Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Vi takker korrekturlæserne for nyttige kommentarer og forslag. Vi takker Aleen Saxton, Brandon Henderson og Jade Stair for fremragende teknisk assistance. Vi takker Brian Kraemer og Rebecca Kow for hjælp til at udvikle disse analyser. Dette materiale er resultatet af arbejde, der understøttes med ressourcer og brug af faciliteter på VA Puget Sound Health Care System. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra USA (USA) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 til N.F.L.]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen oplysninger.

Radial bevægelse: Opløsningen af denne analyse styres let ved at ændre tidsvariablen. At øge længden af tid gør det lettere at observere forskelle mellem dyr med alvorlige fænotyper og derved identificere subtile forskelle. Men fordi denne analyse måler forskydning, hvis analysen tid forlænges for længe, dyr med normal motilitet, såsom N2, vil rejse til kanterne af pladen, og fouragering adfærd vil føre til backtracking. Dette vil kunstigt reducere målingen af tilbagelagt afstand. Tidsperioder, der er for lange, kan resultere i, at forskellene mellem stammer, især mellem dyr med mindre alvorlige motorfænotyper, forsvinder, efterhånden som dyrene bliver jævnt spredt over pladen. Afkortning af tidsvariablen forhindrer mere aktive orme i at finde pladens kanter. Denne metode sporer ikke den samlede tilbagelagte afstand for hver orm, men komprimerer den tilbagelagte afstand for hver orm til en lineær afstand fra midten af pladen. Som sådan er det i sagens natur mindre robust end en metode, der registrerer den samlede sporlængde for individuelle orme. Men, radial bevægelse assay kræver meget lidt forsker uddannelse, bruger relativt overkommelige reagenser, der er almindeligt tilgængelige i de fleste orm labs, og er følsom nok til at producere betydelige og reproducerbare resultater. For laboratorier, der foretrækker automatiseret video tracking, flere metoder er tidligere blevet etableret for at spore og analysere gennemsøgning bevægelser12, eller software parametre, der anvendes til svømning assay i dette papir kan ændres for at tillade crawling afsløring og analyse.
Dette eksperiment er normalt gjort i tredominere uafhængige replikerer, med et sæt af 30-40 orme pr replika. Hver replikation er opdelt på to forskellige 100 mm eller 150 mm plader, med 15-20 orme pr plade. Brug af flere orme end anbefalet pr plade kan gøre det svært at score effektivt. Et samlet antal scorede på 90 + er tilstrækkeligt drevet til at etablere betydning for mild, moderat eller svær motilitet værdiforringelse. At være i overensstemmelse med timingen mellem de scorede stammer er afgørende for nøjagtighed og reproducerbarhed. 30 minutter er generelt lang nok til at fastslå forskelle mellem moderate til alvorlige fænotyper såsom transgene stammer, der udtrykker human mutant TDP-43 i forhold til vilde orme (Figur 4). Hvis tidsvariablen forlænges, er det tilrådeligt også at øge pladens størrelse fra 100 mm til 150 mm. Miljømæssige faktorer såsom temperatur og fugtighed kan påvirke denne analyse, som typisk udføres ved omgivende stuetemperatur, så det er vigtigt altid at bruge en wild-type (N2) kontrol, når man sammenligner på tværs af replikater. Derudover kan denne analyse måle motiliteten af nogle stammer, der ikke udviser normal svømning adfærd i væske (prygl), hvilket gør det til et nyttigt supplement til svømning assay.
