Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudos do Shriners Hospitals for Children SHC-84706.

Todos os seguintes procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Temple University. O protocolo descrito é uma cirurgia de sobrevida, e os animais foram eventualmente eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico ao término de seus períodos.
1. Preparação pré-cirúrgica
<ol><li>Preparar pelo menos duas agulhas de vidro puxadas para injeção viral usando pipetas capilares de vidro de 3...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. 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A modulação genética induzível da atividade cerebral com modificadores quimiogenéticos injetáveis é uma ferramenta poderosa no estudo dos vários mecanismos subjacentes à recuperação da LME. A precisão do direcionamento para os receptores acoplados à proteína G induzíveis (DREADDs) é ainda maior quando se considera que o traçado por fluorescência valida a precisão anatômica na histologia. Este artigo discute um método confiável para explorar se a inibição ou estimulação de vias neuronais selecion...

Embora a LM seja uma ocorrência relativamente rara na população pediátrica, é particularmente traumática e causa uma incapacidade permanente que requer imensa previsão logística. Além disso, uma maior proporção de LME pediátrica é classificada como cervical e completa em comparação com a população adulta 1,2. Uma característica das espécies de mamíferos é que os neonatos se recuperam notavelmente melhor da LM do que os adultos, o que oferece uma oportunidade para avaliar os mecanismos determinantes para a recuperação em populações mais jovens 3,4,5. Apesar disso, há menos estudos multimodais que abordam a pesquisa de recém-nascidos e roedores infantis, em parte devido à dificuldade adicional de direcionar com precisão populações selecionadas de neurônios nos marcos anatômicos muito mais apertados de animais mais jovens6. Este artigo enfoca a injeção direta de vetores adenoassociados ânterogrados e retrógrados altamente eficientes na medula espinhal de ratos para modular as principais vias motoras com a aplicação de DREADDs dependentes de Cre, expandindo o alcance de estudos de regeneração multimodal.
Os vetores virais são importantes ferramentas biológicas com uma amplitude de aplicações, incluindo a introdução de material genético para substituir genes-alvo, regular positivamente as proteínas de crescimento e traçar a paisagem anatômica do SNC 7,8,9. Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras espinhais têm sido estudados usando traçadores clássicos, ou seja, a amina dextrana biotinilada. Embora os traçadores tradicionais tenham sido fundamentais para a descoberta da neuroanatomia, eles não estão isentos de desvantagens: eles rotulam indiscriminadamente as vias, mesmo que corretamente injetados, e estudos descobriram que eles são absorvidos por axônios danificados10,11,12. Consequentemente, isso poderia levar a interpretações incorretas em estudos de regeneração, onde axônios cortados poderiam ser confundidos com fibras regeneradoras.
O método a seguir utiliza o sistema de vetores bivirais recentemente popularizado em estudos de modulação, com dois vetores virais diferentes em duas áreas separadas do mesmo neurônio13,14. O primeiro é um vetor que infecta localmente os corpos celulares dos neurônios de projeção. O outro é um vetor retrógrado sendo transportado dos terminais axônicos dos neurônios de projeção (Figura 1). O vetor retrógrado carrega Cre recombinase, e o vetor local incorpora a sequência de floxe duplo "Cre-On" na qual uma proteína fluorescente (mCherry) é codificada. O transgene nativo que expressa tanto hM3Dq quanto mCherry é invertido em relação ao promotor e é flanqueado por dois sítios LoxP (Figura 2). Assim, o mCherry só é expresso nos neurônios de projeção duplamente transduzidos onde a Cre recombinase induz um evento de recombinação entre os sítios LoxP, invertendo a orientação do transgene para o quadro de leitura apropriado e permitindo a expressão do DREADD e da proteína fluorescente. Uma vez que o transgene viral esteja na orientação correta, e quando aplicável, os DREADDs podem induzir transitoriamente a neuromodulação através de um ligante injetado separadamente, ou seja, clozapina-N-óxido. O protocolo foi projetado para autenticar pesquisas de neuromodulação induzíveis em neonatos, em que os DREADDS são injetados para modular os CSTs seletivamente. O sistema de dois vírus atua como uma apólice de seguro, garantindo que cada célula positiva para DREADD seja rastreável sob fluorescência com alta fidelidade para validar as injeções.
