Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

이 작업은 슈라이너스 아동 병원 SHC-84706의 펠로우십 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

다음의 모든 수술 및 동물 관리 절차는 템플 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 설명된 프로토콜은 생존 수술이며, 동물은 결국 시점이 완료될 때 100mg/kg 나트륨 펜토바르비탈의 복강 내 주사로 안락사되었습니다.
1. 수술 전 준비
<ol><li>3.5nL 유리 모세관 피펫을 사용하여 바이러스 주사를 위해 적어도 두 개의 뽑은 유리 바늘을 준비하십시오. DREADD용 바늘 ...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. 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주사 가능한 화학 유전 변형제를 사용한 뇌 활동의 유도 가능한 유전 적 조절은 SCI로부터의 회복의 기초가되는 다양한 메커니즘을 연구하는 강력한 도구입니다. 유도성 G-단백질 결합 수용체(DREADD)에 대한 표적화의 정확도는 형광 추적이 조직학의 해부학적 정밀도를 검증한다는 점을 고려할 때 더욱 향상됩니다. 이 논문은 선택적 신경 경로(흥분성 또는 억제성 DREADDS 포함)를 억제하거나 자극하면...

SCI는 소아 인구에서 비교적 드물게 발생하지만 특히 외상이며 엄청난 물류 선견지명이 필요한 영구 장애를 유발합니다. 또한, 소아 SCI의 더 높은 비율은 성인 인구에 비해 자궁 경부 및 완전으로 분류됩니다 1,2. 포유류 종의 특징은 신생아가 성인보다 SCI에서 현저히 잘 회복된다는 것이며, 이는 젊은 인구 3,4,5에서 회복을위한 추진 메커니즘을 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 신생아 및 유아 설치류 연구를 다루는 다중 모드 연구는 더 적으며, 부분적으로는어린 동물의 훨씬 더 엄격한 해부학적 랜드마크에서 선택된 뉴런 집단을 정확하게 표적으로 삼는 것이 어렵기 때문입니다6. 이 기사는 Cre 의존적 DREADD를 적용하여 주요 운동 경로를 조절하기 위해 쥐 척수에 고효율 전방 및 역행 아데노 관련 벡터를 직접 주입하여 다중 모드 재생 연구의 범위를 확장하는 데 중점을 둡니다.
바이러스 벡터는 표적 유전자를 대체하고, 성장 단백질을 상향 조절하고, CNS 7,8,9의 해부학적 환경을 추적하기 위한 유전 물질의 도입을 포함하여 광범위한 응용 분야를 가진 중요한 생물학적 도구입니다. 척추 운동 경로의 많은 해부학적 세부 사항은 고전적인 추적자, 즉 비오티닐화된 덱스트란 아민을 사용하여 연구되었습니다. 전통적인 추적자는 신경 해부학을 발굴하는 데 중요한 역할을했지만, 올바르게 주입 되더라도 무차별 적으로 경로를 표시하고 연구 결과에 따르면 손상된 축삭10,11,12에 의해 흡수된다는 단점이 없습니다. 결과적으로, 이것은 절단 된 축삭이 재생 섬유로 오인 될 수있는 재생 연구에서 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다.
다음의 방법은 동일한 뉴런13,14의 2개의 개별 영역에 2개의 상이한 바이러스 벡터를 갖는 변조 연구에서 최근에 대중화된 2-바이러스 벡터 시스템을 이용한다. 첫 번째는 투영 뉴런의 세포체를 국부적으로 감염시키는 벡터입니다. 다른 하나는 투영 뉴런의 축삭 말단에서 운반되는 역행 벡터입니다(그림 1). 역행 벡터는 Cre 재조합 효소를 운반하고 로컬 벡터는 형광 단백질 (mCherry)이 인코딩되는 "Cre-On"이중 플록스 서열을 통합합니다. hM3Dq와 mCherry를 모두 발현하는 네이티브 전이유전자는 프로모터에 대해 반전되고 두 개의 LoxP 부위가 측면에 있습니다(그림 2). 따라서 mCherry는 Cre 재조합 효소가 LoxP 부위 간의 재조합 이벤트를 유도하여 전이 유전자의 방향을 적절한 판독 프레임으로 뒤집고 DREADD와 형광 단백질 모두의 발현을 허용하는 이중 형질 도입 된 투영 뉴런에서만 발현됩니다. 바이러스 전이유전자가 올바른 방향에 있고 적용 가능한 경우 DREADD는 별도로 주입된 리간드, 즉 클로자핀-N-옥사이드를 통해 일시적으로 신경 조절을 유도할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아에서 유도성 신경조절 연구를 인증하도록 설계되었으며, 여기서 DREADDS는 CST를 선택적으로 조절하기 위해 주입됩니다. 2-바이러스 시스템은 보험 정책 역할을 하여 모든 DREADD 양성 세포가 형광 하에서 높은 충실도로 추적되어 주사를 검증할 수 있도록 합니다.