Svømning assay: Brugen af billed- og anskaffelsessystemet til at automatisere sporing og analyse af ormsvømning giver mulighed for strenge og upartiske data. Der er dog flere faktorer under den indledende opsætning af eksperimentet, der skal kontrolleres mellem prøverne. Disse omfatter tid til at akklimatificere sig til væske, før du begynder optagelse, omgivende forhold (dvs. temperatur, fugtighed) og konsekvente lys- og optagelsesindstillinger. På optagelsesstadiet er der flere funktioner, der hjælper med at reducere variationen mellem plader. Disse omfatter et integreret spormonteret kamera og lysfeltsstadie, der gør optagelse af video konsistent mellem plader, afskærmning rundt på scenen, der forhindrer refleksioner, blænding og luftbevægelser under optagelse, og en robust softwarepakke, der pålideligt registrerer orme og giver mulighed for manuel korrektion af spor i video efterbehandling. I denne protokol optages videoer af en 35 mm plade med orme i 1 minut og behandles derefter ved hjælp af softwarepakken. Efter behandling sikrer manuel korrektion af spor, at ormadfærd registreres nøjagtigt uden forvirrende sporingsfejl. Slå antal og spor varighedsdata bruges til at bestemme sving pr. minut som en endelig udlæsning. For at sikre reproducerbarhed indsamles data over mindst 3 uafhængige replikeringsforsøg, hver med 40-50 dyr scoret, for at opnå et samlet endeligt antal dyr 120-150. Dette tal er tilstrækkeligt til at diskriminere små forskelle i svømning adfærd fra kontrol orme. Nogle orme har motoriske underskud for alvorlige til at blive fanget af svømning assays. For eksempel, hvis dyrene placeres i en flydende medium krølle i stedet for at udføre den forventede prygl svar, vil denne analyse ikke registrere disse bevægelser præcist og en anden bevægelse assay, såsom radial bevægelse, kan bedre fange disse motilitet fejl. Den angivne protokol bruger et kommercielt tilgængeligt billedsystem (se Materialetabel for at få flere oplysninger), men andre ormsporingssystemer kan give et lignende værktøj, hvor nogle er open source12. Tidligere offentliggjorte metoder beskriver manuel scoring af orm thrashing13. Mens den automatiserede analyse producerer en række målinger for hver enkelt orm, detektering af kroppen bøjninger, som måles i thrashes per minut, giver ensartede resultater mellem eksperimenter og spor godt med konventionelle scoring af orm thrashes af øjet.

Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS) er en invaliderende, aldringsrelateret neurodegenerativ sygdom med en særlig indvirkning på motoriske neuroner. Sygdommen har tab af motoriske neuroner i hjernen og rygmarven og progressiv motorisk svækkelse. Dette resulterer i større funktionelt handicap og for tidlig død, typisk inden for 3-5 år efter diagnose1. Mutationer i mindst 38 gener kan forårsage ALS; De fleste patienter med ALS akkumulerer dog allestedsnærværende indeslutninger af proteinet TDP-43 som deres primære patologi i neuroner og gliaceller2,3,4. Der er udviklet en række dyremodeller til undersøgelse af de underliggende mekanismer, der forårsager eller bidrager til ALS in vivo (revideret i5). I C. elegans omfatter disse modeller genetiske tab-af-funktion mutationer i homolog af ALS-forårsager gener eller transgen udtryk for menneskelige ALS gener. Der er mange fordele ved modellering ALS i C. elegans. C. elegans er et let kantbart dyr med et differentieret nervesystem, velkarakteriseret adfærdsparadigmer og betydelig genetisk hyldest til mennesker6,7. Mange værktøjer findes til at arbejde med C. elegans, herunder robust genom redigering kapaciteter, in vivo fluorescerende reportere af neurodegeneration, RNAi screening paradigmer, tractable genetik, og etablerede adfærdsmæssige og fænotypiske assays. C. elegans modeller af ALS rekapitulere aspekter af menneskers sygdom, herunder ophobning af uopløseligt protein, neurodegeneration, og tidlig død8,9. Desuden, motorisk dysfunktion byder forstyrrelse af både kravle og svømning adfærd er til stede i mange C. elegans ALS modeller.
