Name: targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Bu çalışma, Shriners Çocuk Hastaneleri SHC-84706'dan bir burs hibesi ile finanse edildi.

Aşağıdaki cerrahi ve hayvan bakım prosedürlerinin tümü Temple Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tarif edilen protokol bir sağkalım ameliyatıdır ve hayvanlar sonunda zaman noktalarının tamamlanmasında 100 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile ötenazi yapılmıştır.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
<ol><li>3.5 nL cam kılcal pipetler kullanarak viral enjeksiyon için en az iki çekilmiş cam iğne hazırlay?...

<ol>
	<li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population:+A+systematic+review+of+the+literature.">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li><li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states:+Years+1997+and+2000.">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li><li>Bregman, B. S., Goldberger, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+plasticity+and+sparing+of+function+after+spinal+cord+damage+in+neonatal+cats.">Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats.</a> Science. 217 (4559), 553-555 (1982).</li><li>Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+corticospinal+projections+after+large+lesions+of+the+cerebral+hemisphere+in+neonatal+rats.">Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats.</a> Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).</li><li>Commissiong, J. W., Toffano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+transection+at+different+postnatal+ages:+Recovery+of+motor+coordination+correlated+with+spinal+cord+catecholamines.">Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines.</a> Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).</li><li>Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+neuropathology+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+developing+and+adult+rats.">Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualizing+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>Pawliuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+sickle+cell+disease+in+transgenic+mouse+models+by+gene+therapy.">Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy.</a> Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).</li><li>Atasoy, D., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+tools+for+causal+cellular+and+neuronal+biology.">Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).</li><li>Brandt, H. M., Apkarian, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-dextran:+A+sensitive+anterograde+tracer+for+neuroanatomic+studies+in+rat+and+monkey.">Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey.</a> Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Reiner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).</li><li>Oguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+virus+vector+infection+to+the+prefrontal+network+of+the+macaque+brain.">Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain.</a> PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).</li><li>Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+corticospinal+tract+following+midthoracic+spinal+injury+in+the+postnatal+rat.">Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).</li><li>Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+young+rats.">Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).</li><li>Tillakaratne, N. J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+of+stepping+in+rats+after+a+complete+neonatal+spinal+cord+transection+is+not+due+to+regrowth+across+the+lesion+site.">Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site.</a> Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).</li><li>Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+analysis+of+motor+cortical+plasticity+after+cortical+lesions+in+newborn+rats.">Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats.</a> Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).</li><li>Gennaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stroke+in+the+developing+rat+motor+cortex+induces+age-+and+experience-dependent+maladaptive+plasticity+of+corticospinal+system.">Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).</li><li>Brichta, A. M., Grant, G., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitectural+organization+of+the+spinal+cord.">Cytoarchitectural organization of the spinal cord.</a> The rat nervous system. 2, 294-309 (1985).</li><li>Kjell, J., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+models+of+spinal+cord+injury:+From+pathology+to+potential+therapies.">Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).</li><li>Takeoka, A., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+local+proprioceptive+feedback+circuits+initiate+and+maintain+locomotor+recovery+after+spinal+cord+injury.">Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury.</a> Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).</li><li>Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+propriospinal+interneurons+in+recovery+from+spinal+cord+injury.">The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).</li><li>Ohne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+in+rats+with+cervical+spinal+cord+hemisection-neuroanatomical+validation.">Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation.</a> IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills.">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li><li>Sheikh, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrogradely+transportable+lentivirus+tracers+for+mapping+spinal+cord+locomotor+circuits.">Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).</li><li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates.">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487, 235-238 (2012).</li><li>Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+injection+of+a+lentiviral+vector+highlights+multiple+motor+pathways+in+the+rat+spinal+cord.">Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).</li><li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. J., Moon, L. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+A+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).</li><li>Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+as+a+tracer+for+labeling+axons:+Implications+for+axon+regeneration.">Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration.</a> Plos One. 9 (2), 87447 (2014).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Abdellatif, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+spinal+cord:+Comparison+between+lentiviral,+adenoviral,+and+retroviral+vector+delivery+systems.">delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).</li><li>Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+and+application+of+anterograde+transsynaptic+AAV+for+probing+neural+circuitry.">Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+after+cervical+spinal+cord+hemisection+in+rats:+A+comparison+of+juveniles+and+adults.">Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults.</a> Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).</li><li>Alstermark, B., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuits+for+skilled+reaching+and+grasping.">Circuits for skilled reaching and grasping.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Al&#237;as, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+subcortical+pathways+promote+recovery+of+skilled+hand+function+in+rats+after+corticospinal+and+rubrospinal+tract+injuries.">Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries.</a> Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).</li><li>Tohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+propriospinal+neurons+to+recovery+of+hand+dexterity+after+corticospinal+tract+lesions+in+monkeys.">Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).</li><li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion.">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion.</a> Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+circuits+from+the+sensory+and+motor+cortices+differentially+regulate+skilled+movements+through+distinct+spinal+interneurons.">Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons.</a> Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).</li><li>Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).</li></ol>

