Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענק מלגה מבתי החולים לילדים של Shriners SHC-84706.

כל ההליכים הכירורגיים והטיפול בבעלי חיים הבאים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טמפל. הפרוטוקול המתואר הוא ניתוח הישרדותי, ובעלי החיים הומתו בסופו של דבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של 100 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל בסיום נקודות הזמן שלהם.
1. הכנה טרום ניתוחית</p...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+plasticity+and+sparing+of+function+after+spinal+cord+damage+in+neonatal+cats.">Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats.</a> Science. 217 (4559), 553-555 (1982).</li><li>Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+corticospinal+projections+after+large+lesions+of+the+cerebral+hemisphere+in+neonatal+rats.">Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats.</a> Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).</li><li>Commissiong, J. W., Toffano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+transection+at+different+postnatal+ages:+Recovery+of+motor+coordination+correlated+with+spinal+cord+catecholamines.">Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines.</a> Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).</li><li>Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+neuropathology+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+developing+and+adult+rats.">Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualizing+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>Pawliuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+sickle+cell+disease+in+transgenic+mouse+models+by+gene+therapy.">Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy.</a> Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).</li><li>Atasoy, D., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+tools+for+causal+cellular+and+neuronal+biology.">Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).</li><li>Brandt, H. M., Apkarian, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-dextran:+A+sensitive+anterograde+tracer+for+neuroanatomic+studies+in+rat+and+monkey.">Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey.</a> Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Reiner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).</li><li>Oguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+virus+vector+infection+to+the+prefrontal+network+of+the+macaque+brain.">Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain.</a> PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).</li><li>Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+corticospinal+tract+following+midthoracic+spinal+injury+in+the+postnatal+rat.">Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).</li><li>Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+young+rats.">Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).</li><li>Tillakaratne, N. J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+of+stepping+in+rats+after+a+complete+neonatal+spinal+cord+transection+is+not+due+to+regrowth+across+the+lesion+site.">Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site.</a> Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).</li><li>Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+analysis+of+motor+cortical+plasticity+after+cortical+lesions+in+newborn+rats.">Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats.</a> Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).</li><li>Gennaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stroke+in+the+developing+rat+motor+cortex+induces+age-+and+experience-dependent+maladaptive+plasticity+of+corticospinal+system.">Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).</li><li>Brichta, A. M., Grant, G., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitectural+organization+of+the+spinal+cord.">Cytoarchitectural organization of the spinal cord.</a> The rat nervous system. 2, 294-309 (1985).</li><li>Kjell, J., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+models+of+spinal+cord+injury:+From+pathology+to+potential+therapies.">Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).</li><li>Takeoka, A., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+local+proprioceptive+feedback+circuits+initiate+and+maintain+locomotor+recovery+after+spinal+cord+injury.">Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury.</a> Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).</li><li>Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+propriospinal+interneurons+in+recovery+from+spinal+cord+injury.">The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).</li><li>Ohne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+in+rats+with+cervical+spinal+cord+hemisection-neuroanatomical+validation.">Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation.</a> IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills.">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li><li>Sheikh, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrogradely+transportable+lentivirus+tracers+for+mapping+spinal+cord+locomotor+circuits.">Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487, 235-238 (2012).</li><li>Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+injection+of+a+lentiviral+vector+highlights+multiple+motor+pathways+in+the+rat+spinal+cord.">Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).</li><li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. J., Moon, L. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+A+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).</li><li>Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+as+a+tracer+for+labeling+axons:+Implications+for+axon+regeneration.">Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration.</a> Plos One. 9 (2), 87447 (2014).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Abdellatif, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+spinal+cord:+Comparison+between+lentiviral,+adenoviral,+and+retroviral+vector+delivery+systems.">delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).</li><li>Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+and+application+of+anterograde+transsynaptic+AAV+for+probing+neural+circuitry.">Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+after+cervical+spinal+cord+hemisection+in+rats:+A+comparison+of+juveniles+and+adults.">Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults.</a> Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).</li><li>Alstermark, B., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuits+for+skilled+reaching+and+grasping.">Circuits for skilled reaching and grasping.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Al&#237;as, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+subcortical+pathways+promote+recovery+of+skilled+hand+function+in+rats+after+corticospinal+and+rubrospinal+tract+injuries.">Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries.</a> Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).</li><li>Tohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+propriospinal+neurons+to+recovery+of+hand+dexterity+after+corticospinal+tract+lesions+in+monkeys.">Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).</li><li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion.">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion.</a> Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+circuits+from+the+sensory+and+motor+cortices+differentially+regulate+skilled+movements+through+distinct+spinal+interneurons.">Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons.</a> Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).</li><li>Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).</li></ol>

