Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

نشكر المراجعين على التعليقات والاقتراحات المفيدة. نشكر ألين ساكستون وبراندون هندرسون وجايد ستير على المساعدة التقنية المتميزة. نشكر براين كرايمر وريبيكا كو على المساعدة في تطوير هذه المقايسات. هذه المواد هي نتيجة للعمل المدعوم بالموارد واستخدام المرافق في نظام الرعاية الصحية VA Puget Sound. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وزارة شؤون المحاربين القدامى (VA) خدمة البحوث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية [منحة مراجعة الجدارة #I01BX004044 إلى N.F.L.]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما أي إفصاحات.

الحركة الشعاعية: يتم التحكم بسهولة في دقة هذا المقايسة عن طريق تغيير متغير الوقت. زيادة طول الوقت يجعل من الأسهل لمراقبة الاختلافات بين الحيوانات مع الأنماط الظاهرية الشديدة، وبالتالي تحديد الاختلافات الدقيقة. ومع ذلك ، لأن هذا المقايسة يقيس الإزاحة ، إذا تم تمديد وقت الفحص لفترة طويلة جدا ، فإن الحيوانات ذات الحركة العادية ، مثل N2 ، ستسافر إلى حواف اللوحة ، وسيؤدي سلوك الأعلاف إلى التراجع. وهذا من شأنه أن يقلل بشكل مصطنع قياس المسافة المقطوعة. قد تؤدي الفترات الزمنية الطويلة جدا إلى اختفاء الاختلافات بين السلالات ، خاصة بين الحيوانات ذات الأنماط الظاهرية الحركية الأقل حدة ، حيث تصبح الحيوانات مشتتة بالتساوي عبر اللوحة. تقصير متغير الوقت سيمنع الديدان الأكثر نشاطا من العثور على حواف اللوحة. لا تتبع هذه الطريقة المسافة الإجمالية المقطوعة لكل دودة ولكنها تضغط المسافة المقطوعة لكل دودة إلى مسافة خطية من وسط اللوحة. على هذا النحو ، فهي بطبيعتها أقل قوة من الطريقة التي تسجل طول المسار الإجمالي للديدان الفردية. ومع ذلك، يتطلب فحص الحركة الشعاعية القليل جدا من تدريب الباحثين، ويستخدم الكواشف بأسعار معقولة نسبيا التي تتوفر عادة في معظم مختبرات الديدان، وحساسة بما يكفي لتحقيق نتائج كبيرة وقابلة للاستنساخ. بالنسبة للمختبرات التي تفضل تتبع الفيديو الآلي، تم إنشاء العديد من الطرق مسبقا لتتبع وتحليل حركات الزحف12، أو يمكن تغيير معلمات البرامج المستخدمة في فحص السباحة في هذه الورقة للسماح بالكشف عن الزحف وتحليله.
وعادة ما تتم هذه التجربة في تكرارات مستقلة ثلاثية، مع مجموعة من 30-40 دودة لكل تكرار. يتم تقسيم كل تكرار على اثنين من لوحات مختلفة 100 ملم أو 150 ملم، مع 15-20 الديدان لكل لوحة. استخدام الديدان أكثر من الموصى بها لكل لوحة يمكن أن تجعل من الصعب تسجيل كفاءة. عدد إجمالي سجل من 90 + هو مدعوم بما فيه الكفاية لتحديد أهمية خفيفة، معتدلة، أو شديدة ضعف الحركة. أن تكون متسقة مع التوقيت بين السلالات المسجلة أمر ضروري للدقة والتكرار. 30 دقيقة عموما طويلة بما يكفي لتحديد الاختلافات بين الأنماط الظاهرية المعتدلة إلى الشديدة مثل السلالات المعدلة وراثيا التعبير عن TDP-43 متحولة الإنسان مقارنة مع الديدان البرية من نوع (الشكل 4). إذا تم تمديد متغير الوقت، فمن المستحسن أيضا زيادة حجم اللوحة من 100 ملم إلى 150 ملم. يمكن أن تؤثر العوامل البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة على هذا المقايسة ، التي تتم عادة في درجة حرارة الغرفة المحيطة ، لذلك من المهم استخدام عنصر تحكم من النوع البري (N2) دائما عند المقارنة عبر التكرارات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا المقايسة قياس حركية بعض السلالات التي لا تظهر سلوك السباحة العادي في السائل (سحق)، مما يجعلها تكملة مفيدة لمقايسة السباحة.
فحص السباحة: استخدام نظام التصوير والاستحواذ لأتمتة تتبع وتحليل السباحة دودة يسمح لبيانات صارمة وغير متحيزة. ومع ذلك، هناك عدة عوامل أثناء الإعداد الأولي للتجربة التي تحتاج إلى التحكم بين العينات. وتشمل هذه الوقت للتأقلم مع السائل قبل بدء التسجيل، والظروف المحيطة (أي درجة الحرارة والرطوبة)، وإعدادات الإضاءة والتسجيل المتسقة. على مرحلة التسجيل، هناك العديد من الميزات التي تساعد على تقليل التباين بين اللوحات. وتشمل هذه الكاميرا المتكاملة التي شنت على المسار ومرحلة مشرق الميدان الذي يجعل تسجيل الفيديو متسقة بين لوحات، والتدريع حول المرحلة التي تمنع الانعكاسات، ووهج، وحركات الهواء أثناء التسجيل، وحزمة برامج قوية أن يكشف موثوق الديدان ويسمح لتصحيح يدوي للمسارات في مرحلة ما بعد المعالجة الفيديو. في هذا البروتوكول، يتم تسجيل مقاطع فيديو للوحة 35 مم مع الديدان لمدة دقيقة واحدة ثم معالجتها باستخدام حزمة البرامج. بعد المعالجة، يضمن التصحيح اليدوي للمسارات تسجيل سلوكيات الفيروس المتنقل بدقة دون الخلط بين أخطاء التتبع. يتم استخدام بيانات العد وتتبع المدة لتحديد المنعطفات في الدقيقة كمقروءة نهائية. ولضمان إمكانية إعادة الإنتاج، يتم جمع البيانات على مدى ما لا يقل عن 3 تجارب تكرار مستقلة، سجل كل منها 40-50 حيوانا، لتحقيق العدد النهائي المشترك للحيوانات 120-150. هذا العدد يكفي للتمييز بين الاختلافات الصغيرة في سلوك السباحة من الديدان السيطرة. بعض الديدان لديها عجز في المحركات شديدة جدا بحيث لا يمكن التقاطها من قبل المقايسات السباحة. على سبيل المثال، إذا وضعت الحيوانات في حليقة متوسطة سائلة بدلا من تنفيذ الاستجابة المتوقعة للسحق، فإن هذا الفحص لن يسجل تلك الحركات بدقة، وقد يلتقط فحص حركة آخر، مثل الحركة الشعاعية، تلك العيوب الحركية بشكل أفضل. يستخدم البروتوكول المقدم نظام تصوير متاح تجاريا (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)، ولكن قد توفر أنظمة تتبع الديدان الأخرى أداة مماثلة، وبعضها مفتوح المصدر12. تصف الأساليب المنشورة سابقا التسجيل اليدوي لدودة thrashing13. في حين أن التحليل الآلي ينتج عددا من المقاييس لكل دودة على حدة ، والكشف عن الانحناءات الجسم الذي يقاس في thrashes في الدقيقة الواحدة ، ويوفر نتائج متسقة بين التجارب والمسارات بشكل جيد مع التهديف التقليدية من الديدان thrashes بالعين.