Enjekte edilebilir kemogenetik değiştiriciler ile beyin aktivitesinin indüklenebilir genetik modülasyonu, SCI'den iyileşmenin altında yatan çeşitli mekanizmaları incelemede güçlü bir araçtır. İndüklenebilir G-proteinine bağlı reseptörler (DREADD'ler) için hedeflemenin doğruluğu, floresan izlemenin histolojideki anatomik hassasiyeti doğruladığı düşünüldüğünde daha da artar. Bu yazıda, seçilmiş nöronal yolakların (uyarıcı veya inhibitör DREADD'lerle) inhibe edilmesinin veya uyarılm...

SKY, pediatrik popülasyonda nispeten nadir görülen bir olay olsa da, özellikle travmatiktir ve muazzam lojistik öngörü gerektiren kalıcı bir sakatlığa neden olur. Ayrıca, pediatrik SCI'lerin daha yüksek bir oranı, yetişkin popülasyona kıyasla servikal ve tam olarak sınıflandırılır 1,2. Memeli türleri arasında bir ayırt edici özellik, yenidoğanların SCI'den yetişkinlerden önemli ölçüde daha iyi iyileşmesidir ve bu, genç popülasyonlarda iyileşme için itici mekanizmaları değerlendirmek için bir fırsat sunar 3,4,5. Buna rağmen, kısmen genç hayvanların çok daha sıkı anatomik yer işaretlerinde seçilmiş nöron popülasyonlarını doğru bir şekilde hedeflemenin zorluğu nedeniyle, yenidoğan ve bebek kemirgen araştırmalarını ele alan daha az multimodal çalışma vardır6. Bu makalede, Cre-dependent-DREADD'lerin uygulanması ile majör motor yollarını modüle etmek için sıçan omuriliğine yüksek verimli anterograd ve retrograd adeno ilişkili vektörlerin doğrudan enjeksiyonu üzerinde durulmakta ve multimodal rejenerasyon çalışmalarının kapsamı genişletilmektedir.
Viral vektörler, hedef genlerin yerini almak, büyüme proteinlerini yukarı düzenlemek ve CNS 7,8,9'un anatomik manzarasını izlemek için genetik materyalin tanıtılması da dahil olmak üzere geniş bir uygulama alanına sahip önemli biyolojik araçlardır. Spinal motor yolakların anatomik detaylarının birçoğu klasik izleyiciler, yani biyotinile dekstran amin kullanılarak incelenmiştir. Geleneksel izleyiciler nöroanatominin ortaya çıkarılmasında etkili olsa da, dezavantajları yoktur: doğru enjekte edilseler bile yolları ayrım gözetmeksizin etiketlerler ve çalışmalar hasarlı aksonlar tarafından alındıklarını bulmuşlardır10,11,12. Sonuç olarak, bu, kopmuş aksonların liflerin yenilenmesiyle karıştırılabileceği rejenerasyon çalışmalarında yanlış yorumlara yol açabilir.
Aşağıdaki yöntem, modülasyon çalışmalarında son zamanlarda popüler hale gelen iki viral vektör sistemini, aynı nöronun iki ayrı alanında iki farklı viral vektör ile 13,14'ü kullanmaktadır. Birincisi, projeksiyon nöronlarının hücre gövdelerini lokal olarak enfekte eden bir vektördür. Diğeri ise projeksiyon nöronlarının akson terminallerinden taşınan retrograd bir vektördür (Şekil 1). Retrograd vektör Cre rekombinazını taşır ve yerel vektör, bir floresan proteinin (mCherry) kodlandığı "Cre-On" çift flokslu diziyi içerir. Hem hM3Dq hem de mCherry'yi ifade eden doğal transgen, promotöre göre ters çevrilir ve iki LoxP bölgesi ile çevrilidir (Şekil 2). Bu nedenle, mCherry sadece Cre rekombinazının LoxP bölgeleri arasında bir rekombinasyon olayını indüklediği, transgenin oryantasyonunu uygun okuma çerçevesine çevirdiği ve hem DREADD hem de floresan proteininin ekspresyonuna izin verdiği çift dönüşümlü projeksiyon nöronlarında