מודולציה גנטית בלתי ניתנת להשראה של פעילות המוח באמצעות משנים כימוגנטיים הניתנים להזרקה היא כלי רב עוצמה בחקר המנגנונים השונים העומדים בבסיס ההתאוששות מ- SCI. הדיוק של המיקוד עבור קולטנים מצומדים לחלבון G (DREADDs) מוגבר עוד יותר כאשר לוקחים בחשבון שמעקב פלואורסצנטי מאמת את הדיוק האנטומי בהיס?...

אמנם מד"ב הוא תופעה נדירה יחסית באוכלוסיית הילדים, אך הוא טראומטי במיוחד וגורם לנכות קבועה הדורשת ראיית הנולד לוגיסטית עצומה. יתר על כן, שיעור גבוה יותר של SCIs ילדים מסווג צוואר הרחם ושלם בהשוואה לאוכלוסייה הבוגרת 1,2. סימן היכר של מיני יונקים הוא שיילודים מחלימים טוב יותר ממד"ב מאשר מבוגרים, וזה מציע הזדמנות להעריך את מנגנוני ההתאוששות באוכלוסיות צעירותיותר 3,4,5. למרות זאת, ישנם פחות מחקרים רב-מודאליים המתמודדים עם מחקר מכרסמים של ילודים ותינוקות, בין היתר בשל הקושי הנוסף למקד במדויק אוכלוסיות נבחרות של נוירונים בציוני הדרך האנטומיים ההדוקים בהרבה של בעלי חיים צעירים6. מאמר זה מתמקד בהזרקה ישירה של וקטורים אנטרוגרדיים ומדרדרים הקשורים לאדנו יעילים ביותר לתוך חוט השדרה של החולדות כדי לווסת מסלולים מוטוריים עיקריים עם יישום של Cre-dependent-DREADDs, ומרחיב את טווח ההגעה של מחקרי התחדשות רב-מודאליים.
וקטורים נגיפיים הם כלים ביולוגיים חשובים עם מגוון רחב של יישומים, כולל הכנסת חומר גנטי כתחליף לגני מטרה, לווסת חלבוני גדילה ולהתחקות אחר הנוף האנטומי של מערכת העצבים המרכזית 7,8,9. רבים מהפרטים האנטומיים של מסלולים מוטוריים בעמוד השדרה נחקרו באמצעות עוקבים קלאסיים, כלומר, דקסטרן אמין ביוטינילציה. בעוד שעוקבים מסורתיים סייעו בחשיפת נוירואנטומיה, הם אינם נטולי חסרונות: הם מתייגים מסלולים ללא הבחנה גם אם הם מוזרקים כהלכה, ומחקרים מצאו כי הם נלקחים על ידי אקסונים פגומים10,11,12. כתוצאה מכך, הדבר עלול להוביל לפרשנויות שגויות במחקרי התחדשות שבהם אקסונים מנותקים עלולים לטעות בחידוש סיבים.
השיטה הבאה משתמשת במערכת הווקטורים הדו-ויראליים שזכתה לפופולריות לאחרונה במחקרי אפנון, עם שני וקטורים נגיפיים שונים בשני אזורים נפרדים של אותו נוירון13,14. הראשון הוא וקטור שמדביק באופן מקומי את גופי התאים של נוירוני ההקרנה. השני הוא וקטור מדרדר שמועבר מקצות האקסון של נוירוני ההקרנה (איור 1). הווקטור המדרדר נושא את Cre recombinase, והווקטור המקומי משלב את הרצף הכפול "Cre-On" שבו מקודד חלבון פלואורסצנטי (mCherry). הטרנסג'ן המקומי שמבטא גם את ה-hM3Dq וגם את ה-mCherry הוא הפוך יחסית למקדם ומוקף בשני אתרי LoxP (איור 2). לפיכך, mCherry מתבטא רק בנוירוני ההקרנה המותמרים כפליים שבהם Cre recombinase משרה אירוע רקומבינציה בין אתרי LoxP, הופך את האוריינטציה של הטרנסגן למסגרת הקריאה המתאימה ומאפשר ביטוי הן של ה-DREADD והן של החלבון הפלואורסצנטי. ברגע שהטרנסגן הנגיפי נמצא בכיוון הנכון, וכאשר הדבר ישים, ה-DREADDs יכולים לגרום באופן ארעי לנוירומודולציה באמצעות ליגנד מוזרק בנפרד, כלומר קלוזאפין-N-אוקסיד. הפרוטוקול נועד לאמת מחקר נוירומודולציה אינדוקטיבי בילודים, שבו DREADDS מוזרקים כדי לווסת את ה- CSTs באופן סלקטיבי. המערכת הדו-ויראלית פועלת כפוליסת ביטוח, ומבטיחה שכל תא חיובי ל-DREADD ניתן למעקב תחת פלואורסצנטיות בנאמנות גבוהה כדי לאמת את הזריקות.
שיטה זו מסייעת גם לגשר על הפער בחקר היילודים. מד"ב ילדים מציב את האתגרים שלו, ומחקרים המנתחים התחדשות, הנבטה או פלסטיות צריכים להדגיש את ההבדלים בין ילודים למבוגרים 3,15,16,17. על ידי אופטימיזציה של ההליך הכירורגי וביצוע מחקרים אנטומיים קודמים עם צביעת ניסל, אומתו הקואורדינטות הן של זריקות הגולגולת והן של עמוד השדרה. המטרה הייתה לספק שיטה להזרקות כפולות לתוך חולדה ילודים עם נאמנות ושרידות מוגברות.