이 방법은 또한 신생아 연구의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 소아 SCI는 그 도전 과제를 제시하며 재생, 발아 또는 가소성을 분석하는 연구는 신생아와 성인의 차이점을 강조해야합니다 3,15,16,17. 수술 절차를 최적화하고 Nissl 염색으로 이전 해부학 적 연구를 수행하여 두개골 및 척추 주사에 대한 좌표를 검증했습니다. 목표는 충실도와 생존성이 증가된 신생아 쥐에 이중 주사하는 방법을 제공하는 것이었습니다.
현재 모델의 경우, 전방 벡터는 bregma를 참조18,19로 사용하여 체성 운동 피질의 세포체에 주입되었습니다. 척추 주사의 관점에서, 역행 벡터는 CST 축삭 말단이20,21 개상하는 층류 V-VII에 주입되었다. 특정 병변 모델이 어린 동물에게 어떻게 다르게 영향을 미치는지, 그리고 후속 회복이 나이든 동물과 어떻게 다른지에 대한 많은 근본적인 질문이 있습니다. 이 연구는 신생아 설치류에서 자궁 경부 손상과 앞다리 기능의 회복 가능성을 연구하는 강력한 수단을 보여줍니다. 대조적으로, 이전 연구의 대부분은 요추 또는 흉부 손상 5,22,23,24 후 회복 운동을 다루었습니다. 이중 바이러스 벡터를 여기에 설명된 새로운 주입 기술과 페어링함으로써 이 프로토콜은 신생아 설치류 조사를 방해할 수 있는 특정 문제(즉, 생존 가능성)를 완화하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 강력하고 실용적이며 다재다능합니다 : 기술의 약간의 변형은 다른 경로, 즉 복부 CST, 등쪽 CST 및 오름차순 등쪽 경로를 표적으로 삼을 수 있습니다.
이 시스템의 경우, 하나의 국소 작용 바이러스 (예를 들어, AAV2)가 관심있는 뉴런 세포체의 영역에 주입된다. 국소 바이러스의 발현을 제어하는 두 번째 역행 수송 바이러스는 해당 뉴런 집단의 축삭 말단에 주입됩니다. 따라서 정의에 따라 피질 척수 뉴런 만 표시됩니다. 셔틀 플라스미드가 여러 세포 유형에서 Cre 의존성 발현을 위한 여러 AAV 혈청형을 생성하는 데 사용되기 때문에 레트로AAV-Cre 바이러스는 구성적으로 활성 CMV 프로모터와 함께 선택되었습니다. 피질 주사의 경우, AAV2는 뉴런에 대한 발현을 제한하기 위해 시냅신 -1 전구 운동에 의해 구동되는 전이 유전자로 선택되었습니다. 2-바이러스 시스템은 관심 뉴런 집단의 기원과 종결에 더 의존하기 때문에, 관심 뉴런 집단 내에서 관심 유전자의 발현을 유도할 수 있다면, 몇몇 상이한 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 흥분성 신경 촉진제 인 CamKII는 시냅신 -1을 대체 할 수 있습니다. 이러한 AAV 혈청 형의 사용 외에도, 미성숙으로의 역행 수송, 그리고 훨씬 적은 정도로, 성인 피질 척수 운동 뉴런은 높은 역행 수송 가능한 렌티 바이러스 (HiRet) 25를 사용하여 달성 될 수 있습니다. HiRet 렌티바이러스는 키메라 광견병/VSV 당단백질을 사용하여 역행 수송을 위해 시냅스에서 흡수를 목표로 합니다. Tet-On 프로모터와 결합 된이 2- 바이러스 시스템은 역행 의존적 방식으로 유도 가능한 발현을 지원합니다26,27.
역행 바이러스는 표적 뉴런의 시냅스 공간에 벡터를 삽입하여 해당 세포의 축삭에 흡수되어 세포체로 운반되도록합니다. 렌티바이러스 벡터는 이전에 유전자 치료 연구에서 장기간 발현을 제공하여 엄청난 성공을 거두었지만 이 방법은 몇 가지 간단한 이유로 아데노 관련 바이러스 벡터로 전환되었습니다.26,28: AAV는 더 경제적이고 유사하게 효과적이며 생물안전성 수준 지정이 낮기 때문에 물류 부담이 적습니다. 29,30,31,32 . 가장 많이 사용되는 혈청형인 AAV2는 CST 축삭의 강력한 형질감염을 보여주지만, 미래의 연구자들은 AAV1이 일시적으로 표지될 때 약간의 다양성을 제공하므로 향후 연구에서 몇 가지 가능한 반복을 제시한다는 점에 주목할 수 있습니다33. 최종 적응은 역행 바이러스를 Cre-recombinase로 인코딩하여 여러 전방 벡터를 동시에 도입할 수 있도록 하여 불필요한 사내 바이러스 낭비를 줄이고 DREADD가 올바른 방향으로 발현될 가능성을 최대화하는 것입니다.
궁극적으로이 프로토콜은 피질과 경추에 동시에 주사하는 것을 보여 주며, 특히 피질척수관의 세포체와 축삭 말단을 각각 표적으로 삼습니다. 고충실도 형질감염은 대뇌 피질과 척수에서 볼 수 있습니다. 설명 된 프로토콜은 5 일령의 Sprague Dawley 쥐에게 완벽했지만 마취 및 정위 좌표를 약간 조정하여 출생 후 4-10 일에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