Este método também ajuda a preencher a lacuna na pesquisa neonatal. A LM pediátrica apresenta seus desafios, e pesquisas que analisem a regeneração, a brotação ou a plasticidade devem enfatizar as diferenças entre neonatos e adultos 3,15,16,17. Otimizando o procedimento cirúrgico e realizando estudos anatômicos prévios com coloração de Nissl, as coordenadas para as injeções cranianas e espinhais foram validadas. O objetivo era fornecer um método para injeções duplas em um rato neonatal com maior fidelidade e capacidade de sobrevivência.
Para o modelo atual, o vetor anterógrado foi injetado nos corpos celulares do córtex somatomotor utilizando o bregma como referência18,19. Em relação às injeções espinhais, o vetor retrógrado foi injetado nas lâminas V-VII, onde residem os terminais axônicos CST20,21. Existem muitas questões fundamentais subjacentes a como certos modelos de lesões afetam animais mais jovens de forma diferente e como a recuperação subsequente diverge de um animal mais velho. Este estudo demonstra um meio robusto de estudar lesões cervicais e a recuperabilidade da função dos membros anteriores em roedores neonatais. Em contrapartida, a maioria dos estudos anteriores abordou a locomoção da recuperação após lesões lombares ou torácicas 5,22,23,24. Ao emparelhar o vetor duplo-viral com a nova técnica de injeção descrita aqui, este protocolo ajuda a mitigar certos problemas (ou seja, a capacidade de sobrevivência) que podem atormentar as investigações de roedores neonatais. Este método é robusto, prático e versátil: pequenas variações na técnica permitirão atingir diferentes vias, ou seja, TSC ventral, TSC dorsal e vias dorsais ascendentes.
Para este sistema, um vírus de ação local (por exemplo, AAV2) é injetado na região dos corpos celulares neuronais de interesse. Um segundo vírus transportado retrógrado que controla a expressão do vírus local é injetado nos terminais axônicos para essa população neuronal. Assim, por definição, apenas os neurônios corticoespinhais são rotulados. O vírus retroAAV-Cre foi escolhido com um promotor de CMV constitutivamente ativo, pois o plasmídeo shuttle é usado para gerar vários sorotipos de AAV para expressão dependente de Cre em vários tipos de células. Para injeções corticais, o AAV2 foi escolhido com o transgene acionado pelo promotor de sinapsina-1 para limitar qualquer expressão aos neurônios. Como o sistema 2-viral depende mais da origem e término da população neuronal de interesse, vários promotores diferentes poderiam ser usados, se eles puderem impulsionar a expressão dos genes de interesse dentro da população neuronal de interesse. Por exemplo, o promotor neuronal excitatório, CamKII, poderia ser substituído pela sinapsina-1. Além do uso desses sorotipos de AAV, o transporte retrógrado para imaturos e, em muito menor grau, neurônios motores corticoespinhais adultos também pode ser alcançado usando o lentivírus transportável retrógrado alto (HiRet)25. Os lentivírus HiRet usam uma glicoproteína quimérica de raiva/VSV para direcionar a captação na sinapse para o transporte retrógrado. Combinado com um promotor Tet-On, este sistema 2-viral suporta a expressão induzível de forma retrógrada-dependente26,27.
Os vírus retrógrados inserem vetores no espaço sináptico de um neurônio-alvo, permitindo que ele seja absorvido pelo axônio dessa célula e transportado para o corpo celular. Embora os vetores lentivirais tenham tido anteriormente um tremendo sucesso, proporcionando expressão a longo prazo em estudos de terapia gênica, esse método girou em direção aos vetores virais adenoassociados por algumas razões simples26,28: o AAV é mais econômico, igualmente eficaz e apresenta menos carga logística, uma vez que possui uma designação de nível de biossegurança mais baixa 29,30,31,32 . Enquanto o AAV2, o sorotipo mais utilizado, demonstra transfecção robusta de axônios CST, futuros pesquisadores podem notar que o AAV1 oferece alguma versatilidade ao rotular transinapticamente, apresentando assim várias iterações possíveis em estudos futuros33. A adaptação final é codificar o vírus retrógrado com Cre-recombinase para que múltiplos vetores anterógrados possam ser introduzidos simultaneamente, reduzindo assim o desperdício desnecessário de vírus internos e maximizando a probabilidade de os DREADDs se expressarem na orientação correta.
Em última análise, este protocolo demonstra a injeção simultânea no córtex e na coluna cervical, visando especificamente os corpos celulares e os terminais axônicos do trato corticoespinhal, respectivamente. A transfecção de alta fidelidade é observada no córtex cerebral e na medula espinhal. Embora o protocolo descrito tenha sido aperfeiçoado para ratos Sprague Dawley com 5 dias de idade, é adequado para os dias pós-natais 4-10 com pequenos ajustes na anestesia e coordenadas estereotáxicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