Denne protokol beskriver to metoder til at karakterisere C. elegans motorfænotyper: radial bevægelse assay til evaluering kravle på en fast overflade og vurdering af svømning i væske (prygl) ved hjælp af WormLab automatiseret sporing og analyse. Disse følsomme metoder til karakterisering af motoriske underskud tillader sammenligninger af sværhedsgrad og tilbyder værktøjer til måling undertrykkelse og forbedringer af motorfænotyper. Den radiale bevægelse assay kvantificerer forskelle i kravle motilitet (sinusformet bevægelse på en solid overflade) blandt populationer af orme. Denne analyse udnytter C. elegans naturlige unstimulerede udforskning adfærd ved at placere orme i et enkelt sted på en plade og markerer deres endelige placering efter en given periode10. Alternativt, svømning i flydende (prygl) assays tælle kroppen bøjninger af de enkelte orme over en bestemt periode. Den manuelle optælling af kroppen bøjer ved det menneskelige øje er tidskrævende og udviser typisk betydelig variation mellem forsøgspersonerne. Brugen af computerassisteret automatiseret sporing og analyse kan eliminere meget af denne variation. Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, både radial bevægelse og svømning assays kan opdage graduering af forskellige locomotoriske fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Disse metoder har nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

Den neurodegenerative sygdom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) har progressivt tab af motoriske neuroner ledsaget af muskelsvaghed og motorisk svækkelse, der forværres med tiden. Mens der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til at bestemme genetiske drivkræfter for ALS for en delmængde af patienter, har de fleste tilfælde en ukendt ætiologi. Endvidere er de mekanismer, der ligger til grund for motor neuron dysfunktion og degeneration ikke godt forstået; derfor er der et vedvarende behov for at udvikle og karakterisere repræsentative modeller for at studere disse processer. Caenorhabditis elegans kan tilpasse deres bevægelse til de fysiske begrænsninger i deres omgivelser, med to primære bevægelse paradigmer undersøgt i et laboratorium miljø-kravle på en fast overflade og svømning i væske. Disse repræsenterer et komplekst samspil mellem sensation, motoriske neuroner og muskler. C. elegans modeller af ALS kan udvise svækkelse i en eller begge af disse bevægelse paradigmer. Denne protokol beskriver to følsomme analyser til evaluering af motilitet i C. elegans: en optimeret radial bevægelsesanalyse, der måler krybe på en fast overflade og en automatiseret metode til sporing og analyse af svømning i væske (prygl). Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, disse analyser kan opdage undertrykkelse eller forbedring af fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Således har disse metoder nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.

Både radial bevægelse og svømning assays tilbyder følsom påvisning af motilitet værdiforringelse (Figur 4 og figur 5). For at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for patologisk TDP-43 i ALS, er der udviklet C. elegans-modeller , der udtrykker vilde eller ALS-mutante mennesker TDP-43 pan-neuronally. Disse dyr udviser molekylære og cellulære egenskaber, der minder om ALS, herunder motorisk dysfunktion9. Vigtigere, de udviser moderat motilitet svækkelse med udtryk for vilde-type menneskelige TDP-43 og mere alvorlige motilitet værdiforringelse hos dyr, der udtrykker ALS-mutant TDP-43 ved hjælp af både radial bevægelse og svømning assays. Nogle mutant eller transgene dyr vil have større svækkelse i crawling end svømning, eller vice versa. Ved hjælp af to forskellige motilitet assays, et klarere billede af fænotypiske forskelle mellem stammer opnås.