עבור המודל הנוכחי, וקטור האנטרוגרד הוזרק לתוך גופי התאים של קליפת המוח הסומטומוטורית באמצעות ברגמה כהפניה18,19. מבחינת זריקות עמוד השדרה, הווקטור המדרדר הוזרק ל-laminae V-VII, שם שוכנים20,21 מסופי האקסון CST. ישנן שאלות בסיסיות רבות העומדות בבסיס האופן שבו מודלים מסוימים של נגעים משפיעים על בעלי חיים צעירים באופן שונה, וכיצד ההחלמה שלאחר מכן מתפצלת מבעל חיים מבוגר יותר. מחקר זה מדגים אמצעי איתן לחקר פגיעות צוואר הרחם ויכולת ההשבה של תפקוד הרחם במכרסמים ילודים. לעומת זאת, רוב המחקרים הקודמים התייחסו לתנועת ההחלמה בעקבות פגיעות במותניים או בבית החזה 5,22,23,24. על ידי התאמת הווקטור הנגיפי הכפול עם טכניקת ההזרקה החדשנית המתוארת כאן, פרוטוקול זה מסייע למתן בעיות מסוימות (כלומר, שרידות) שעלולות לפגוע בחקירות מכרסמים ילודים. שיטה זו היא חזקה, מעשית ורב-תכליתית: שינויים קלים בטכניקה יאפשרו מיקוד במסלולים שונים, כלומר CST גחוני, CST גב והמסלולים הגביים העולים.
עבור מערכת זו, וירוס אחד הפועל באופן מקומי (למשל, AAV2) מוזרק באזור של גופי התאים העצביים המעניינים. נגיף שני המועבר בנסיגה ושולט בביטוי הנגיף המקומי מוזרק במסופי האקסון עבור אותה אוכלוסייה עצבית. לכן, מעצם הגדרתם, רק נוירונים קורטיקוספינליים מסומנים. נגיף ה-retroAAV-Cre נבחר עם מקדם CMV פעיל באופן מכונן, שכן פלסמיד המעבורת משמש ליצירת מספר סרוטיפים של AAV לביטוי תלוי Cre במספר סוגי תאים. עבור זריקות קליפת המוח, AAV2 נבחר עם הטרנסגן המונע על ידי מקדם סינפסין-1 כדי להגביל כל ביטוי לנוירונים. מכיוון שהמערכת הדו-ויראלית מסתמכת יותר על המקור והסיום של האוכלוסייה העצבית המעניינת, ניתן להשתמש במספר מקדמים שונים, אם הם יכולים להניע את הביטוי של הגנים המעניינים בתוך האוכלוסייה העצבית המעניינת. לדוגמה, מקדם העצבים המעורר, CamKII, יכול להיות מוחלף בסינפסין-1. בנוסף לשימוש בסרוטיפים אלה של AAV, הובלה מדרדרת לתוך לא בשלה, ובמידה פחותה בהרבה, נוירונים מוטוריים קורטיקוספינליים בוגרים יכולים להיות מושגים גם באמצעות lentivirus גבוה retrograde הובלה (HiRet)25. HiRet lentiviruses משתמשים בגליקופרוטאין כימרי של כלבת/VSV כדי למקד את הקליטה בסינפסה להובלה מדרדרת. בשילוב עם מקדם Tet-On, מערכת 2-ויראלית זו תומכת בביטוי אינדוקטיבי באופן תלוי רטרוגרד26,27.
וירוסים מדרדרים מכניסים וקטורים לחלל הסינפטי של נוירון מטרה, ומאפשרים לו להיקלט על ידי האקסון של התא ולהעביר אותו לגוף התא. בעוד שווקטורים לנטי-ויראליים זכו בעבר להצלחה אדירה, וסיפקו ביטוי ארוך טווח במחקרי ריפוי גנטי, שיטה זו פנתה לכיוון וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו מכמה סיבות פשוטות26,28: AAV חסכוני יותר, יעיל באופן דומה, ומהווה פחות נטל לוגיסטי, בהתחשב בכך שיש לו רמת בטיחות ביולוגית נמוכה יותר29,30,31,32 . בעוד ש-AAV2, הסרוטיפ הנפוץ ביותר, מדגים טרנספקציה חזקה של אקסונים של CST, חוקרים עתידיים עשויים לציין כי AAV1 מציע רב-תכליתיות מסוימת מכיוון שהוא מתייג באופן טרנסינטי, ובכך מציג מספר איטרציות אפשריות במחקרים עתידיים33. ההסתגלות הסופית היא לקודד את הנגיף המדרדר עם Cre-recombinase כך שניתן יהיה להכניס מספר וקטורים אנטרוגרדיים בו זמנית, ובכך להפחית פסולת וירוסים פנימית מיותרת ולמקסם את הסבירות שה- DREADDs יתבטאו בכיוון הנכון.
בסופו של דבר, פרוטוקול זה מדגים הזרקה סימולטנית לתוך קליפת המוח ועמוד השדרה הצווארי, המכוונת במיוחד לגופי התאים ולקצות האקסון של מערכת הקורטיקוצפינל, בהתאמה. העברה בנאמנות גבוהה נראית בקליפת המוח ובחוט השדרה. בעוד שהפרוטוקול המתואר שוכלל עבור חולדות ספראג דאולי בנות 5 ימים, הוא מתאים לימים שלאחר הלידה 4-10 עם התאמות קלות להרדמה וקואורדינטות סטריאוטקטיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

