf die Zellkörper bzw. die Axonendigungen des Kortikospinaltraktes abzielt. High-Fidelity-Transfektion wird in der Großhirnrinde und im Rückenmark beobachtet. Während das beschriebene Protokoll für Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 5 Tagen perfektioniert wurde, ist es für die postnatalen Tage 4-10 mit geringfügigen Anpassungen der Anästhesie und der stereotaktischen Koordinaten geeignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

Die erfolgreiche Überwindung der Hindernisse, die die Forschung an neonatalen Ratten behindern, ist wichtig, um die Unterschiede in den Ergebnissen bei pädiatrischen Rückenmarksverletzungen (SCIs) im Vergleich zu erwachsenen SCIs zu untersuchen. Darüber hinaus kann die zuverlässige Einführung von Therapien in die Zielzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) eine Herausforderung darstellen, und Ungenauigkeiten können die Wirksamkeit der Studie oder Therapie beeinträchtigen. Dieses Protokoll kombiniert die virale Vektortechnologie mit einer neuartigen chirurgischen Technik, um Gentherapien bei neonatalen Ratten am postnatalen Tag 5 präzise einzuführen. Hier wird ein Virus, das für den retrograden Transport (retroAAV2) von Cre entwickelt wurde, an den Axonendigungen kortikospinaler Neuronen im Rückenmark eingeschleust, wo es anschließend zu den Zellkörpern transportiert wird. Ein doppelt gefloxter Designer-Rezeptor mit umgekehrter Orientierung (DIO), der ausschließlich durch das Designer-Drug-Virus (DREADD) aktiviert wird, wird dann in den somatomotorischen Kortex des Gehirns injiziert. Diese Doppelinfektionstechnik fördert die Expression der DREADDs nur in den koinfizierten Neuronen des kortikospinalen Trakts (CST). Daher ist die gleichzeitige Co-Injektion des somatomotorischen Kortex und der zervikalen CST-Terminals eine gültige Methode zur Untersuchung der chemogenetischen Modulation der Genesung nach zervikalen SCI-Modellen bei neonatalen Ratten.

Eine erfolgreiche Injektion und ein erfolgreicher Transport des viralen Vektors sollten zur Transduktion von einseitigen Neuronen im Rückenmark und im motorischen Kortex führen. Abbildung 4 zeigt die Markierung von CST-Neuronen der Schicht V im motorischen Kortex eines koronalen Hirnschnitts, der Cre-abhängige-DREADDs-mCherry exprimiert, die zusammen mit einer kontralateralen Wirbelsäuleninjektion von rCre injiziert wurden. Die Schnitte wurden mit dsRed-Antikörpern gefärbt.
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Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Anwendung von Gentherapien auf Subpopulationen von Zellen bei neonatalen Ratten im postnatalen Alter von 5-10 Tagen durch Injektion eines anterograden chemogenetischen Modifikators in den somatomotorischen Kortex und einer retrograden transportablen Cre-Rekombinase in das zervikale Rückenmark.

Targeting des kortikospinalen Trakts bei neonatalen Ratten mit einem doppelviralen Vektor mittels kombinierter Gehirn- und Wirbelsäulenchirurgie