Radial bevægelse Når de placeres på en seedet agarplade, udforsker C. elegans deres omgivelser, herunder søger grænserne for deres fødekilde. Radial bevægelse assays er en måde at drage fordel af denne adfærd som en metrik for fysisk kondition. Ved at analysere lokomotorisk adfærd (kravle på en solid overflade) på en kontrolleret og kvantificerbar måde, tilbyder den radiale lokomotoriske analyse et enkelt og effektivt værktøj til vurdering af sværhedsgraden af motoriske underskud og andre motorrelaterede fænotyper. Radiale bevægelsesanalyser registrerer forskelle i motilitet i moderat eller alvorligt svækkede ALS-modelorme og giver en baseline til at sammenligne graduering af motilitetsfænotyper eller ændringer i motilitet med alderen (figur 6). Denne strategi kan anvendes til at kvantificere den gennemsøgningsadfærd, der har ændret bevægelse fra vildtype (N2) eller kontrolorme. Denne metode er dog muligvis ikke et godt valg til at vurdere dyr, der ikke er i stand til at kravle normalt, såsom rullemutanter eller dyr, der er lammede. Typisk vil vilde orme udgøre en gennemsnitlig forskydning mellem 200-300 μm/min, når de hæves og testes ved 20 °C. Eksempeldataene i figur 4 viser forventede resultater, der sammenligner N2, to forskellige transgene stammer, der udtrykker vilde mennesker TDP-43 med en mild fænotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller stærkere fænotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en transgen stamme, der udtrykker mutant human TDP-43 med en alvorlig fænotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]) og en transgen stamme, der udtrykker et andet neurodegenerativt sygdomsrelateret protein, human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De to stammer, der udtrykker vild-type TDP-43 har forskellige grader af svækkelse som detekteret af radial bevægelse. TDP-43 (WT-lav) er ikke væsentligt forskellig fra N2, mens TDP-43 (WT-høj) udviser klare forskelle i motilitet. TDP-43(M337V) og tau (WT) stammer har mere alvorlige funktionsnedsættelser i motilitet.
Svømning assay C. elegans engagere sig i stereotype svømning (prygl) bevægelse, når nedsænket i væske. Umiddelbart efter nedsænkning begynder orme at bøje hoved og hale mod hinanden med en bøjningsvinkel på ca. 45 °, hvor vinkelknudepunktet er midtpunktet af ormen. Orme skiftevis bøjning i ventrale og dorsale retninger. En thrash, målt ved softwaren, repræsenterer bevægelsen af at gå fra lige til en kropsbøjningsvinkel på 20 ° eller derover, uanset retningsbestemthed (vinkeltærskel kan justeres efter behandling inden for analyse- og plotningsvinduet [Workflow | Analyser | Kropsform | Bøjning vinkel | Midtpunkt | Amplitude Threshold: # grader]. Svømning assay beskrevet her bruger automatiseret computer-baseret sporing og analyse til at give upartisk scoring af svømning aktivitet. Det forventes, at vilde orme (N2) i gennemsnit vil være mellem 150-200 thrashes pr. minut, når de hæves og registreres ved 20 °C. Eksempeldataene i figur 5 viser forventede resultater, der sammenligner N2, to forskellige transgene stammer, der udtrykker vilde mennesker TDP-43 med en mild fænotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller stærkere fænotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], og en transgen stamme, der udtrykker et andet neurodegenerativt sygdomsrelateret protein, human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Den transgene stamme, der udtrykker ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] ikke prygl i væske, og det er derfor angivet på grafen som ND (ingen data). Denne analyse kan diskriminere forskellige fænotyper end radial bevægelse assay vist i figur 4. I radial bevægelsesanalysen (figur 4) var TDP-43(WT-lav) f.eks. ikke signifikant forskellig fra N2. Men i svømning assay (Figur 5), både TDP-43 (WT-lav) og TDP-43 (WT-høj) er væsentligt forskellige fra N2, samt væsentligt forskellige fra hinanden. På trods af at både TDP-43(M337V) og tau(WT) har alvorlige gennemsøgningsvanskeligheder ved radial bevægelse (figur 4), er det også kun tau (WT), der er i stand til at thrash nok til at blive sporet af softwaren (Figur 5). TDP-43(M337V) dyr er ude af stand til at thrash, og software-baseret analyse registrerer ikke eller spore disse orme præcist. Således blev data om disse orme ikke indsamlet (ND, ingen data).