ifade edilir. Viral transgen doğru yönde olduğunda ve uygulanabilir olduğunda, DREADD'ler ayrı ayrı enjekte edilen bir ligand, yani klozapin-N-oksit yoluyla geçici olarak nöromodülasyonu indükleyebilir. Protokol, yenidoğanlarda indüklenebilir nöromodülasyon araştırmalarını doğrulamak için tasarlanmıştır, burada CST'leri seçici olarak modüle etmek için DREADDS enjekte edilir. İki viral sistem, enjeksiyonları doğrulamak için her DREADD-pozitif hücrenin floresan altında yüksek doğrulukla izlenebilir olmasını sağlayan bir sigorta poliçesi görevi görür.
Bu yöntem aynı zamanda yenidoğan araştırmalarındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Pediatrik SCI zorluklarını ortaya koymaktadır ve rejenerasyon, filizlenme veya plastisiteyi analiz eden araştırmalar, yenidoğanlar ve yetişkinler arasındaki farkları vurgulamalıdır 3,15,16,17. Cerrahi prosedürü optimize ederek ve Nissl boyama ile önceki anatomik çalışmalar yapılarak, hem kraniyal hem de spinal enjeksiyonların koordinatları doğrulandı. Amaç, artan sadakat ve hayatta kalma kabiliyeti ile yenidoğan bir sıçana ikili enjeksiyon için bir yöntem sağlamaktı.
Mevcut model için, anterograd vektör, referans18,19 olarak bregma kullanılarak somatomotor korteksin hücre gövdelerine enjekte edildi. Spinal enjeksiyonlar açısından, retrograd vektör, CST akson terminallerinin20,21 bulunduğu lamina V-VII'ye enjekte edildi. Bazı lezyon modellerinin genç hayvanları nasıl farklı şekilde etkilediğinin ve sonraki iyileşmenin yaşlı bir hayvandan nasıl ayrıldığının altında yatan birçok temel soru vardır. Bu çalışma, yenidoğan kemirgenlerinde servikal yaralanmaları ve ön ayak fonksiyonunun geri kazanılabilirliğini incelemek için sağlam bir araç olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, önceki çalışmaların çoğu, lomber veya torasik yaralanmaları takiben iyileşme lokomotifini ele almıştır 5,22,23,24. Çift viral vektörü burada açıklanan yeni enjeksiyon tekniği ile eşleştirerek, bu protokol yenidoğan kemirgen araştırmalarını rahatsız edebilecek belirli sorunları (yani hayatta kalabilirlik) hafifletmeye yardımcı olur. Bu yöntem sağlam, pratik ve çok yönlüdür: teknikteki küçük değişiklikler, farklı yolakların, yani ventral CST, dorsal CST ve yükselen dorsal yolların hedeflenmesine izin verecektir.
Bu sistem için, lokal olarak etkili bir virüs (örneğin, AAV2), ilgilenilen nöronal hücre cisimlerinin bölgesine enjekte edilir. Yerel virüsün ekspresyonunu kontrol eden ikinci bir retrograd taşınan virüs, bu nöronal popülasyon için akson terminallerine enjekte edilir. Böylece, tanım gereği, sadece kortikospinal nöronlar etiketlenir. RetroAAV-Cre virüsü, yapısal olarak aktif bir CMV promotörü ile seçildi, çünkü mekik plazmid, çeşitli hücre tiplerinde Cre'ye bağımlı ekspresyon için birkaç AAV serotipi üretmek için kullanıldı. Kortikal enjeksiyonlar için, AAV2, nöronlara herhangi bir ifadeyi sınırlamak için sinapsin-1 promotor tarafından tahrik edilen transgen ile seçildi. 