Enfrentar com sucesso os obstáculos que restringem a pesquisa em ratos neonatais é importante para estudar as diferenças nos resultados observados nas lesões da medula espinhal pediátrica (LME) em comparação com as ISCs adultas. Além disso, a introdução confiável de terapias nas células-alvo do sistema nervoso central (SNC) pode ser um desafio, e imprecisões podem comprometer a eficácia do estudo ou da terapia. Este protocolo combina a tecnologia de vetores virais com uma nova técnica cirúrgica para introduzir com precisão terapias genéticas em ratos neonatais no 5º dia pós-natal. Aqui, um vírus projetado para o transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre é introduzido nos terminais axônicos dos neurônios corticoespinhais na medula espinhal, onde é posteriormente transportado para os corpos celulares. Um receptor projetista de orientação invertida (DIO) de dupla floxe exclusivamente ativado pelo vírus da droga (s) designer (DREADD) é então injetado no córtex somatomotor do cérebro. Esta técnica de dupla infecção promove a expressão dos DREADDs apenas nos neurônios do trato corticoespinhal (TSC) co-infectados. Assim, a co-injeção simultânea do córtex somatomotor e dos terminais CST cervical é um método válido para estudar a modulação quimiogenética da recuperação seguindo modelos de LM cervical em ratos neonatais.

A injeção e o transporte bem-sucedidos do vetor viral devem resultar na transdução de neurônios unilaterais na medula espinhal e no córtex motor. A Figura 4 demonstra a marcação de neurônios CST da camada V no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando Cre-dependentes-DREADDs-mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de rCre na coluna. Os cortes foram corados com anticorpo dsRed.
<img alt="Figure ...

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Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.

Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Este é o primeiro protocolo que demonstra a coinfecção bem-sucedida do trato corticoespinhal em ratos neonatais. Ele fornece um modelo preciso para investigar como subpopulações individuais de células em mamíferos jovens contribuem para a recuperação da lesão da medula espinhal. Como outras técnicas de vetor viral duplo, este método permite que o usuário transduzir com precisão subpopulações específicas de neurônios, por sua vez, permitindo que os pesquisadores identifiquem a eficácia de várias técnicas quimiogenéticas na promoção da recuperação.Esperamos que os pesquisadores que não estão familiarizados com essa técnica lutem para localizar a anatomia espinhal adequada. E por isso encorajamos você a contar continuamente os segmentos vertebrais com frequência e sempre se referir aos seus pontos de referência. Após confirmar a profundidade da anestesia em um filhote de Sprague Dawley neonatal, identifique a área onde a incisão será feita pressionando a pinça na linha média na parte superior do couro cabeludo, sentindo a sutura sagital.Segurando a pele esticada para garantir uma incisão limpa, reta e precisa, faça uma incisão de um centímetro ao longo do plano de sutura sagital começando imediatamente acima da linha I. Em seguida, identifique o bregma sondando suavemente o fórceps ao longo da superfície do crânio, prestando muita atenção às linhas de sutura e a um recuo causado pelo fórceps que corre ao longo dos ossos parietais e frontais. Mantenha a abertura aplicando ganchos ponderados no lado de interesse.Limpe a aponeurose usando uma combinação de pontas de algodão e micro tesouras para maximizar a exposição do bregma para maior precisão. Certifique-se de que a sutura coronal esteja em visão clara o suficiente lateralmente para fornecer um modelo aproximado para injeções subsequentes. Usando a micro tesoura, corte uma seção de aproximadamente três por dois milímetros do osso do crânio frontal esquerdo imediatamente adjacente ao bregma.Limpe quaisquer detritos, líquido cefalorraquidiano e sangue com pontas de algodão. Para injetar o vírus, coloque a agulha no lugar e programe o injetor para injetar um microlitro a uma taxa de 250 nanolitros por minuto. Após a conclusão da injeção, deixe a agulha descansar no córtex por três minutos.Repita as injeções nas outras coordenadas para um total de três injeções ao longo do córtex em relação ao bregma, todas a uma profundidade de 0,6 milímetros. Depois de completar as injeções, suture o couro cabeludo e transfira o animal para a outra mesa de operação para laminectomia cervical. Apalpar a base do crânio usando os dedos para identificar o local da incisão.Mantenha a pele tensa aplicando tensão com o polegar e o dedo indicador. Usando uma lâmina número 11, comece a incisão na linha média um a dois milímetros posterior à base do crânio e estenda a incisão um centímetro depois para expor o músculo superficial. Usando o ponto afiado da lâmina, faça suavemente uma série de cortes ao longo da linha média do músculo superficial para expor a cavidade espinhal e os músculos espinhais profundos.Em seguida, use um par de pinças para abrir o músculo e visualizar a janela cirúrgica. Uma vez que os músculos espinhais profundos tenham sido expostos, insira afastadores na janela cirúrgica e retraia a janela cirúrgica para sete a oito milímetros de largura, permitindo uma visão desobstruída da coluna vertebral. Identifique a segunda vértebra cervical por seu proeminente processo espinhoso que se projeta dorsalmente e encapsula um grande músculo em forma de cúpula.Usando a borda plana de um raspador de ossos, raspe suavemente o músculo espinhal profundo para os lados para expor as vértebras C3 a C7. Inicie a mediana e raspe lateralmente ao longo da direção paralela às lâminas das vértebras para garantir a exposição adequada, permitindo uma distinção clara das lâminas vertebrais. Controle qualquer sangramento com pontas de algodão.Usando C2 como guia ao contar os níveis vertebrais, corte cuidadosamente as bordas laterais das lâminas cartilaginosas em C6 e C7 usando um par de micro tesouras. Usando um par de pinças finas, remova cuidadosamente a porção dissecada da lâmina para expor a medula espinhal, garantindo que a janela espinhal seja grande o suficiente para acomodar o local de injeção desejado. Coloque o animal no suporte craniano estereotáxico e coloque um pedaço enrolado de gaze sob o tronco do animal para elevar seus quartos traseiros.Antes de iniciar as injeções, limpe a janela espinhal de qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano aplicando suavemente pontas de algodão e triângulos de Sugi na área, tomando cuidado para não insultar a medula espinhal. Além disso, crie uma barreira ao redor do perímetro da janela, colocando um pequeno pedaço de algodão absorvível nas porções laterais da janela espinhal para evitar a oclusão do local da injeção por sangramento contínuo ou vazamento de LCR. Para injeções diretas na medula espinhal, use a ponta da agulha de injeção de vidro para se aproximar da linha média da medula espinhal, identificando a artéria espinhal.Em seguida, coloque a agulha logo posterior à lâmina C5 na linha média aproximada e use-a como ponto de referência. Em seguida, usando o micromanipulador, mova a agulha lateralmente para a direita em 0,3 milímetros e abaixe a agulha até que ela apenas toque a superfície da medula espinhal. A partir desta profundidade, mergulhe a agulha.0,6 milímetros na medula espinhal. Injete um microlitro do vírus retro adenoassociado dois carregando o gene Cre recombinase a 250 nanolitros por minuto. Em seguida, aguarde dois minutos para que o vírus se difunda na medula espinhal antes de retirar lentamente a agulha.A marcação de neurônios do trato corticoespinhal da camada cinco no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando DREADDs dependentes de Cre mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de Cre retro na coluna vertebral é mostrada aqui. Ser capaz de atingir populações neuronais específicas ajudará a delinear as nuances que impulsionam a recuperação e fornecerá mais precisão para o tratamento da lesão subjacente da medula espinhal no sistema nervoso em desenvolvimento. Este método abriu o caminho para que pudéssemos investigar a viabilidade do uso de DREADDs excitatórios como um meio para o tratamento da lesão medular em ratos juvenis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Neurociência

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

Unilateral Pyramidotomy do Corticospinal Tract em Ratos de Avaliação de Terapias de indução de neuroplasticidade

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

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With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

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Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

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Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

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EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Imagem latente avançada da difusão no Hippocampus dos ratos com ferimento de cérebro traumático suave

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

Determinando o Status Funcional do Trato Corticorrindiano dentro de uma semana de Derrame

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

Lesão cerebral induzida por laser no córtex motor de ratos

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...