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg"> Figur 1: Arbejdsprocessen for radial bevægelsesanalyse. Paneler A-E viser de generelle trin i radial bevægelse assay. Trinene er som følger: (A) NGM Plader, med OP50 seedet til kanterne, er udarbejdet ved mærkning og mærkning centrale prik, (B) orme er placeret i midten af agar som markeret af den centrale prik, (C) orme får lov til at bevæge sig frit i en bestemt mængde tid, (D) plade er vendt nedefra og op og den endelige placering af hver orm er markeret i en anden farve end den centrale prik, (E) Afstanden fra den midterste prik til hver sidste ormplacering målt enten manuelt eller digitalt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg"> Figur 2: Digital måling af den endelige placering ved hjælp af ImageJ.  Afstand fra midtermålinger kan måles i hånden eller digitalt for at måle digitalt ved hjælp af ImageJ (A) scan bagsiden af pladen med en lineal i rammen. (B) Tegn en kendt længde ved hjælp af stregværktøjet. (C) Brug den kendte længde, der er trukket i (B), til at indstille skalaen [Analysér | Angiv skala...]. (D) Brug stregværktøjet til at tegne en streg fra midtpunktet til et endeligt placeringsmærke, gentag for hvert mærke. (E) En pensel linje markerer det første mærke målte hjælpemidler i scoring (squiggly sort linje nær 1 mærke). Endelige placeringsmærker er nummereret i gult for at illustrere retningsbestemthed af scoring. (F) Målinger registreres i vinduet Resultater. Gem resultater andre steder til statistisk analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg"> Figur 3: Materialer og hardwarejusteringer til brug af softwaren. (A) Materialer, der anvendes til den softwareassisteret svømmeanalyse. (B) Generel opsætning af softwaren og nødvendige materialer, bemærk, at huset er i hævet position. (C) Linsen montering beslag højde kan justeres. Dette billede viser det justerbare spor og en båndindikator, der markerer den foretrukne højde til udførelse af svømmeanalyser. Det er nødvendigt at justere brightfield lys og kamera fokus før optagelse. (D) En 35 mm analyseplade placeres på scenen, dyr i M9 tilsættes til pladen, og en 1 min timer startes. (E) Det er undertiden fordelagtigt at dreje pladen forsigtigt for at flytte orme tættere på midten - observere placering på live capture skærmen; Alternativt kan et par dråber M9 fra en pipettor bruges til at adskille orme. (F) Juster fokusringen på kameralinsen, observere orme på skærmen for at bestemme optimal fokus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg"> Figur 4: Radial bevægelsesanalyser registrerer forskelle i krybehastighed. Ukonstimuleret spredning af udviklingsstader L4 larver blev målt ved hjælp af radial bevægelse assay beskrevet ovenfor og afbildet som μm/min rejste (A-B). De samme data, der er afbildet i (A) og (B), viser to forskellige mulige grafiske præsentationer. I (A) vises data som en søjlegraf, hvilket gør relative forskelle mellem stammer klarere. I (B) er den endelige forskydning af hver ormplotted inden for grafen, så variationen i befolkningen bedre visualiseres. For at vurdere betydningen blandt testede stammer blev der anvendt envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys multiple comparison-test. **p=0,0022, ****p<0.0001, ns=ikke signifikant. TDP-43(M337V) og tau(WT) er også væsentligt forskellige fra N2, p<0.0001. Fejllinjer i (A) er standardfejl af middelværdien (SEM) og i (B) er standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg"> Figur 5: Svømme assays opdage forskelle i prygl i væske. Hyppigheden af svømning (thrashing eller bølgefrekvens i væske) blev målt ved hjælp af upartisk computerassisteret scoring og analyse beskrevet ovenfor og afbildet som thrashes / min (A-B). De samme data afbildet i (A) og (B). I (A) afbildes data som en søjlegraf, hvilket gør relative forskelle mellem stammer lettere at se. I (B) afbildes data fra hver enkelt orm, der er scoret, i grafen, hvilket gør det muligt at visualisere variationen