Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

We bedanken de recensenten voor nuttige opmerkingen en suggesties. We bedanken Aleen Saxton, Brandon Henderson en Jade Stair voor hun uitstekende technische assistentie. We bedanken Brian Kraemer en Rebecca Kow voor hun hulp bij het ontwikkelen van deze testen. Dit materiaal is het resultaat van werk ondersteund met middelen en het gebruik van faciliteiten bij het VA Puget Sound Health Care System. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Verenigde Staten (VS) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 aan N.F.L.]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen onthullingen hebben.

Radiale voortbeweging: De resolutie van deze test kan eenvoudig worden geregeld door de tijdvariabele te wijzigen. Het verlengen van de tijd maakt het gemakkelijker om verschillen tussen dieren met ernstige fenotypen waar te nemen, waardoor subtiele verschillen worden geïdentificeerd. Omdat deze test echter verplaatsing meet, zullen dieren met normale beweeglijkheid, zoals N2, naar de randen van de plaat reizen als de testtijd te lang wordt verlengd, en foerageergedrag zal leiden tot backtracking. Dit zal de meting van de afgelegde afstand kunstmatig verminderen. Te lange tijdsperioden kunnen leiden tot het verdwijnen van verschillen tussen stammen, met name tussen dieren met minder ernstige motorische fenotypen, omdat dieren gelijkmatig over de plaat worden verspreid. Het verkorten van de tijdvariabele voorkomt dat actievere wormen de randen van de plaat vinden. Deze methode houdt niet de totale afgelegde afstand voor elke worm bij, maar comprimeert de afgelegde afstand voor elke worm in een lineaire afstand van het midden van de plaat. Als zodanig is het inherent minder robuust dan een methode die de totale spoorlengte van individuele wormen registreert. De radiale voortbewegingstest vereist echter zeer weinig training van onderzoekers, gebruikt relatief betaalbare reagentia die algemeen beschikbaar zijn in de meeste wormlaboratoria en is gevoelig genoeg om significante en reproduceerbare resultaten te produceren. Voor laboratoria die de voorkeur geven aan geautomatiseerde videotracking, zijn er eerder verschillende methoden vastgesteld om kruipbewegingen te volgen en te analyseren12, of de softwareparameters die worden gebruikt voor de zwemtest in dit artikel kunnen worden gewijzigd om kruipdetectie en -analyse mogelijk te maken.
Dit experiment wordt meestal uitgevoerd in drievoud onafhankelijke replicaties, met een set van 30-40 wormen per replicatie. Elke replica wordt gesplitst op twee verschillende platen van 100 mm of 150 mm, met 15-20 wormen per plaat. Het gebruik van meer wormen dan aanbevolen per plaat kan het moeilijk maken om efficiënt te scoren. Een totaal aantal gescoorde 90+ is voldoende krachtig om significantie voor milde, matige of ernstige motiliteitsstoornissen vast te stellen. Consistent zijn met de timing tussen de gescoorde stammen is essentieel voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. 30 minuten is over het algemeen lang genoeg om verschillen vast te stellen tussen matige tot ernstige fenotypen zoals transgene stammen die menselijke mutant TDP-43 tot expressie brengen in vergelijking met wildtype wormen (figuur 4). Als de tijdvariabele wordt verlengd, is het raadzaam om ook de grootte van de plaat te vergroten van 100 mm naar 150 mm. Omgevingsfactoren zoals temperatuur en vochtigheid kunnen deze test beïnvloeden, die meestal wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur, dus het is belangrijk om altijd een wild-type (N2) -controle te gebruiken bij het vergelijken van tussen replicaties. Bovendien kan deze test de beweeglijkheid meten van sommige stammen die geen normaal zwemgedrag vertonen in vloeistof (thrashing), waardoor het een nuttige aanvulling is op de zwemtest.
Zwemtest: Het gebruik van het beeldvormings- en acquisitiesysteem om het volgen en analyseren van wormzwemmen te automatiseren, zorgt voor rigoureuze en onbevooroordeelde gegevens. Er zijn echter verschillende factoren tijdens de eerste opzet van het experiment die tussen de monsters moeten worden gecontroleerd. Deze omvatten de tijd om te acclimatiseren aan vloeistof voordat u begint met opnemen, omgevingsomstandigheden (d.w.z. temperatuur, vochtigheid) en consistente licht- en opname-instellingen. Op het opnamepodium zijn er verschillende functies die de variabiliteit tussen platen helpen verminderen. Deze omvatten een geïntegreerde op een spoor gemonteerde camera en een helder veld podium dat het opnemen van video consistent maakt tussen platen, afscherming rond het podium die reflecties, verblinding en luchtbewegingen tijdens het opnemen voorkomt, en een robuust softwarepakket dat betrouwbaar wormen detecteert en handmatige correctie van tracks in video-nabewerking mogelijk maakt. In dit protocol worden video's van een 35 mm plaat met wormen gedurende 1 minuut opgenomen en vervolgens verwerkt met behulp van het softwarepakket. Na verwerking zorgt handmatige correctie van tracks ervoor dat wormgedrag nauwkeurig wordt geregistreerd zonder storende trackingfouten. Gegevens over het aantal beurten en de duur van het spoor worden gebruikt om de bochten per minuut te bepalen als een definitieve uitlezing. Om reproduceerbaarheid te garanderen, worden gegevens verzameld over minimaal 3 onafhankelijke replicatie-experimenten, elk met 40-50 dieren gescoord, om een gecombineerd eindaantal dieren 120-150 te bereiken. Dit aantal is voldoende om kleine verschillen in zwemgedrag te onderscheiden van controlewormen. Sommige wormen hebben motorische tekorten die te ernstig zijn om te worden gevangen door zwemtests. Als de dieren bijvoorbeeld in een krul van een vloeibaar medium worden geplaatst in plaats van de verwachte thrashing-respons uit te voeren, zal deze test die bewegingen niet nauwkeurig registreren en kan een andere bewegingstest, zoals radiale voortbeweging, die motiliteitsdefecten beter vastleggen. Het meegeleverde protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar beeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen voor meer informatie), maar andere wormvolgsystemen kunnen een vergelijkbaar hulpprogramma bieden, waarvan sommige open source zijn12. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven handmatige scoring van wormthrashing13. Hoewel de geautomatiseerde analyse een aantal statistieken voor elke individuele worm produceert, biedt de detectie van lichaamsbuigingen die wordt gemeten in thrashes per minuut, consistente resultaten tussen experimenten en volgt deze goed met conventionele scores van wormen met het oog.

