Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio di Shriners Hospitals for Children SHC-84706.

Tutte le seguenti procedure chirurgiche e di cura degli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Temple University. Il protocollo descritto è un intervento chirurgico di sopravvivenza e gli animali sono stati infine eutanasizzati, mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio al completamento dei loro punti temporali.
1. Preparazione pre-chirurgica
<ol><li>Preparare almeno due aghi di vetro tirati per l'iniezione virale u...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+tools+for+causal+cellular+and+neuronal+biology.">Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).</li><li>Brandt, H. M., Apkarian, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-dextran:+A+sensitive+anterograde+tracer+for+neuroanatomic+studies+in+rat+and+monkey.">Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey.</a> Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Reiner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).</li><li>Oguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+virus+vector+infection+to+the+prefrontal+network+of+the+macaque+brain.">Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain.</a> PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).</li><li>Bernstein, D. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+of+stepping+in+rats+after+a+complete+neonatal+spinal+cord+transection+is+not+due+to+regrowth+across+the+lesion+site.">Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site.</a> Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).</li><li>Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. 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M., Grant, G., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitectural+organization+of+the+spinal+cord.">Cytoarchitectural organization of the spinal cord.</a> The rat nervous system. 2, 294-309 (1985).</li><li>Kjell, J., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+models+of+spinal+cord+injury:+From+pathology+to+potential+therapies.">Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).</li><li>Takeoka, A., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+local+proprioceptive+feedback+circuits+initiate+and+maintain+locomotor+recovery+after+spinal+cord+injury.">Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury.</a> Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).</li><li>Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+propriospinal+interneurons+in+recovery+from+spinal+cord+injury.">The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).</li><li>Ohne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+in+rats+with+cervical+spinal+cord+hemisection-neuroanatomical+validation.">Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation.</a> IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills.">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li><li>Sheikh, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrogradely+transportable+lentivirus+tracers+for+mapping+spinal+cord+locomotor+circuits.">Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487, 235-238 (2012).</li><li>Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Abdellatif, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+spinal+cord:+Comparison+between+lentiviral,+adenoviral,+and+retroviral+vector+delivery+systems.">delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).</li><li>Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. 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K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+subcortical+pathways+promote+recovery+of+skilled+hand+function+in+rats+after+corticospinal+and+rubrospinal+tract+injuries.">Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries.</a> Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).</li><li>Tohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+propriospinal+neurons+to+recovery+of+hand+dexterity+after+corticospinal+tract+lesions+in+monkeys.">Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).</li><li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion.">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion.</a> Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+circuits+from+the+sensory+and+motor+cortices+differentially+regulate+skilled+movements+through+distinct+spinal+interneurons.">Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons.</a> Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).</li><li>Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).</li></ol>

La modulazione genetica inducibile dell'attività cerebrale con modificatori chemiogenetici iniettabili è un potente strumento per studiare i vari meccanismi che sono alla base del recupero dalla SCI. L'accuratezza del targeting per i recettori inducibili accoppiati a proteine G (DREADD) è ulteriormente aumentata se si considera che il tracciamento della fluorescenza convalida la precisione anatomica in istologia. Questo articolo discute un metodo affidabile per esplorare se l'inibizione o la stimolazione di percorsi n...