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو مرض عصبي موهن مرتبط بالشيخوخة له تأثير خاص على الخلايا العصبية الحركية. يتميز المرض بفقدان الخلايا العصبية الحركية في الدماغ والحبل الشوكي وضعف المحرك التدريجي. وهذا يؤدي إلى إعاقة وظيفية كبيرة والوفاة المبكرة، وعادة في غضون 3-5 سنوات بعد التشخيص1. الطفرات في ما لا يقل عن 38 الجينات يمكن أن يسبب ALS; ومع ذلك ، فإن معظم المرضى الذين يعانون من المرض تتراكم إدراجات في كل مكان من البروتين TDP - 43 وعلم الأمراض الأساسي في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية2،3،4. وقد تم تطوير عدد من النماذج الحيوانية لدراسة الآليات الكامنة التي تسبب أو تساهم في المرض في الجسم الحي (استعرضت in5).10 في C. elegans، وتشمل هذه النماذج الطفرات الوراثية فقدان وظيفة في homologs من الجينات المسببة للأمراض القاعدة أو التعبير المعدل وراثيا من الجينات ALS الإنسان. هناك العديد من المزايا لنمذجة ALS في C. elegans. C. elegans هي بسيط قابل للسحب مع نظام عصبي متميز ، ونماذج سلوكية متميزة ، وولوجيا هوولوجيا جينية كبيرة للبشر6،7. توجد العديد من الأدوات للعمل مع C. elegans ، بما في ذلك قدرات تحرير الجينوم القوية ، في المراسلين الفلوريين في الجسم الحي من التنكس العصبي ، ونماذج فحص RNAi ، وعلم الوراثة القابل للسحب ، والمقايسات السلوكية والفينوتينية الراسخة. C. elegans نماذج من ALS تلخيص جوانب من الأمراض البشرية, بما في ذلك تراكم البروتين غير قابل للذوبان, تنكس الأعصاب, والموت المبكر8,9. علاوة على ذلك ، فإن الخلل الحركي الذي يتميز باضطراب في كل من سلوكيات الزحف والسباحة موجود في العديد من طرازات C. elegans ALS.
يصف هذا البروتوكول طريقتين لتوصيف الأنماط الظاهرية الحركية C. elegans : المقايسة الحركية الشعاعية لتقييم الزحف على سطح صلب وتقييم السباحة في السائل (سحق) باستخدام تتبع وورملاب الآلي والتحليل. هذه الأساليب الحساسة لوصف العجز الحركي تسمح بمقارنات الشدة وتوفر أدوات لقياس القمع والتحسينات في الأنماط الظاهرية الحركية. يحدد اختبار الحركة الشعاعية الاختلافات في الحركة الزاحفة (الحركة الجيوب الأنفية على سطح صلب) بين مجموعات الديدان. يستفيد هذا المقايسة من سلوك الاستكشاف الطبيعي غير المحفز C. elegans عن طريق وضع الديدان في موقع واحد على طبق ووضع علامة على موقعها النهائي بعد فترة زمنية معينة10. بدلا من ذلك ، السباحة في السائل (سحق) المقايسات عد الانحناءات الجسم من الديدان الفردية على مدى فترة محددة من الزمن. العد اليدوي للانحناءات الجسم بالعين البشرية هو الوقت المكثف وعادة ما يظهر تباين كبير بين المجربين. ويمكن أن يؤدي استخدام التتبع والتحليل الآلي بمساعدة الحاسوب إلى القضاء على الكثير من هذا التباين. بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لكل من الحركة الشعاعية ومقاايسات السباحة الكشف عن تعديل الأنماط الظاهرية الحركية المتميزة من التدخلات الجينية أو الصغيرة للجزيء. هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans التي تعرض الحركة المتغيرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