2-viral sistem, ilgilenilen nöronal popülasyonun kökenine ve sona ermesine daha fazla dayandığından, ilgilenilen nöronal popülasyon içindeki ilgi genlerinin ekspresyonunu yönlendirebilirlerse, birkaç farklı destekleyiciler kullanılabilir. Örneğin, uyarıcı nöronal promotör CamKII, sinapsin-1 ile değiştirilebilir. Bu AAV serotiplerinin kullanımına ek olarak, olgunlaşmamış ve çok daha az ölçüde retrograd transport, yetişkin kortikospinal motor nöronları da yüksek retrograd taşınabilir lentivirüs (HiRet) kullanılarak elde edilebilir25. HiRet lentivirüsleri, retrograd taşıma için sinapstaki alımı hedeflemek için kimerik Kuduz / VSV glikoproteini kullanır. Bir Tet-On promotörü ile birleştirilen bu 2-viral sistem, geriye dönük bağımlı bir şekilde indüklenebilir ekspresyonu destekler26,27.
Retrograd virüsler, bir hedef nöronun sinaptik boşluğuna vektörler yerleştirir ve bu hücrenin aksonu tarafından alınmasına ve hücre gövdesine taşınmasına izin verir. Lentiviral vektörler daha önce gen terapisi çalışmalarında uzun vadeli ekspresyon sağlayan muazzam bir başarıya sahip olsalar da, bu yöntem birkaç basit nedenden dolayı adeno ilişkili viral vektörlere yönelmiştir26,28: AAV daha ekonomiktir, benzer şekilde etkilidir ve daha düşük bir biyogüvenlik seviyesi tanımına sahip olduğu göz önüne alındığında daha az lojistik yük sunar 29,30,31,32 . En çok kullanılan serotip olan AAV2, CST aksonlarının sağlam transfeksiyonunu gösterirken, gelecekteki araştırmacılar, AAV1'in transinaptik olarak etiketlenirken çok yönlülük sunduğunu ve böylece gelecekteki çalışmalarda birkaç olası yineleme ortaya koyduğunu not edebilir33. Son adaptasyon, retrograd virüsü Cre-rekombinaz ile kodlamaktır, böylece birden fazla anterograd vektör aynı anda tanıtılabilir, böylece gereksiz kurum içi virüs atıklarını azaltır ve DRED'lerin doğru yönde ifade etme olasılığını en üst düzeye çıkarır.
Nihayetinde, bu protokol korteks ve servikal omurgaya eşzamanlı enjeksiyonu gösterir, özellikle sırasıyla hücre gövdelerini ve kortikospinal sistemin akson terminallerini hedef alır. Yüksek doğrulukta transfeksiyon serebral korteks ve omurilikte görülür. Tarif edilen protokol 5 günlük Sprague Dawley sıçanları için mükemmelleştirilmiş olsa da, anestezi ve stereotaktik koordinatlarda küçük ayarlamalarla doğum sonrası günler 4-10 için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic SC injection and fluid bolus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>771-683G</td>
			<td>For skin closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaset)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td>To hold the neonatal sterotaxic holder in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lab Standard with Mouse &#38; Neonates Adaptor</td>
			<td>51615</td>
			<td>For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scCre</td>
			<td>Wu lab&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cre plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)</td>
			<td>Bryan Roth&#8217;s lab through Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DREADD plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid bandage</td>
			<td>NewSkin</td>
			<td>985838</td>
			<td>To apply along sutures following surgery and encourage wound healing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cage Lamp</td>
			<td>ZooMed</td>
			<td>LF10EC</td>
			<td>To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting the corticospinal tract in neonatal rats with a double-viral vector using combined brain and spine surgery