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Dies ist das erste Protokoll, das die erfolgreiche Koinfektion des kortikospinalen Trakts bei neugeborenen Ratten zeigt. Es liefert eine genaue Blaupause, um zu untersuchen, wie einzelne Subpopulationen von Zellen in jungen Säugetieren zur Genesung von Rückenmarksverletzungen beitragen. Wie andere doppelte virale Vektortechniken ermöglicht diese Methode dem Benutzer, spezifische Subpopulationen von Neuronen genau zu transduzieren, so dass die Forscher die Wirksamkeit verschiedener chemogenetischer Techniken bei der Förderung der Genesung identifizieren können.Wir würden erwarten, dass Forscher, die mit dieser Technik nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, die richtige Wirbelsäulenanatomie zu finden. Und so ermutigen wir Sie, die Wirbelsegmente kontinuierlich oft zu zählen und immer auf Ihre Orientierungspunkte zurückzugreifen. Nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie bei einem neugeborenen Sprague Dawley-Welpen bestätigt haben, identifizieren Sie den Bereich, in dem der Schnitt gemacht wird, indem Sie die Pinzette in der Mittellinie auf die Oberseite der Kopfhaut drücken und nach der sagittalen Naht tasten.Halten Sie die Haut straff, um einen sauberen, geraden und präzisen Schnitt zu gewährleisten, und machen Sie einen Schnitt von einem Zentimeter entlang der sagittalen Nahtebene, der unmittelbar über der I-Linie beginnt. Als nächstes identifizieren Sie das Bregma, indem Sie die Pinzette vorsichtig entlang der Schädeloberfläche abtasten, wobei Sie genau auf die Nahtlinien und eine Vertiefung achten, die durch die Zange verursacht wird, die entlang der Parietal- und Stirnbeinknochen verläuft. Halten Sie die Öffnung aufrecht, indem Sie gewichtete Haken auf der interessierenden Seite anbringen.Beseitigen Sie die Aponeurose mit einer Kombination aus Baumwollspitzen und Mikroschere, um die Exposition des Bregmas für eine erhöhte Genauigkeit zu maximieren. Stellen Sie sicher, dass die koronale Naht seitlich weit genug sichtbar ist, um eine grobe Schablone für nachfolgende Injektionen zu bieten. Schneiden Sie mit der Mikroschere einen etwa drei mal zwei Millimeter großen Abschnitt des linken vorderen Schädelknochens unmittelbar neben dem Bregma aus.Entfernen Sie alle Ablagerungen, Zerebrospinalflüssigkeit und Blut mit Baumwollspitzen. Um das Virus zu injizieren, setzen Sie die Nadel ein und programmieren Sie den Injektor so, dass er einen Mikroliter mit einer Geschwindigkeit von 250 Nanolitern pro Minute injiziert. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Injektion drei Minuten lang im Kortex ruhen.Wiederholen Sie die Injektionen an den anderen Koordinaten für insgesamt drei Injektionen entlang des Kortex in Bezug auf die Bregma, alle in einer Tiefe von 0,6 Millimetern. Nach Abschluss der Injektionen vernähen Sie die Kopfhaut und bringen Sie das Tier zur zervikalen Laminektomie auf den anderen Operationstisch. Palpieren Sie die Schädelbasis mit den Fingern, um die Inzisionsstelle zu identifizieren.Halten Sie die Haut straff, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger Spannung ausüben. Beginnen Sie mit einer Klinge mit der Nummer 11 den Schnitt an der Mittellinie ein bis zwei Millimeter hinter der Schädelbasis und verlängern Sie den Schnitt um einen Zentimeter nach hinten, um den oberflächlichen Muskel freizulegen. Machen Sie mit der scharfen Spitze der Klinge vorsichtig eine Reihe von Schnitten entlang der Mittellinie des oberflächlichen Muskels, um die Wirbelsäulenhöhle und die tiefe Wirbelsäulenmuskulatur freizulegen.Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Muskel zu spreizen und das Operationsfenster zu visualisieren. Sobald die tiefe Wirbelsäulenmuskulatur freigelegt wurde, führen Sie Retraktoren in das Operationsfenster ein und ziehen Sie das Operationsfenster auf sieben bis acht Millimeter Breite zurück, um eine ungehinderte Sicht auf die Wirbelsäule zu ermöglichen. Identifizieren Sie den zweiten Halswirbel an seinem prominenten Dornfortsatz, der dorsal hervorragt und einen großen kuppelförmigen Muskel umschließt.Kratzen Sie mit der flachen Kante eines Knochenschabers den tiefen Wirbelsäulenmuskel vorsichtig zu den Seiten ab, um die C3- bis C7-Wirbel freizulegen. Beginnen Sie medial und kratzen Sie seitlich entlang der Richtung parallel zu den Wirbellaminae, um eine ordnungsgemäße Exposition zu gewährleisten, die eine klare Unterscheidung der Wirbellaminae ermöglicht. Kontrollieren Sie Blutungen mit Baumwollspitzen.Schneiden Sie die Seitenränder der Knorpellaminae bei C6 und C7 vorsichtig mit einer Mikroschere ab, indem Sie C2 als Richtschnur bei der Zählung der Wirbelebenen verwenden. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig den präparierten Teil der Lamina, um das Rückenmark freizulegen, und stellen Sie sicher, dass das Wirbelsäulenfenster groß genug ist, um die gewünschte Injektionsstelle aufzunehmen. Setzen Sie das Tier in den stereotaktischen Schädelhalter und legen Sie ein zusammengerolltes Stück Gaze unter den Rüssel des Tieres, um seine Hinterhand anzuheben.Bevor Sie mit der Injektion beginnen, reinigen Sie das Wirbelsäulenfenster von Blut oder Liquor cerebrospinalis, indem Sie vorsichtig Baumwollspitzen und Sugi-Dreiecke auf den Bereich auftragen und darauf achten, das Rückenmark nicht zu beleidigen. Schaffen Sie außerdem eine Barriere um den Umfang des Fensters, indem Sie ein kleines Stück resorbierbare Baumwolle in die seitlichen Teile des Wirbelsäulenfensters legen, um einen Verschluss der Injektionsstelle durch kontinuierliche Blutungen oder Liquorleckagen zu verhindern. Für direkte Injektionen in das Rückenmark verwenden Sie die Spitze der Glasinjektionsnadel, um sich der Mittellinie des Rückenmarks anzunähern, indem Sie die Spinalarterie identifizieren.Als nächstes platzieren Sie die Nadel direkt hinter der C5-Lamina an der ungefähren Mittellinie und verwenden Sie diese als Referenzpunkt. Bewegen Sie dann mit dem Mikromanipulator die Nadel seitlich um 0,3 Millimeter nach rechts und senken Sie die Nadel ab, bis sie nur noch die Oberfläche des Rückenmarks berührt. Tauchen Sie die Nadel aus dieser Tiefe ein.0,6 Millimeter in das Rückenmark. Injizieren Sie einen Mikroliter des retro-adeno-assoziierten Virus, von denen zwei das Cre-Rekombinase-Gen mit 250 Nanolitern pro Minute tragen. Warten Sie dann zwei Minuten, bis das Virus in das Rückenmark diffundiert ist, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen.Die Markierung von Neuronen der fünften Schicht des kortikospinalen Trakts im motorischen Kortex eines koronalen Hirnschnitts, die Cre-abhängige DREADDs mCherry exprimieren, die mit einer kontralateralen Wirbelsäuleninjektion von Retro-Cre koinjiziert wurden, ist hier dargestellt. Die Möglichkeit, bestimmte neuronale Populationen anzusprechen, wird dazu beitragen, die Nuancen zu beschreiben, die die Genesung vorantreiben, und eine genauere Behandlung der zugrunde liegenden Rückenmarksverletzung im sich entwickelnden Nervensystem ermöglichen. Diese Methode ebnete uns den Weg, die Machbarkeit der Verwendung von exzitatorischen DREADDs als Mittel zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen bei juvenilen Ratten zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

Einseitige Pyramidotomy der Pyramidenbahn in Ratten für Bewertung der Neuroplastizität treibenden Therapien

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Aufzeichnung von EEG in frei bewegten neonatalen Ratten mit einer neuartigen Methode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Advanced Diffusion Imaging im Hippocampus von Ratten mit leichter traumatischer Hirnverletzung

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

Bestimmung des Funktionellen Status des Corticospinal Tract innerhalb einer Woche nach dem Schlaganfall

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

Laserinduzierte Hirnverletzung im Motor Cortex von Ratten

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...