신생아 쥐에 대한 연구를 제한하는 장애물을 성공적으로 해결하는 것은 성인 SCI와 비교하여 소아 척수 손상(SCI)에서 나타나는 결과의 차이를 연구하는 데 중요합니다. 또한 중추신경계(CNS)의 표적 세포에 치료법을 안정적으로 도입하는 것은 어려울 수 있으며 부정확성은 연구 또는 치료의 효능을 손상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터 기술과 새로운 수술 기술을 결합하여 출생 후 5 일에 신생아 쥐에게 유전자 치료법을 정확하게 도입합니다. 여기에서 Cre의 역행 수송 (retroAAV2)을 위해 설계된 바이러스가 척수에있는 피질 척수 뉴런의 축삭 말단에 도입되어 세포체로 운반됩니다. 그런 다음 디자이너 약물(DREADD) 바이러스에 의해 독점적으로 활성화된 이중 플록스 역 배향(DIO) 디자이너 수용체를 뇌의 체성 운동 피질에 주입합니다. 이 이중 감염 기술은 공동 감염된 피질 척수관 (CST) 뉴런에서만 DREADD의 발현을 촉진합니다. 따라서, 체성 운동 피질과 자궁 경부 CST 말단의 동시 주사는 신생아 쥐에서 자궁 경부 SCI 모델에 따른 회복의 화학 유전 조절을 연구하기위한 유효한 방법이다.