התמודדות מוצלחת עם המכשולים המגבילים את המחקר על חולדות יילודים חשובה לחקר ההבדלים בתוצאות שנראו בפגיעות בחוט השדרה בילדים (SCIs) בהשוואה ל-SCIs של מבוגרים. בנוסף, החדרה אמינה של טיפולים לתאי המטרה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) יכולה להיות מאתגרת, ואי דיוקים יכולים לפגוע ביעילות המחקר או הטיפול. פרוטוקול זה משלב טכנולוגיה וקטורית ויראלית עם טכניקה כירורגית חדשנית כדי להחדיר במדויק טיפולים גנטיים לחולדות ילודים ביום 5 שלאחר הלידה. כאן, וירוס שהונדס להובלה רטרוגרדית (retroAAV2) של Cre מוצג במסופי האקסון של נוירונים קורטיקוספינליים בחוט השדרה, שם הוא מועבר לאחר מכן לגופי התא. קולטן מעצבים בעל אוריינטציה הפוכה כפולה (DIO) המופעל באופן בלעדי על ידי נגיף תרופת המעצבים (DREADD) מוזרק לאחר מכן לקליפת המוח הסומטומוטורית של המוח. טכניקת זיהום כפול זו מקדמת את הביטוי של ה- DREADDs רק בתאי העצב של מערכת הקורטיקוספינל (CST) הנגועים במשותף. לפיכך, הזרקה משותפת סימולטנית של קליפת המוח הסומטומוטורית ומסופי CST צוואריים היא שיטה תקפה לחקר המודולציה הכימוגנית של ההחלמה בעקבות מודלים של SCI צווארי בחולדות ילודים.

הזרקה מוצלחת והובלה של הווקטור הנגיפי אמורה לגרום להתמרה של נוירונים חד צדדיים בחוט השדרה ובקליפת המוח המוטורית. איור 4 מדגים את התיוג של נוירוני CST בשכבה V בקליפת המוח המוטורית של מקטע קורונל מוחי המבטא Cre-dependent-DREADDs-mCherry שהוזרק יחד עם הזרקת עמוד שדרה קונטרלטרלית של rCre. החלקי...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית ליישום טיפולים גנטיים על תת-אוכלוסיות של תאים בחולדות ילודים בגילאים שלאחר הלידה 5-10 ימים על ידי הזרקת משנה כימוגנטית אנטרוגרדית לקליפת המוח הסומטומוטורית ורקומבינאז Cre הניתן להובלה רטרוגרדית לחוט השדרה הצווארי.