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een slopende, verouderingsgerelateerde neurodegeneratieve ziekte met een bijzondere impact op motorneuronen. De ziekte kenmerkt verlies van motorneuronen in de hersenen en het ruggenmerg en progressieve motorische stoornissen. Dit resulteert in ernstige functionele invaliditeit en vroegtijdig overlijden, meestal binnen 3-5 jaar na diagnose1. Mutaties in minstens 38 genen kunnen ALS veroorzaken; de meeste patiënten met ALS accumuleren echter ubiquitinated inclusies van het eiwit TDP-43 als hun primaire pathologie in neuronen en gliacellen2,3,4. Er zijn een aantal diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen te bestuderen die in vivo ALS veroorzaken of eraan bijdragen (beoordeeld in5). Bij C. elegans omvatten deze modellen genetische functieverliesmutaties in homologen van ALS-veroorzakende genen of transgene expressie van menselijke ALS-genen. Er zijn tal van voordelen aan het modelleren van ALS in C. elegans. C. elegans zijn een handelbaar eenvoudig dier met een gedifferentieerd zenuwstelsel, goed gekarakteriseerde gedragsparadigma's en een aanzienlijke genetische homologie aan de mens6,7. Er bestaan veel hulpmiddelen voor het werken met C. elegans, waaronder robuuste genoombewerkingsmogelijkheden, in vivo fluorescerende verslaggevers van neurodegeneratie, RNAi-screeningsparadigma's, handelbare genetica en gevestigde gedrags- en fenotypische assays. C. elegans-modellen van ALS recapituleren aspecten van menselijke ziekten, waaronder accumulatie van onoplosbaar eiwit, neurodegeneratie en vroege dood8,9. Verder is motorische disfunctie met verstoring van zowel kruip- als zwemgedrag aanwezig in veel C. elegans ALS-modellen.
Dit protocol beschrijft twee methoden om C. elegans motorfenotypes te karakteriseren: de radiale voortbewegingstest voor het evalueren van kruipen op een vast oppervlak en de beoordeling van zwemmen in vloeistof (thrashing) met behulp van de WormLab geautomatiseerde tracking en analyse. Deze gevoelige methoden voor het karakteriseren van motorische tekorten maken vergelijkingen van de ernst mogelijk en bieden hulpmiddelen voor het meten van onderdrukking en verbeteringen van motorische fenotypen. De radiale voortbewegingstest kwantificeert verschillen in kruipmotiliteit (sinusoïdale beweging op een vast oppervlak) tussen populaties van wormen. Deze test maakt gebruik van C. elegans natuurlijke ongestimuleerde exploratiegedrag door wormen op een enkele locatie op een plaat te plaatsen en hun uiteindelijke locatie na een bepaalde periode te markeren10. Als alternatief, zwemmen in vloeibare (thrashing) assays tellen lichaamsbuigingen van individuele wormen over een bepaalde periode van tijd. Het handmatig tellen van lichaamsbuigingen door het menselijk oog is tijdsintensief en vertoont doorgaans een aanzienlijke variabiliteit tussen experimentatoren. Het gebruik van computerondersteunde geautomatiseerde tracking en analyse kan veel van die variabiliteit elimineren. Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen zowel radiale voortbewegings- als zwemtests modulatie van verschillende locomotorische fenotypen detecteren uit genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die een veranderde beweeglijkheid vertoont.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