Yenidoğan sıçanları üzerindeki araştırmaları kısıtlayan engellerin başarılı bir şekilde ele alınması, pediatrik omurilik yaralanmalarında (SCI'ler) yetişkin SCI'lere kıyasla görülen sonuçlardaki farklılıkları incelemek için önemlidir. Ek olarak, merkezi sinir sisteminin (CNS) hedef hücrelerine tedavileri güvenilir bir şekilde sokmak zor olabilir ve yanlışlıklar çalışmanın veya terapinin etkinliğini tehlikeye atabilir. Bu protokol, viral vektör teknolojisini yeni bir cerrahi teknikle birleştirerek gen terapilerini doğum sonrası 5. günde yenidoğan sıçanlarına doğru bir şekilde tanıtmaktadır. Burada, Cre'nin retrograd taşınması (retroAAV2) için tasarlanmış bir virüs, omurilikteki kortikospinal nöronların akson terminallerinde tanıtılır ve daha sonra hücre gövdelerine taşınır. Sadece tasarımcı ilaç (lar) (DREADD) virüsü tarafından aktive edilen çift flokslu ters oryantasyon (DIO) tasarımcı reseptörü daha sonra beynin somatomotor korteksine enjekte edilir. Bu çift enfeksiyon tekniği, DREADD'lerin ekspresyonunu sadece birlikte enfekte olmuş kortikospinal sistem (CST) nöronlarında teşvik eder. Bu nedenle, somatomotor korteks ve servikal CST terminallerinin eşzamanlı olarak birlikte enjeksiyonu, yenidoğan sıçanlarında servikal SCI modellerini takiben iyileşmenin kemogenetik modülasyonunu incelemek için geçerli bir yöntemdir.