i populationen bedre. For at vurdere betydningen blandt testede stammer blev der anvendt en envejsanalyse af variansen (ANOVA) med Tukeys multiple comparison-test. s<0.0001, ns=not signifikant. TDP-43(WT-moderat) og tau(WT) er også væsentligt forskellige fra N2, p<0.0001.Fejllinjer i (A) er standardfejl af middelværdien (SEM) og i (B) er standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg"> Figur 6: Mutant TDP-43 orme rejser mindre end vilde orme. Plader, der viser en repræsentativ forskel i den endelige placering af iscenesat L4 N2 (vildtype) og TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en stamme, der udtrykker mutant human TDP-43 med alvorligt nedsat motorisk funktion efter 1 times usografisk kravle ved stuetemperatur. Plader er markeret med en rød prik til midtpunktet og blå prikker til dyrenes endelige placering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: Registrering af svømmeadfærd ved hjælp af billed- og sporingssoftwaren. (A) Sporingsarbejdsgangen og placeringen af videooptagelsesikonet. (B) Vinduet Videooptagelse vises i Live View, og de vigtigste aspekter fremhæves. De grønne "Live view"-ord ændres til en rød "Optagelse", når optageknappen er aktiveret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Forberedelse og sporing af svømmeadfærd. Denne figur viser en række skærmbilleder, der kan hjælpe med at konfigurere en videobilledsekvens til sporing. Den generelle protokol til forberedelse af en videosekvens er at åbne hver arbejdsprocesmenu i denne rækkefølge: Importer billedsekvens | Angiv | Juster | Find og spor | Gem projekt. Vinduet Analyser data kan kun bruges, når en projektfil er sporet. (A) viser en åbnet .avi (video) fil efter import af sekvensen til softwaren inde fra arbejdsprocessen Spor . (B) Vinduet Angiv sekvensoplysninger indeholder et sted til noter, der angiver/ændrer skalaen, og kontrollerer metadataene for en videosekvens. Instruktioner til ændring af skalaen findes i dette vindue og skal følges, når kameraet sænkes eller hæves (B). Billede (C) viser indstillingerne for vinduet Juster billede . (D) Skærmbillede, der viser fanen Registrering i vinduet Find og spor . Detektering af orme bruges til at træne softwaren og skal indstilles for hver videosekvens. Yderligere registreringsparametre kan indstilles her, hvis det ønskes. (E) Skærmbillede af fanen Sporing i vinduet Find og spor med de anbefalede indstillinger for sporing af svømmeadfærd. Dette er det sidste trin i opsætningen af en videosekvens. Gem sekvensen som et projekt ved hjælp af vinduet Gem projekt . Gentag disse trin for hver videosekvens. Indstillinger kan gemmes som en konfiguration for at reducere arbejdsbyrden og sikre, at alle sekvenser behandles ens (ikke vist). Hvis du vil spore projektfiler til analyse, skal du gå til Batcharbejdsgangen . (F) viser det ikon, der bruges til at navigere til batcharbejdsgangen , og (G) viser batchafviklingsvinduet, fremhæver tilføj- og startknapperne og viser det forventede udseende af en projektfil, der er blevet sporet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 3: Analyse af svømmeadfærd. Når en projektfil er blevet sporet, kan den åbnes ved hjælp af [Fil | Åbn projekt]. Orme vises med grønt som vist i (A). Skrubbe gennem videoen tilbyder en hurtig kontrol af, at videoen behandles som forventet, grøn fremhævning vil forsvinde, mens skrubbe. Vinduet Dataanalyse og Afbildning åbnes fra arbejdsgangselementet Analyser data . (B) viser vinduet Dataanalyse og Afbildning med placeringsvisning åbnet (standard), alle spor er fremhævet. Under datapunkterne er et plot, der viser det registrerede spor for hver fremhævet orm. Sporoversigtsanalysen bruges til beregnede sving pr. minut. (C-D) viser sporoversigtsrapporten og eksportdetaljerne. (E-F) viser sporoversigten i et regneark, og hvordan man beregner sving pr. minut, output målt i denne analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Denne protokol beskriver to følsomme assays til kræsning blandt mild, moderat, og svær motorisk svækkelse i C. elegans modeller af amyotrofisk lateral sklerose, med generelle nytte for C. elegans stammer, med ændret motilitet.