يتميز التصلب الجانبي الضموري العصبي (ALS) بفقدان تدريجي للخلايا العصبية الحركية مصحوبا بضعف العضلات وضعف الحركة الذي يزداد سوءا مع مرور الوقت. في حين تم إحراز تقدم كبير في تحديد الدوافع الوراثية لمرض القاعدة في لوس لمجموعة فرعية من المرضى ، فإن غالبية الحالات لديها مسببات غير معروفة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء خلل الخلايا العصبية الحركية وانحطاط ليست مفهومة جيدا. ولذلك، هناك حاجة مستمرة إلى تطوير وتوصيف نماذج تمثيلية لدراسة هذه العمليات. يمكن للكينورفهابيتيز elegans تكييف حركتهم مع القيود المادية لمحيطهم ، مع اثنين من نماذج الحركة الأولية التي تمت دراستها في بيئة مختبرية - الزحف على سطح صلب والسباحة في السائل. هذه تمثل تفاعل معقد بين الإحساس والخلايا العصبية الحركية والعضلات. C. elegans نماذج ALS يمكن أن تظهر ضعف في واحد أو كل من هذه النماذج الحركة. يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة لتقييم الحركة في C. elegans: فحص الحركة الشعاعية الأمثل قياس الزحف على سطح صلب وطريقة آلية لتتبع وتحليل السباحة في السائل (سحق). بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لهذه المقايسات الكشف عن قمع أو تعزيز الأنماط الظاهرية من التدخلات الجينية أو الصغيرة. وهكذا، هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans أن المعارض تغيير الحركة.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة للتمييز بين خفيفة, معتدلة, وضعف الحركة الشديدة في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري, مع فائدة عامة لسلالات C. elegans , مع تغيير الحركة.

تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

بروتوكولنا يقدم اثنين من المقايسات، تحديد حركة C.elegans. تقيم هذه الطرق الأنماط الظاهرية الحركية مثل تلك التي تعرضها نماذج التصلب الجانبي الضموري، أو ALS. إن اختبار الحركة الشعاعية هو طريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة للكشف عن الزحف على سطح صلب.يستخدم اختبار السباحة التتبع القائم على الكمبيوتر للكشف غير المتحيز عن حركات الضرب في السائل. هذه الأساليب مفيدة لتحديد فروق الحركة في C.elegans. على الرغم من أننا ندرس ALS، فإنها يمكن أن تستخدم لأي سلالة مع تغيير الحركة.اقلب لوحات المقايسة NGM رأسا على عقب. وتسمية الجزء السفلي مع معرف لسلالات C.elegans ليتم فحصها. جعل نقطة صغيرة مع علامة في وسط لوحة رأسا على عقب.أثناء العمل مع المجهر تشريح، نقل الديدان إلى وسط لوحة المقايسة. و تعيين جهاز توقيت لمدة 30 دقيقة. ضعي الغطاء مرة أخرى على الطبق وضعيه جانبا.استمر في نقل الديدان حتى تكون جميع السلالات على لوحات الفحص المعينة. بعد 30 دقيقة، ابدأ بتسجيل أول لوحة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجه اللوحة لأسفل تحت المجهر التشريحي. ضبط المجهر التركيز حتى تكون جميع الديدان مرئية من خلال أوجر.باستخدام قلم تلميح ملون مختلف من نقطة الوسط ، ضع نقطة صغيرة في موقع كل دودة. تحقق من حافة لوحة وبعض الديدان قد ينتهي هناك. أيضا، عد وسجل عدد الديدان لم تتحرك من نقطة الوسط.قياس المسافة من نقطة الوسط إلى علامات الموقع النهائي لكل دودة، وتسجيل المسافة باستخدام مسطرة. تم وضع علامة على نقطة الفيروس المتنقل الأولى مع اندفاعة. سجل بيانات الطول لكل نقطة على التوالي عن طريق تدوير اللوحة بطريقة عقارب الساعة.افتح البرنامج المقترن لإعداد وتسجيل مقاطع الفيديو. انقر فوق رمز التقاط الفيديو. اضغط لأسفل على مقبض باهتة وتحويلها في اتجاه عقارب الساعة لضبط الضوء.في نافذة التقاط الفيديو، انقر على علامة التبويب إعدادات وضبط وضع الفيديو إلى 2456x2052_Mono8، معدل الإطار إلى 14، والإخراج أحادية اللون. التعرض من 0.00300 ثانية. كسب إلى 1 ديسيبل.غاما إلى واحد. وتدوير إلى 180. العودة إلى علامة التبويب التقاط، حدد مجلد التسجيل وتعيين اسم ملف عن طريق إدخاله في مربع النص بادئة الملف.تعيين إعدادات التقاط أخرى مثل المخزن المؤقت، إلى 128 إطار ومدة دقيقة واحدة. ضع لوحة المقايسة مضاءة على خشبة مسرح الجهاز وتمركزها في شاشة التقاط الفيديو، ثم قم بإزالة الغطاء. استخدام micropipette لغسل حوالي 50 الديدان في 1 مل من M9 على لوحة المقايسة.دوامة بلطف لوحة لجلب الحيوانات إلى المركز، أو استخدام micropipette لإضافة بضع قطرات من M9 لفصل الحيوانات. تعيين جهاز توقيت لمدة 60 ثانية للسماح للديدان للتأقلم مع السباحة. ضبط مقبض الضوء بحيث يكون العرض مشرقا قدر الإمكان دون التعرض المفرط.اضبط تركيز الكاميرا يدويا عن طريق تحويل حلقة التركيز على جسم العدسة في الكاميرا، أثناء مشاهدة الشاشة. بعد 60 ثانية اضغط على زر التسجيل، حدد الزر الأول في قائمة سير العمل استيراد تسلسل الصورة"والعثور على وانقر نقرا مزدوجا على الفيديو. من قائمة سير العمل حدد تعيين معلومات التسلسل"في إطار القائمة الجديدة تحقق من نظام التسمية، إضافة ملاحظات، والتحقق من صحة بيانات التعريف.حدد ضبط الصورة" وستفتح قائمة منبثقة جديدة تسمى تعديلات الصورة. ضبط إعدادات معالجة الصور عن طريق تعيين تنعيم الخلفية إلى 10، تجانس غاوسي إلى خمسة، ملء الثقوب إلى اثنين، تصفية كائن صغير إلى الصفر، وتخطي تجزئة المشتقة المتكاملة. ضبط مستوى العتبة بحيث تمتلئ الحيوانات تماما مع الأخضر، ولكن لا تزال متميزة عن الخلفية.