התמקדות במערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים עם וקטור דו-ויראלי באמצעות ניתוח משולב של המוח ועמוד השדרה

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

זהו הפרוטוקול הראשון המדגים את ההדבקה המשותפת המוצלחת של מערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים. הוא מספק תוכנית מדויקת כדי לחקור כיצד תת-אוכלוסיות בודדות של תאים ביונקים צעירים תורמות להחלמה מפגיעה בחוט השדרה. כמו טכניקות וקטור ויראליות כפולות אחרות, שיטה זו מאפשרת למשתמש להתמר במדויק תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, בתורו, ומאפשר לחוקרים לזהות את היעילות של טכניקות כימוגנטיות שונות בקידום ההתאוששות.היינו מצפים מחוקרים שאינם מכירים את הטכניקה הזו להיאבק באיתור האנטומיה הנכונה של עמוד השדרה. ולכן אנו ממליצים לך לספור ללא הרף את מקטעי החוליות לעתים קרובות ותמיד לחזור לציוני הדרך שלך. לאחר אישור עומק ההרדמה בגור ספראג דאולי ילודים, זהה את האזור בו יבוצע החתך על ידי לחיצה על המלקחיים בקו האמצע בחלק העליון של הקרקפת, תחושה לתפר הסגיטלי.החזקת העור מתוח כדי להבטיח חתך נקי, ישר ומדויק, בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך מישור התפר הסגיטלי החל מיד מעל קו I. לאחר מכן, זהה את הברגמה על ידי בדיקה עדינה של המלקחיים לאורך פני השטח של הגולגולת, תוך שימת לב לקווי התפר ולכניסה הנגרמת על ידי המלקחיים העוברים לאורך העצמות הקודקודיות והמצחיות. שמרו על הפתח על ידי הפעלת ווים משוקללים בצד העניין.נקה את האפונורוזיס באמצעות שילוב של קצוות כותנה ומספריים זעירים כדי למקסם את החשיפה של הברגרמה לדיוק מוגבר. ודא שהתפר הכתר נמצא בראייה ברורה מספיק לרוחב כדי לספק תבנית גסה להזרקות הבאות. בעזרת המיקרו-מספריים, חותכים חתך של כשלושה על שני מילימטרים של עצם הגולגולת הקדמית השמאלית הסמוכה לברגמה.נקה כל פסולת, נוזל מוחי ודם בעזרת קצוות כותנה. כדי להזריק את הנגיף, הניחו את המחט במקומה ותכנתו את המזרק להזריק מיקרוליטר אחד בקצב של 250 ננוליטר לדקה. עם השלמת ההזרקה, לאפשר למחט לנוח בקליפת המוח במשך שלוש דקות.חזור על הזריקות בקואורדינטות האחרות בסך הכל שלוש זריקות לאורך קליפת המוח ביחס לברגמה, כולן בעומק של 0.6 מילימטרים. לאחר השלמת ההזרקות, תפרו את הקרקפת והעבירו את החיה לשולחן הניתוחים השני לכריתת צוואר הרחם. למשש את בסיס הגולגולת באמצעות אצבעות כדי לזהות את אתר החתך.החזיקו את העור מתוח על ידי הפעלת מתח עם האגודל והאצבע המורה. באמצעות להב מספר 11, מתחילים את החתך בקו האמצע אחד עד שני מילימטרים אחוריים לבסיס הגולגולת ומאריכים את החתך סנטימטר אחד אחורי כדי לחשוף את השריר השטחי. באמצעות הנקודה החדה של הלהב, בעדינות לבצע סדרה של חתכים לאורך קו האמצע של השריר השטחי כדי לחשוף את חלל עמוד השדרה ואת שרירי עמוד השדרה העמוקים.לאחר מכן השתמש זוג מלקחיים כדי לפתוח את השריר ולדמיין את חלון הניתוח. לאחר חשיפת שרירי עמוד השדרה העמוקים, הכנס רטרקטורים לחלון הניתוח והחזיר את חלון הניתוח לרוחב של שבעה עד שמונה מילימטרים, מה שמאפשר מבט ללא הפרעה על עמוד השדרה. זהה את החוליה הצווארית השנייה על ידי התהליך הסיבובי הבולט שלה המקרין באופן דורסני ועוטף שריר גדול בצורת כיפה.