바이러스 벡터의 성공적인 주입 및 수송은 척수와 운동 피질에서 일방적 인 뉴런의 형질 도입을 초래해야합니다. 그림 4 는 rCre의 반대쪽 척추 주입과 함께 Cre 의존적 DREADDs-mCherry를 발현하는 뇌 관상 절편의 운동 피질에서 층 V CST 뉴런의 표지를 보여줍니다. 절편을 dsRed 항체로 염색하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_...

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Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.

뇌 및 척추 결합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관 표적화

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

이것은 신생아 쥐에서 피질 척수관의 성공적인 공동 감염을 입증하는 최초의 프로토콜입니다. 어린 포유류에서 세포의 개별 하위 집단이 척수 손상으로부터의 회복에 어떻게 기여하는지 조사하기위한 정확한 청사진을 제공합니다. 다른 이중 바이러스 벡터 기술과 마찬가지로이 방법을 사용하면 사용자가 뉴런의 특정 하위 집단을 정확하게 형질 도입 할 수 있으므로 연구원은 회복을 촉진하는 다양한 화학 발생 기술의 효과를 확인할 수 있습니다.우리는이 기술에 익숙하지 않은 연구자들이 적절한 척추 해부학을 찾는 데 어려움을 겪을 것으로 기대합니다. 따라서 척추 부분을 지속적으로 자주 계산하고 항상 랜드 마크를 다시 참조하는 것이 좋습니다. 신생아 Sprague Dawley 강아지의 마취 깊이를 확인한 후 두피 상단의 정중선에있는 집게를 눌러 절개 부위를 확인하고 시상 봉합사를 느낍니다.깨끗하고 직선이며 정확한 절개를 위해 피부를 팽팽하게 잡고 I 라인 바로 위에서 시작하여 시상 봉합면을 따라 1cm 절개를하십시오. 다음으로, 두개골 표면을 따라 집게를 부드럽게 조사하고 봉합사와 정수리 및 정면 뼈를 따라 흐르는 집게로 인한 움푹 들어간 곳에주의를 기울여 브레그마를 식별하십시오. 관심 측면에 가중치 후크를 적용하여 개구부를 유지하십시오.면봉과 마이크로 가위의 조합을 사용하여 동맥 경화증을 제거하여 브레그마의 노출을 최대화하여 정확도를 높입니다. 관상 봉합사가 후속 주사를 위한 대략적인 템플릿을 제공할 수 있을 만큼 충분히 측면으로 명확하게 보이는지 확인하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 브레그마 바로 옆에 있는 왼쪽 정면 두개골 뼈의 약 3x2mm 부분을 잘라냅니다.면봉으로 파편, 뇌척수액 및 혈액을 제거하십시오. 바이러스를 주입하려면 바늘을 제자리에 놓고 분당 250나노리터의 속도로 1마이크로리터를 주입하도록 인젝터를 프로그래밍합니다. 주사가 끝나면 바늘을 피질에 3 분 동안 두십시오.브레그마와 관련하여 피질을 따라 총 3 회 주사하기 위해 다른 좌표에서 주사를 반복하며 모두 0.6mm 깊이입니다. 주사를 마친 후 두피를 봉합하고 동물을 다른 수술대로 옮겨 자궁 경부 후궁 절제술을 시행합니다. 절개 부위를 식별하기 위해 손가락을 사용하여 두개골 바닥을 촉지합니다.엄지와 검지로 장력을 가하여 피부를 팽팽하게 유지하십시오. 11번 칼날을 사용하여 두개골 기저부 뒤쪽 1-2mm 정중선에서 절개를 시작하고 절개 부위를 후방 1cm 연장하여 표재성 근육을 노출시킵니다. 칼날의 날카로운 부분을 사용하여 표면 근육의 정중선을 따라 일련의 절단을 부드럽게 만들어 척추강과 깊은 척추 근육을 노출시킵니다.그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 근육을 펴고 수술 창을 시각화하십시오. 깊은 척추 근육이 노출되면 견인기를 수술 창에 삽입하고 수술 창을 7-8mm 너비로 수축시켜 척추를 방해받지 않고 볼 수 있도록 합니다. 두 번째 경추는 등쪽으로 돌출되고 큰 돔 모양의 근육을 캡슐화하는 두드러진 가시돌기로 식별합니다.