Mentre la SCI è un evento relativamente raro nella popolazione pediatrica, è particolarmente traumatica e causa una disabilità permanente che richiede un'immensa lungimiranza logistica. Inoltre, una percentuale maggiore di SCI pediatrici è classificata come cervicale e completa rispetto alla popolazione adulta 1,2. Un segno distintivo tra le specie di mammiferi è che i neonati guariscono notevolmente meglio dalla SCI rispetto agli adulti, e questo offre l'opportunità di valutare i meccanismi trainanti per il recupero nelle popolazioni più giovani 3,4,5. Nonostante ciò, ci sono meno studi multimodali che affrontano la ricerca sui neonati e sui roditori infantili, in parte a causa della difficoltà aggiuntiva di indirizzare con precisione popolazioni selezionate di neuroni nei punti di riferimento anatomici molto più stretti degli animali più giovani6. Questo articolo si concentra sull'iniezione diretta di vettori adeno-associati anterogradi e retrogradi altamente efficienti nel midollo spinale del ratto per modulare le principali vie motorie con l'applicazione di Cre-dipendenti-DREADD, espandendo la portata degli studi di rigenerazione multimodale.
I vettori virali sono importanti strumenti biologici con un'ampia gamma di applicazioni, tra cui l'introduzione di materiale genetico per sostituire i geni bersaglio, sovraregolare le proteine della crescita e tracciare il paesaggio anatomico del SNC 7,8,9. Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati studiati utilizzando traccianti classici, cioè ammina destrana biotinilata. Mentre i traccianti tradizionali sono stati determinanti nel portare alla luce la neuroanatomia, non sono privi di svantaggi: etichettano indiscriminatamente i percorsi anche se iniettati correttamente, e gli studi hanno scoperto che sono assorbiti dagli assoni danneggiati10,11,12. Di conseguenza, ciò potrebbe portare a interpretazioni errate negli studi di rigenerazione in cui gli assoni recisi potrebbero essere scambiati per fibre rigeneranti.
Il seguente metodo utilizza il sistema di vettori bivirali recentemente reso popolare negli studi di modulazione, con due diversi vettori virali in due aree separate dello stesso neurone13,14. Il primo è un vettore che infetta localmente i corpi cellulari dei neuroni di proiezione. L'altro è un vettore retrogrado trasportato dai terminali assoni dei neuroni di proiezione (Figura 1). Il vettore retrogrado porta Cre ricombinasi, e il vettore locale incorpora la sequenza "Cre-On" a doppio floxed in cui è codificata una proteina fluorescente (mCherry). Il transgene nativo che esprime sia hM3Dq che mCherry è invertito rispetto al promotore ed è affiancato da due siti LoxP (Figura 2). Pertanto, mCherry è espresso solo nei neuroni di proiezione doppiamente trasdotti in cui Cre ricombinasi induce un evento di ricombinazione tra i siti LoxP, capovolgendo l'orientamento del transgene nel frame di lettura appropriato e consentendo l'espressione sia del DREADD che della proteina fluorescente. Una volta che il transgene virale è nell'orientamento corretto, e quando applicabile, i DREADD possono indurre transitoriamente la neuromodulazione attraverso un ligando iniettato separatamente, cioè clozapina-N-ossido. Il protocollo è stato progettato per autenticare la ricerca sulla neuromodulazione inducibile nei neonati, in cui DREADDS viene iniettato per modulare selettivamente i CST. Il sistema a due virali funge da polizza assicurativa, garantendo che ogni cellula positiva al DREADD sia tracciabile sotto fluorescenza con alta fedeltà per convalidare le iniezioni.
Questo metodo aiuta anche a colmare il divario nella ricerca neonatale. La SCI pediatrica presenta le sue sfide e la ricerca che analizza la rigenerazione, la germinazione o la plasticità dovrebbe enfatizzare le differenze tra neonati e adulti 3,15,16,17. Ottimizzando la procedura chirurgica ed eseguendo studi anatomici precedenti con colorazione Nissl, sono state convalidate le coordinate per entrambe le iniezioni craniche e spinali. L'obiettivo era quello di fornire un metodo per doppie iniezioni in un ratto neonatale con maggiore fedeltà e capacità di sopravvivenza.