Viral vektörün başarılı bir şekilde enjekte edilmesi ve taşınması, omurilik ve motor korteksteki tek taraflı nöronların transdüksiyonu ile sonuçlanmalıdır. Şekil 4 , bir beyin koronal bölümünün motor korteksindeki katman V CST nöronlarının, Cre-bağımlı-DREADD'leri-mCherry'yi rCre'nin kontralateral omurga enjeksiyonu ile birlikte enjekte ettiğini göstermektedir. Kesitler dsRed antikoru ile boyandı.
<img...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery at JoVE.com

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Bu protokol, doğum sonrası yaşlarda yenidoğan sıçanlarda hücrelerin alt popülasyonlarına somatomotor kortekse anterograd kemogenetik modifiye edici ve servikal omuriliğe retrograd taşınabilir bir Cre rekombinaz enjekte ederek gen terapileri uygulamak için yeni bir yöntem göstermektedir.

Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Bu, yenidoğan sıçanlarda kortikospinal sistemin başarılı bir şekilde birlikte enfeksiyonunu gösteren ilk protokoldür. Genç memelilerdeki hücrelerin bireysel alt popülasyonlarının omurilik yaralanmasından iyileşmeye nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için doğru bir plan sağlar. Diğer çift viral vektör teknikleri gibi, bu yöntem de kullanıcının nöronların spesifik alt popülasyonlarını doğru bir şekilde dönüştürmesine izin verir ve araştırmacıların iyileşmeyi teşvik etmede çeşitli kemogenetik tekniklerin etkinliğini belirlemelerine olanak tanır.Bu tekniğe aşina olmayan araştırmacıların uygun omurga anatomisini bulmakta zorlanmalarını bekleriz. Bu nedenle, vertebral segmentleri sık sık saymanızı ve her zaman yer işaretlerinize geri dönmenizi öneririz. Yenidoğan bir Sprague Dawley yavrusunda anestezi derinliğini doğruladıktan sonra, kafa derisinin üstündeki orta çizgideki forsepslere basarak, sagital sütür için hissederek insizyonun yapılacağı alanı tanımlayın.Temiz, düz ve hassas bir kesi sağlamak için cildi gergin tutarak, I çizgisinin hemen üstünden başlayarak sagital sütür düzlemi boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, forsepsleri kafatasının yüzeyi boyunca nazikçe inceleyerek, dikiş çizgilerine ve parietal ve frontal kemikler boyunca uzanan forsepslerin neden olduğu bir girintiye dikkat ederek bregmayı tanımlayın. İlgilenilen tarafa ağırlıklı kancalar uygulayarak açıklığı koruyun.Daha fazla doğruluk için bregmanın maruziyetini en üst düzeye çıkarmak için pamuk uçları ve mikro makasların bir kombinasyonunu kullanarak aponevrozu temizleyin. Koronal sütürün, sonraki enjeksiyonlar için kaba bir şablon sağlamak için yanal olarak yeterince net bir şekilde göründüğünden emin olun. Mikro makası kullanarak, bregmanın hemen bitişiğindeki sol frontal kafatası kemiğinin yaklaşık üç x iki milimetrelik bir bölümünü kesin.Herhangi bir döküntüyü, beyin omurilik sıvısını ve kanı pamuk uçlarıyla temizleyin. Virüsü enjekte etmek için, iğneyi yerine yerleştirin ve enjektörü dakikada 250 nanolitre oranında bir mikrolitre enjekte edecek şekilde programlayın. Enjeksiyonun tamamlanmasının ardından, iğnenin kortekste üç dakika dinlenmesine izin verin.Enjeksiyonları, bregma ile ilişkili olarak korteks boyunca toplam üç enjeksiyon için diğer koordinatlarda tekrarlayın, hepsi 0.6 milimetre derinlikte. Enjeksiyonları tamamladıktan sonra, kafa derisini dikin ve servikal laminektomi için hayvanı diğer ameliyat masasına aktarın. Kesi bölgesini tanımlamak için parmaklarınızı kullanarak kafatasının tabanını palpe edin.Başparmak ve işaret parmağı ile gerginlik uygulayarak cildi gergin tutun. 