ثم انقر فوق تطبيق "من قائمة سير العمل، حدد الكشف عن وتتبع"حدد ثلاثة إلى سبعة الديدان وانقر فوق الكشف عن الديدان"زر في علامة التبويب الكشف. الانتقال إلى علامة التبويب تعقب. في معلمات التعقب تحقق استخدام Backtracking"و إلغاء تحديد المسار worms على حافة الصورة.تعيين الفرضية القصوى المتعقبة إلى خمسة. تعيين وضع التتبع إلى السباحة. الانتقال إلى قسم الإعدادات المتقدمة وتعيين الإطارات worms يمكن أن تلمس الحدود إلى 50.يمكن أن تتداخل الديدان الإطارات إلى 500. موقف التسامح إلى 0.50. وشكل التسامح إلى 0.50.احفظ هذه الإعدادات ونشرها لجميع مقاطع الفيديو في تجربة ما عن طريق حفظها كتشكيل. انتقل إلى مدير التكوين في القائمة رمز العلوي الأيمن، وانقر فوق حفظ"أيقونة. إعطاء هذا التكوين اسم ووصف.وانقر فوق موافق "في القائمة سير العمل، انقر فوق حفظ المشروع"تتبع أشرطة الفيديو من خلال الذهاب إلى قائمة سير العمل والنقر على دفعة"أيقونة. انقر فوق الزر إضافة "ضمن قسم تحديد الملف من هذه القائمة معالجة الدفعة. انتقل إلى وحدد كافة ملفات المشروع المراد معالجتها.ثم انقر فوق فتح "انقر فوق الزر ابدأ" ، ولاحظ مؤشر التقدم الأخضر في الملف الأول. السماح بمعالجة كافة الملفات. عند الانتهاء من كافة الملفات المقروءة، أغلق البرنامج.حدد تحليل البيانات"انتقل إلى ملخص المسار. واستخدم زر Export "في أسفل اليمين لتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات قابل للقراءة. استخدم "عدد المنعطفات" و"تعقب المدة" لحساب المنعطفات في الدقيقة لكل مسار باستخدام وظائف أغطية الانتشار.تم قياس التشتت غير المحفز ليرقات L4 التي تم تنظيمها تنمويا من خمس سلالات مختلفة ، باستخدام اختبار الحركة الشعاعية. ورسمت على أنها متر صغير في الدقيقة الواحدة سافر. البيانات المعروضة كرسم بياني شريطي تجعل الاختلافات النسبية بين السلالات أكثر وضوحا.في حين أن الإزاحة النهائية لكل دودة مرسومة داخل الرسم البياني ، تسمح بالتنوع داخل السكان أن يكون أفضل تصورا. تم قياس معدلات السباحة من حيث تردد الضرب أو التموج في السائل ، باستخدام تسجيل وتحليل غير متحيز بمساعدة الكمبيوتر. ورسم بياني كسحق في الدقيقة.تجعل بيانات الرسم البياني الشريطي الاختلافات النسبية بين السلالات أسهل في الرؤية. في حين يتم رسم البيانات من كل دودة الفردية المسجلة داخل الرسم البياني، مما يسمح للتنوع داخل السكان أن يكون تصور أفضل. في المقايسة الحركية الشعاعية، لم تكن سلالة TDP-43 الخفيفة مختلفة بشكل كبير عن سلالة N2 البرية.ومع ذلك ، في مساي السباحة ، لم تكن سلالات TDP-43 الخفيفة والقوية مختلفة بشكل كبير عن N2 البرية ، ولكن أيضا عن بعضها البعض. سلالة TDP-43 المتحولة ALS لديها ضعف الزحف الشديد من قبل حركة شعاعي، وأنها لا سحق في السائل. سلالة تاو التعبير عن ضعف شديد في الحركة الشعاعية، ولكن يمكن أن سحق في المقايسة السباحة.الجانب الأكثر أهمية للنظر مع هذه الأساليب ، هو الحفاظ على ضوابط متسقة بين النسخ المتماثلة. وهذا يضمن أن الاختلافات في الحركة سببها الاختلافات الظاهرية وليس الظروف البيئية. وتوفر هذه الأساليب تقييما شاملا لنموذجين رئيسيين لحركية ال C.elegans.يمكن أن تتضمن طرق المتابعة توصيفا سلوكيا إضافيا أو تحليلا كيميائيا بيولوجيا أو تحقيقا في وظيفة العضلات أو الخلايا العصبية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em&gt; C. ايليجانس</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

تحليل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السباحة السلوك باستخدام CeleST البرمجيات

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

برنامج التشريح الشامل للأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...