Per il modello attuale, il vettore anterogrado è stato iniettato nei corpi cellulari della corteccia somatomotoria utilizzando il bregma come riferimento18,19. In termini di iniezioni spinali, il vettore retrogrado è stato iniettato nelle lamine V-VII, dove i terminali assoni CST risiedono20,21. Ci sono molte domande fondamentali alla base di come alcuni modelli di lesione influenzano gli animali più giovani in modo diverso e come il successivo recupero diverge da un animale più anziano. Questo studio dimostra un robusto mezzo per studiare le lesioni cervicali e la recuperabilità della funzione degli arti anteriori nei roditori neonatali. Al contrario, la maggior parte degli studi precedenti ha affrontato il recupero della locomozione a seguito di lesioni lombari o toraciche 5,22,23,24. Accoppiando il vettore a doppio virus con la nuova tecnica di iniezione qui descritta, questo protocollo aiuta a mitigare alcuni problemi (cioè la sopravvivenza) che possono affliggere le indagini sui roditori neonatali. Questo metodo è robusto, pratico e versatile: lievi variazioni nella tecnica consentiranno di indirizzare diversi percorsi, ad esempio CST ventrale, CST dorsale e percorsi dorsali ascendenti.
Per questo sistema, un virus ad azione locale (ad esempio, AAV2) viene iniettato nella regione dei corpi cellulari neuronali di interesse. Un secondo virus trasportato retrogradamente che controlla l'espressione del virus locale viene iniettato ai terminali assoni per quella popolazione neuronale. Quindi, per definizione, solo i neuroni corticospinali sono etichettati. Il virus retroAAV-Cre è stato scelto con un promotore CMV costitutivamente attivo in quanto il plasmide shuttle viene utilizzato per generare diversi sierotipi AAV per l'espressione Cre-dipendente in diversi tipi cellulari. Per le iniezioni corticali, AAV2 è stato scelto con il transgene guidato dal promotore sinapsina-1 per limitare qualsiasi espressione ai neuroni. Poiché il sistema 2-virale si basa maggiormente sull'origine e sulla cessazione della popolazione neuronale di interesse, potrebbero essere utilizzati diversi promotori, se possono guidare l'espressione dei geni di interesse all'interno della popolazione neuronale di interesse. Ad esempio, il promotore neuronale eccitatorio, CamKII, potrebbe essere sostituito per la sinapsina-1. Oltre all'uso di questi sierotipi AAV, il trasporto retrogrado nei motoneuroni corticospinali adulti può anche essere ottenuto utilizzando l'alto lentivirus trasportabile retrogrado (HiRet)25. I lentivirus HiRet utilizzano una glicoproteina chimerica di rabbia / VSV per indirizzare l'assorbimento alla sinapsi per il trasporto retrogrado. In combinazione con un promotore Tet-On, questo sistema 2-virale supporta l'espressione inducibile in modo retrogrado-dipendente26,27.
I virus retrogradi inseriscono vettori nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendogli di essere assorbito dall'assone di quella cellula e trasportato al corpo cellulare. Mentre i vettori lentivirali hanno avuto in precedenza un enorme successo, fornendo espressione a lungo termine negli studi di terapia genica, questo metodo ha ruotato verso i vettori virali adeno-associati per alcune semplici ragioni26,28: AAV è più economico, altrettanto efficace e presenta meno di un onere logistico, dato che ha una designazione di livello di biosicurezza inferiore 29,30,31,32 . Mentre AAV2, il sierotipo più utilizzato, dimostra una robusta trasfezione degli assoni CST, i futuri ricercatori potrebbero notare che AAV1 offre una certa versatilità in quanto etichetta transynapticamente, mettendo così diverse possibili iterazioni in studi futuri33. L'adattamento finale consiste nel codificare il virus retrogrado con Cre-ricombinasi in modo che più vettori anterogradi possano essere introdotti contemporaneamente, riducendo così gli sprechi di virus interni non necessari e massimizzando la probabilità che i DREADD si esprimano nell'orientamento corretto.
In definitiva, questo protocollo dimostra l'iniezione simultanea nella corteccia e nella colonna cervicale, mirando in particolare ai corpi cellulari e ai terminali assoni del tratto corticospinale, rispettivamente. La trasfezione ad alta fedeltà è visibile nella corteccia cerebrale e nel midollo spinale. Mentre il protocollo descritto è stato perfezionato per ratti Sprague Dawley di 5 giorni di età, è adatto per i giorni postnatali 4-10 con piccoli aggiustamenti all'anestesia e alle coordinate stereotassiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