Evaluering af motorisk svækkelse i C. elegans Modeller af Amyotrofisk Lateral Sklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Vores protokol præsenterer to analyser, kvantificering C.elegans bevægelse. Disse metoder evaluere motilitet fænotyper som dem udstillet af modeller af amyotrofisk Lateral Sklerose, eller ALS. Radial Locomotion Assay er en omkostningseffektiv og nem metode til at opdage gennemsøgning på en solid overflade.Svømning Assay bruger computer-baseret sporing for upartisk påvisning af prygl bevægelser i væske. Disse metoder er nyttige til kvantificering af bevægelsesforskelle i C.elegans. Selvom vi studerer ALS, kan de bruges til enhver stamme med ændret motilitet.Vend NGM-analysepladerne på hovedet. Og mærke bunden med en identifikator for C.elegans stammer, der skal analyseres. Lav en lille prik med markøren i midten af hovedet plade.Mens du arbejder med en dissekering mikroskop, overføre orme til midten af analysen plade. Og sæt en timer til 30 minutter. Læg låget tilbage på pladen og sæt det til side.Fortsæt med at overføre orme, indtil alle stammer er på de udpegede analyseplader. Efter 30 minutter begynder du at score den første plade ved at fjerne låget og placere pladen med forsiden nedad under dissekeremikroskopet. Juster mikroskopfokus, indtil alle orme er synlige gennem sneglen.Brug en anden farvet filtpen fra midtpunktet, sæt en lille prik på placeringen af hver orm. Kontroller kanten af pladen, da nogle orme kan ende der. Du skal også tælle og registrere, hvor mange orme der ikke blev flyttet fra midtpunktet.Mål afstanden fra midtpunktet til de endelige placeringsmarkeringer for hver orm, og registrer afstanden ved hjælp af en lineal. Det første ormepunkt er markeret med en bindestreg. Optag længdedata for hver prik fortløbende ved at rotere pladen på urets måde.Åbn den tilknyttede software for at konfigurere og optage videoerne. Klik på ikonet for videooptagelse. Tryk ned på lysdæmperknappen, og drej den med uret for at justere lyset.I videooptagelsesvinduet skal du klikke på fanen Indstillinger og justere videotilstanden for at 2456x2052_Mono8, billedhastigheden til 14, output som monokrom. Eksponering på 0,00300 sekunder. Vind til 1 dB.Gamma til en. Og drej til 180. Flyt tilbage til hentningsfanen, marker optagelsesmappen, og tildel et filnavn ved at indtaste det i tekstboksen med filpræfiks.Indstil andre hentningsindstillinger som buffer, til 128 billeder og varighed til et minut. Placer analysepladen oplyst på enhedens scene og centrer den i videooptagelsesskærmen, og fjern derefter låget. Brug en mikropipette til at vaske ca. 50 orme i 1 ml M9 på analysepladen.Hvirvl forsigtigt pladen for at bringe dyrene til centrum, eller brug en mikropipette til at tilføje et par dråber M9 for at adskille dyrene. Indstil en timer til 60 sekunder, så orme kan akklimatere sig til svømning. Juster lysknappen, så displayet er så lyst som muligt uden overeksponering.Juster kameraets fokus manuelt ved at dreje fokusringen på kameraets linsekrop, mens du ser skærmen. Efter 60 sekunder skal du trykke på optageknappen, vælge den første knap i arbejdsprocesmenuen Importer billedsekvens", og find og dobbeltklik på en video. Vælg Angiv sekvensoplysninger"I det nye menuvindue skal du kontrollere navngivningsskemaet, tilføje noter og validere metadata.Vælg Juster billede", og en ny pop op-menu med navnet Billedjusteringer åbnes. Juster indstillingerne for billedbehandling ved at indstille baggrundsudjævningen til 10, Gaussian-udjævning til fem, Fyld huller til to, Lille objektfilter til nul og spring integral derivativesegmentering over. Juster tærskelniveauet, så dyrene er helt fyldt med grønt, men stadig adskilt fra baggrunden.Klik derefter på Anvend "Vælg Find og spor" vælg tre til syv orme i arbejdsprocesmenuen, og klik på knappen Find orme" under fanen Registrering. Gå til sporingsfanen. I