בעזרת הקצה השטוח של מגרד עצם, יש לגרד בעדינות את שריר עמוד השדרה העמוק לצדדים כדי לחשוף את חוליות C3 ל-C7. התחילו מדיאלית וגרדו לרוחב לאורך הכיוון המקביל ללמינאה של החוליה כדי להבטיח חשיפה נכונה, מה שמאפשר הבחנה ברורה של הלמינה החולייתית. לשלוט על כל דימום עם קצוות כותנה.שימוש ב- C2 כמדריך בעת ספירת רמות החוליות, חותכים בזהירות את הקצוות הצדדיים של הלמינה הסחוסית ב- C6 ו- C7 באמצעות זוג מספריים זעירים. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, הסר בזהירות את החלק המנותק של הלמינה כדי לחשוף את חוט השדרה, וודא כי חלון עמוד השדרה גדול מספיק כדי להתאים לאתר ההזרקה הרצוי. הניחו את החיה במחזיק הגולגולת הסטריאוטקסי והניחו חתיכת גזה מגולגלת מתחת לגזע החיה כדי להגביה את רבעיה האחוריים.לפני תחילת הזריקות, נקה את חלון עמוד השדרה מכל דם או נוזל מוחי על ידי החלת קצוות כותנה ומשולשי סוגי לאזור, תוך הקפדה שלא להעליב את חוט השדרה. יתר על כן, ליצור מחסום סביב היקף החלון על ידי הצבת חתיכה קטנה של כותנה נספגת בחלקים הצדדיים של חלון עמוד השדרה כדי למנוע חסימה של אתר ההזרקה על ידי דימום מתמשך או דליפת CSF. להזרקות ישירות לחוט השדרה, השתמש בקצה מחט הזרקת הזכוכית כדי להעריך את קו האמצע של חוט השדרה על ידי זיהוי עורק עמוד השדרה.לאחר מכן, הנח את המחט רק אחורית ללמינה C5 בקו האמצע המשוער והשתמש בה כנקודת הייחוס. לאחר מכן, באמצעות מיקרו מניפולטור, להזיז את המחט לרוחב ימינה על ידי 0.3 מילימטרים ולהוריד את המחט עד שהוא רק נוגע פני השטח של חוט השדרה. מעומק זה, צללו את המחט.0.6 מילימטרים לתוך חוט השדרה. הזריקו מיקרוליטר אחד של הנגיף הקשור לרטרו אדנו שניים הנושאים את הגן Cre recombinase במהירות של 250 ננוליטר לדקה. לאחר מכן המתן שתי דקות עד שהנגיף יתפזר לתוך חוט השדרה לפני שתמשוך לאט את המחט.התיוג של נוירונים בשכבה חמש של דרכי הקורטיקוספינליות בקליפת המוח המוטורית של חתך קורונל מוחי המבטא DREADDs תלויי Cre mCherry יחד עם הזרקת עמוד שדרה קונטרלטרלית של רטרו Cre מוצג כאן. היכולת להתמקד באוכלוסיות נוירונים ספציפיות תסייע להגדיר את הניואנסים המניעים את ההתאוששות ולספק דיוק רב יותר לטיפול בפגיעה הבסיסית בחוט השדרה במערכת העצבים המתפתחת. שיטה זו סללה לנו את הדרך לחקור את הכדאיות של שימוש ב-DREADDs מעוררים כאמצעי לטיפול בפגיעה בחוט השדרה בחולדות צעירות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

חד-צדדי Pyramidotomy של מערכת corticospinal בחולדות להערכת טיפולים וישכנע Neuroplasticity

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselective Biolistic המיקוד בOrganotypic פרוסות המוח באמצעות אקדח ג&#39;ין השתנה

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

הקלטה EEG בחופשיות העברת חולדות neonatal בשיטת רומן

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

הדמיה מתקדמת דיפוזיה בהיפוקמפוס של חולדות עם פגיעה מוחית טראומטית מתון

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

קביעת הסטטוס הפונקציונלי של בדרכי Corticospinal בתוך שבוע של שבץ

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

פגיעה מוחית כתוצאה בלייזר בקליפת המוח המוטורית של חולדות

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...