Affrontare con successo gli ostacoli che limitano la ricerca sui ratti neonatali è importante per studiare le differenze nei risultati osservati nelle lesioni del midollo spinale pediatrico (SCI) rispetto alle SCI adulte. Inoltre, l'introduzione affidabile di terapie nelle cellule bersaglio del sistema nervoso centrale (SNC) può essere difficile e le imprecisioni possono compromettere l'efficacia dello studio o della terapia. Questo protocollo combina la tecnologia dei vettori virali con una nuova tecnica chirurgica per introdurre accuratamente le terapie geniche nei ratti neonatali al giorno 5 postnatale. Qui, un virus progettato per il trasporto retrogrado (retroAAV2) di Cre viene introdotto ai terminali assoni dei neuroni corticospinali nel midollo spinale, dove viene successivamente trasportato ai corpi cellulari. Un recettore designer a doppio floxed orientamento-invertito (DIO) attivato esclusivamente dal virus dei farmaci designer (DREADD) viene quindi iniettato nella corteccia somatomotoria del cervello. Questa tecnica di doppia infezione promuove l'espressione dei DREADD solo nei neuroni del tratto corticospinale co-infetti (CST). Pertanto, la co-iniezione simultanea della corteccia somatomotoria e dei terminali CST cervicali è un metodo valido per studiare la modulazione chemiogenetica del recupero seguendo modelli di SCI cervicale nei ratti neonatali.