sporingsparametrene skal du kontrollere Brug tilbageskridt", og fjern markeringen af Spor orme i kanten af billedet.Indstil den maksimale sporede hypotese til fem. Indstil sporingstilstanden til svømning. Flyt til sektionen avancerede indstillinger, og indstil rammeormene, der kan berøre grænsen til 50.Rammer orme kan overlappe til 500. Placer tolerancen til 0,50. Og form tolerance til 0,50.Gem disse indstillinger, og installer dem til alle videoer i et eksperiment ved at gemme dem som en konfiguration. Gå til konfigurationsstyringen i menuen ikonet øverst til venstre, og klik på ikonet Gem". Giv denne konfiguration et navn og en beskrivelse.Og klik på Okay"Klik på Gem projekt"Spor videoerne i arbejdsprocesmenuen" og klik på ikonet Batch. Klik på knappen Tilføj" under afsnittet filvalg i denne batchbehandlingsmenu. navigere til og vælge alle de projektfiler, der skal behandles.Klik derefter på Åbn "Klik på knappen Start", og noter den grønne statusindikator i den første fil. Tillad, at alle filerne behandles. Når alle de læste filer er færdige, skal du lukke softwaren.Vælg Analyser data"Naviger til sporoversigten. Og brug knappen Eksporter nederst til højre til at eksportere data i et regnearkslæsbart format. Brug Turn Count"og Track Duration" til at beregne sving pr. minut for hvert spor ved hjælp af opslagsarkeringsfunktioner.Unstimuleret spredning af udviklingsstadierede L4 larve af fem forskellige stammer, blev målt ved hjælp af Radial Locomotion Assay. Og afbildet som mikro meter i minuttet rejste. De data, der vises som søjlediagrammer, gør relative forskelle mellem stammer klarere.Mens den endelige forskydning af hver orm afbildet i grafen, gør det muligt variationen i befolkningen at blive bedre visualiseret. Hyppigheden af svømning i form af prygl eller bølgende frekvens i væsken, blev målt ved hjælp af upartisk computer-assisteret scoring og analyse. Og afbildet som thrashes i minuttet.Søjlediagramdataene gør relative forskelle mellem stammer lettere at se. Mens data fra hver enkelt orm scoret er afbildet i grafen, så variationen i befolkningen kan visualiseres bedre. I Radial Locomotion Assay, mild TDP-43 stamme var ikke signifikant anderledes end den vilde type N2 stamme.Men i Svømning Assay, både den milde og stærke TDP-43 stammer var ikke kun væsentligt forskellig fra den vilde type N2, men også fra hinanden. ALS mutant TDP-43 stamme har alvorlige kravle svækkelse af Radial Locomotion, og de ikke thrash i væske. Den tau-udtrykke stamme har alvorlige funktionsnedsættelser i Radial Locomotion, men kan thrash i Svømning Assay.Det vigtigste aspekt at overveje med disse metoder, er at opretholde konsekvent kontrol mellem replikere. Dette sikrer, at variationer i motilitet er forårsaget af fænotypiske forskelle og ikke miljøforhold. Disse metoder giver en omfattende vurdering af to store C.elegans motilitet paradigmer.Opfølgning metoder kan omfatte yderligere adfærdsmæssige karakterisering, biokemisk analyse, eller undersøgelse af muskel eller neuron funktion.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatiseret Kvantificering af Synaptic Fluorescens in<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking og adfærdsmæssige måling

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En Molekylær Udlæsning af Langsigtet olfaktorisk Adaptation in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisering neuroblast cytokinese Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenesen

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo billeddannelse af Dauer-specifik neuronal Remodeling i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automatiseret Analyse af<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Behavior Brug Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Omfattende obduktions program for personer med multipel sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...