뼈 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여 깊은 척추 근육을 옆으로 부드럽게 긁어 C3에서 C7 척추를 노출시킵니다. 내측에서 시작하여 척추 층과 평행 한 방향을 따라 옆으로 긁어 적절한 노출을 보장하여 척추 층을 명확하게 구별 할 수 있습니다. 면 끝으로 출혈을 조절하십시오.척추 수준을 계산할 때 C2를 가이드로 사용하여 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 C6 및 C7에서 연골 층의 측면 가장자리를 조심스럽게 자릅니다. 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 얇은 판의 해부 된 부분을 조심스럽게 제거하여 척수를 노출시켜 척추 창이 원하는 주사 부위를 수용 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 동물을 정위 두개골 홀더에 놓고 동물의 몸통 아래에 롤업 된 거즈 조각을 놓아 뒷부분을 높입니다.주사를 시작하기 전에 면봉과 Sugi 삼각형을 해당 부위에 부드럽게 적용하여 척추 창에서 혈액이나 뇌척수액을 지우고 척수를 모욕하지 않도록주의하십시오. 또한, 지속적인 출혈 또는 CSF 누출에 의한 주사 부위의 폐색을 방지하기 위해 척추 창의 측면 부분에 작은 흡수성면 조각을 배치하여 창 둘레에 장벽을 만듭니다. 척수에 직접 주사하려면 유리 주사 바늘의 끝을 사용하여 척수 동맥을 식별하여 척수의 정중선을 근사화합니다.다음으로, 바늘을 C5 층 바로 뒤쪽의 대략적인 정중선에 놓고 이것을 기준점으로 사용하십시오. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 오른쪽으로 0.3mm 옆으로 이동하고 척수 표면에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 이 깊이에서 바늘을 뛰어 넘으십시오.척수 속으로 0.6 밀리미터. Cre 재조합 효소 유전자를 운반하는 레트로 아데노 관련 바이러스 2 마이크로리터를 분당 250 나노리터로 1 마이크로리터 주입한다. 그런 다음 바이러스가 척수로 확산 될 때까지 2 분 동안 기다렸다가 바늘을 천천히 빼냅니다.Cre 의존성 DREADDs mCherry를 발현하는 뇌 관상 절편의 운동 피질에있는 5 층 피질 척수 관 뉴런의 표지와 retro Cre의 반대쪽 척추 주입이 여기에 표시됩니다. 특정 뉴런 집단을 표적으로 삼을 수 있으면 회복을 유도하는 뉘앙스를 묘사하고 발달 중인 신경계의 근본적인 척수 손상을 치료하는 데 더 많은 정확도를 제공하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 어린 쥐의 척수 손상을 치료하기위한 수단으로 흥분성 DREADD를 사용하는 실행 가능성을 조사 할 수있는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

연구

신경과학

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

신경 가소성 유도 치료의 평가를위한 흰쥐의 피질 요로의 일방적 Pyramidotomy

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

위치 선택성과 유전자는 수정 된 유전자 총을 사용의 Organotypic 뇌 조각에 타겟팅

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

새로운 방법으로 자유롭게 움직이는 신생아 쥐의 뇌파 기록

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

가벼운 외상성 뇌 손상을 가진 쥐의 해마에 있는 향상된 확산 화상 진찰

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

뇌졸중 1 주일 이내에 코르티코 척수의 기능 상태 결정

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

쥐의 모터 피질에서 레이저 유도 된 뇌 손상

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...