Il successo dell'iniezione e del trasporto del vettore virale dovrebbe comportare la trasduzione dei neuroni unilaterali nel midollo spinale e nella corteccia motoria. La Figura 4 mostra l'etichettatura dei neuroni CST di strato V nella corteccia motoria di una sezione coronale cerebrale che esprime Cre-dipendente-DREADDs-mCherry co-iniettato con un'iniezione controlaterale della colonna vertebrale di rCre. Le sezioni erano colorate con l'anticorpo dsRed.
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Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per applicare terapie geniche a sottopopolazioni di cellule in ratti neonatali in età postnatale 5-10 giorni iniettando un modificatore chemiogenetico anterogrado nella corteccia somatomotoria e una Cre ricombinasi retrogradamente trasportabile nel midollo spinale cervicale.

Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Questo è il primo protocollo che dimostra il successo della co-infezione del tratto corticospinale nei ratti neonatali. Fornisce un modello accurato per studiare come le singole sottopopolazioni di cellule nei giovani mammiferi contribuiscono al recupero dalle lesioni del midollo spinale. Come altre tecniche di doppio vettore virale, questo metodo consente all'utente di trasdurre con precisione specifiche sottopopolazioni di neuroni, a sua volta, consentendo ai ricercatori di identificare l'efficacia di varie tecniche chemiogenetiche nel promuovere il recupero.Ci aspetteremmo che i ricercatori che non hanno familiarità con questa tecnica abbiano difficoltà a localizzare la corretta anatomia spinale. E quindi ti incoraggiamo a contare continuamente i segmenti vertebrali spesso e a fare sempre riferimento ai tuoi punti di riferimento. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia in un cucciolo neonatale di Sprague Dawley, identificare l'area in cui verrà eseguita l'incisione premendo la pinza nella linea mediana sulla parte superiore del cuoio capelluto, sentendo la sutura sagittale.Tenendo la pelle tesa per garantire un'incisione pulita, dritta e precisa, praticare un'incisione di un centimetro lungo il piano di sutura sagittale iniziando immediatamente sopra la linea I. Successivamente, identificare il bregma sondando delicatamente le pinze lungo la superficie del cranio, prestando molta attenzione alle linee di sutura e a una rientranza causata dal forcipe che corre lungo le ossa parietali e frontali. Mantenere l'apertura applicando ganci ponderati sul lato di interesse.Eliminare l'aponeurosi utilizzando una combinazione di punte di cotone e micro forbici per massimizzare l'esposizione del bregma per una maggiore precisione. Assicurarsi che la sutura coronale sia in chiara vista abbastanza lontano lateralmente da fornire un modello approssimativo per le iniezioni successive. Usando le micro forbici, ritagliare una sezione di circa tre metri per due dell'osso frontale sinistro del cranio immediatamente adiacente al bregma.Eliminare eventuali detriti, liquido cerebrospinale e sangue con punte di cotone. Per iniettare il virus, posizionare l'ago in posizione e programmare l'iniettore per iniettare un microlitro ad una velocità di 250 nanolitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare riposare l'ago nella corteccia per tre minuti.Ripetere le iniezioni alle altre coordinate per un totale di tre iniezioni lungo la corteccia in relazione al bregma, il tutto ad una profondità di 0,6 millimetri. Dopo aver completato le iniezioni, suturare il cuoio capelluto e trasferire l'animale sull'altro tavolo operatorio per la laminectomia cervicale. Palpare la base del cranio usando le dita per identificare il sito di incisione.Tenere la pelle tesa applicando tensione con il pollice e l'indice. Utilizzando una lama numero 11, iniziare l'incisione sulla linea mediana da uno a due millimetri posteriormente alla base del cranio ed estendere l'incisione di un centimetro indietro per esporre il muscolo superficiale. Usando la punta affilata della lama, effettuare delicatamente una serie di tagli lungo la linea mediana del muscolo superficiale per esporre la cavità spinale e i muscoli spinali profondi.Quindi utilizzare un paio di pinze per aprire il muscolo e visualizzare la finestra chirurgica. Una volta che i muscoli spinali profondi sono stati esposti, inserire i divaricatori nella finestra chirurgica e ritrarre la finestra chirurgica a sette-otto millimetri di larghezza, consentendo una visione senza ostacoli della colonna vertebrale. Identificare la seconda vertebra cervicale dal suo processo spinoso prominente che proietta dorsalmente e incapsula un grande muscolo a forma di cupola.Utilizzando il bordo piatto di un raschietto osseo, raschiare delicatamente via il muscolo spinale profondo ai lati per esporre le vertebre da C3 a C7. Inizia mediale e raschia lateralmente lungo la direzione parallela alle lamine delle vertebre per garantire una corretta esposizione, consentendo una chiara distinzione delle lamine vertebrali. Controlla qualsiasi sanguinamento con punte di cotone.Usando C2 come guida quando si contano i livelli vertebrali, tagliare con cura i bordi laterali delle lamine cartilaginee a C6 e C7 usando un paio di micro forbici. Utilizzando un paio di pinze sottili, rimuovere con attenzione la parte sezionata della lamina per esporre il midollo spinale, assicurandosi che la finestra spinale sia abbastanza grande da ospitare il sito di iniezione desiderato. Posiziona l'animale nel supporto cranico stereotassico e posiziona un pezzo di garza arrotolato sotto il tronco dell'animale per sollevare i suoi quarti posteriori.Prima di iniziare le iniezioni, liberare la finestra spinale da qualsiasi sangue o liquido cerebrospinale applicando delicatamente punte di cotone e triangoli Sugi sulla zona, facendo attenzione a non insultare il midollo spinale. Inoltre, creare una barriera attorno al perimetro della finestra posizionando un piccolo pezzo di cotone assorbibile nelle parti laterali della finestra spinale per prevenire l'occlusione del sito di iniezione da sanguinamento continuo o perdite di liquido cerebrospinale. Per le iniezioni dirette nel midollo spinale, utilizzare la punta dell'ago di iniezione di vetro per approssimare la linea mediana del midollo spinale identificando l'arteria spinale.Quindi, posizionare l'ago appena posteriormente alla lamina C5 sulla linea mediana approssimativa e utilizzarlo come punto di riferimento. Quindi, utilizzando il micro manipolatore, spostare l'ago lateralmente verso destra di 0,3 millimetri e abbassare l'ago fino a toccare la superficie del midollo spinale. Da questa profondità, immergere l'ago.0,6 millimetri nel midollo spinale. Iniettare un microlitro del virus retro adeno-associato due portatori del gene Cre ricombinasi a 250 nanolitri al minuto. Quindi attendere due minuti affinché il virus si diffonda nel midollo spinale prima di ritirare lentamente l'ago.La marcatura dei neuroni del tratto corticospinale di livello cinque nella corteccia motoria di una sezione coronale cerebrale che esprime i DREADD Cre-dipendenti mCherry co-iniettati con un'iniezione controlaterale della colonna vertebrale di retro Cre è mostrata qui. Essere in grado di indirizzare specifiche popolazioni neuronali aiuterà a delineare le sfumature che guidano il recupero e fornirà una maggiore precisione per il trattamento della lesione del midollo spinale sottostante nel sistema nervoso in via di sviluppo. Questo metodo ci ha spianato la strada per studiare la fattibilità dell'uso di DREADD eccitatori come mezzo per il trattamento delle lesioni del midollo spinale nei ratti giovani.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Advanced Diffusion Imaging nell'ippocampo di ratti con lievi lesioni cerebrali traumatiche

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

Determinazione dello stato funzionale del tratto Corticospinale entro una settimana dall'ictus

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

Lesione cerebrale indotta dal laser nella Corteccia Motoria dei Ratti

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...