11 numaralı bir bıçak kullanarak, kafatası tabanının bir ila iki milimetre gerisindeki orta çizgide insizyona başlayın ve yüzeysel kası ortaya çıkarmak için insizyonu bir santimetre posterior uzatın. Bıçağın keskin noktasını kullanarak, omurilik boşluğunu ve derin omurilik kaslarını açığa çıkarmak için yüzeysel kasın orta çizgisi boyunca yavaşça bir dizi kesik yapın.Daha sonra kası açmak ve cerrahi pencereyi görselleştirmek için bir çift forseps kullanın. Derin omurga kasları açığa çıktıktan sonra, cerrahi pencereye retraktörler yerleştirin ve cerrahi pencereyi yedi ila sekiz milimetre genişliğe geri çekerek omurganın engelsiz bir görünümünü sağlayın. İkinci servikal omurları, dorsal olarak yansıyan ve büyük bir kubbe şeklindeki kası kapsülleyen belirgin dikenli süreci ile tanımlayın.Bir kemik kazıyıcının düz kenarını kullanarak, C3'ü C7 omurlarına maruz bırakmak için derin omurilik kasını yanlara yavaşça kazıyın. Medial başlayın ve vertebral laminaların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlamak için vertebra laminalarına paralel yönde lateral olarak kazıyın. Herhangi bir kanamayı pamuk uçlarıyla kontrol edin.Vertebral seviyeleri sayarken C2'yi bir kılavuz olarak kullanarak, bir çift mikro makas kullanarak C6 ve C7'deki kıkırdaklı laminaların yanal kenarlarını dikkatlice kesin. Bir çift ince forseps kullanarak, omuriliği açığa çıkarmak için laminanın disseke edilmiş kısmını dikkatlice çıkarın ve spinal pencerenin istenen enjeksiyon bölgesini barındıracak kadar büyük olmasını sağlayın. Hayvanı stereotaksik kafatası tutucusuna yerleştirin ve arka çeyreklerini yükseltmek için hayvanın gövdesinin altına yuvarlanmış bir gazlı bez parçası yerleştirin.Enjeksiyonlara başlamadan önce, omuriliğe hakaret etmemeye dikkat ederek, bölgeye pamuk uçları ve Sugi üçgenleri uygulayarak herhangi bir kan veya beyin omurilik sıvısının omurga penceresini temizleyin. Ayrıca, enjeksiyon bölgesinin sürekli kanama veya BOS sızıntısı ile tıkanmasını önlemek için omurga penceresinin yan kısımlarına küçük bir emilebilir pamuk parçası yerleştirerek pencerenin çevresi etrafında bir bariyer oluşturun. Omuriliğe doğrudan enjeksiyonlar için, omurilik arterini tanımlayarak omuriliğin orta hattına yaklaşmak için cam enjeksiyon iğnesinin ucunu kullanın.Ardından, iğneyi yaklaşık orta çizgideki C5 laminanın hemen arkasına yerleştirin ve bunu referans noktası olarak kullanın. Daha sonra, mikro manipülatörü kullanarak, iğneyi yanal olarak sağa 0,3 milimetre hareket ettirin ve omuriliğin yüzeyine dokunana kadar iğneyi indirin. Bu derinlikten iğneyi batırın.Omuriliğe 0,6 milimetre. Cre rekombinaz genini dakikada 250 nanolitrede taşıyan retro adeno ile ilişkili virüsün bir mikrolitresini enjekte edin. Ardından, iğneyi yavaşça geri çekmeden önce virüsün omuriliğe yayılması için iki dakika bekleyin.Bir beyin koronal bölümünün motor korteksindeki beşinci katman kortikospinal sistem nöronlarının, retro Cre'nin kontralateral omurga enjeksiyonu ile birlikte enjekte edilen Cre'ye bağımlı DREADD'leri mCherry'yi eksprese eden etiketlemesi burada gösterilmiştir. Belirli nöronal popülasyonları hedefleyebilmek, iyileşmeyi yönlendiren nüansları tanımlamaya yardımcı olacak ve gelişmekte olan sinir sisteminde altta yatan omurilik yaralanmasının tedavisi için daha fazla doğruluk sağlayacaktır. Bu yöntem, uyarıcı DREADD'lerin genç sıçanlarda omurilik yaralanmasını tedavi etmek için bir araç olarak kullanılmasının uygulanabilirliğini araştırmamızın yolunu açtı.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

Nöroplastisite uyaran Tedaviler Değerlendirme Sıçanlarda Kortikospinal Yolu Tek Taraflı Pyramidotomy

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Yeni Bir Yöntemi Kullanarak Serbest Dolaşan Yenidoğan Sıçanlarında EEG Kaydı

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Sıçanların Hipokampuslarında İleri Difüzyon Görüntüleme

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

İnmeden Sonraki Bir Hafta İçinde Kortikospinal Yol'un Fonksiyonel Durumunun Belirlenmesi

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...