De neurodegeneratieve ziekte amyotrofische laterale sclerose (ALS) kenmerkt progressief verlies van motorneuronen vergezeld van spierzwakte en motorische stoornissen die met de tijd verergeren. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van genetische drivers van ALS voor een subgroep van patiënten, hebben de meeste gevallen een onbekende etiologie. Verder zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorneurondisfunctie en degeneratie niet goed begrepen; daarom is er een voortdurende behoefte om representatieve modellen te ontwikkelen en te karakteriseren om deze processen te bestuderen. Caenorhabditis elegans kunnen hun beweging aanpassen aan de fysieke beperkingen van hun omgeving, met twee primaire bewegingsparadigma's bestudeerd in een laboratoriumomgeving: kruipen op een vast oppervlak en zwemmen in vloeistof. Deze vertegenwoordigen een complex samenspel tussen sensatie, motorneuronen en spieren. C. elegans modellen van ALS kunnen een beperking vertonen in een of beide van deze bewegingsparadigma's. Dit protocol beschrijft twee gevoelige assays voor het evalueren van de beweeglijkheid in C. elegans: een geoptimaliseerde radiale voortbewegingstest die het kruipen op een vast oppervlak meet en een geautomatiseerde methode voor het volgen en analyseren van zwemmen in vloeistof (thrashing). Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen deze testen onderdrukking of verbetering van de fenotypes detecteren door genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben dus nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die veranderde beweeglijkheid vertoont.

Zowel radiale voortbewegings- als zwemtests bieden gevoelige detectie van motiliteitsstoornissen (figuur 4 en figuur 5). Om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan pathologisch TDP-43 bij ALS, zijn C. elegans-modellen ontwikkeld die wild-type of ALS-mutant humaan TDP-43 pan-neuronaal tot expressie brengen. Deze dieren vertonen moleculaire en cellulaire kenmerken die doen denken aan ALS, waaronder motorische disfunctie9. Belangrijk is dat ze matige motiliteitsstoornissen vertonen met de expressie van wild-type humane TDP-43 en meer ernstige motiliteitsstoornissen bij dieren die ALS-mutant TDP-43 tot expressie brengen met behulp van zowel radiale voortbeweging als zwemtests. Sommige gemuteerde of transgene dieren zullen een grotere beperking hebben in kruipen dan zwemmen, of omgekeerd. Door gebruik te maken van twee verschillende motiliteitstesten wordt een duidelijker beeld verkregen van fenotypische verschillen tussen stammen.
Radiale voortbeweging Wanneer ze op een gezaaide agarplaat worden geplaatst, verkennen C. elegans hun omgeving, inclusief het zoeken naar de grenzen van hun voedselbron. Radiale locomotietests zijn een manier om te profiteren van dat gedrag als een metriek voor fysieke fitheid. Door het locomotorische gedrag (kruipen op een vast oppervlak) op een gecontroleerde en kwantificeerbare manier te analyseren, biedt de radiale locomotorische test een eenvoudig en effectief hulpmiddel voor het beoordelen van de ernst van motorische tekorten en andere motorgerelateerde fenotypen. Radiale voortbewegingstests leggen verschillen in motiliteit vast in matig of ernstig aangetaste ALS-modelwormen en bieden een basislijn om modulatie van motiliteitsfenotypen of veranderingen in motiliteit met de leeftijd te vergelijken (figuur 6). Deze strategie kan worden toegepast om het kruipgedrag te kwantificeren van elke stam die de beweging van wildtype (N2) of controlewormen heeft veranderd. Deze methode is echter mogelijk geen goede keuze om dieren te beoordelen die niet normaal kunnen kruipen, zoals rolmutanten of dieren die verlamd zijn. Typisch, wild-type wormen zullen een gemiddelde verplaatsing tussen 200-300 μm / min vertonen wanneer ze worden verhoogd en getest bij 20 ° C. De voorbeeldgegevens in figuur 4 tonen verwachte resultaten bij het vergelijken van N2, twee verschillende transgene stammen die wild-type humaan TDP-43 tot expressie brengen met een mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] of sterker fenotype [TDP-43(WT-matig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], een transgene stam die mutant humaan TDP-43 tot expressie brengt met een ernstig fenotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en een transgene stam die een ander neurodegeneratief-ziekte geassocieerd eiwit tot expressie brengt, wild-type menselijke tau [tau (WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De twee stammen die wild-type TDP-43 tot expressie brengen, hebben verschillende gradaties van aantasting zoals gedetecteerd door radiale voortbeweging. TDP-43 (WT-laag) verschilt niet significant van N2, terwijl TDP-43 (WT-hoog) duidelijke verschillen in motiliteit vertoont. TDP-43 (M337V) en tau (WT) stammen hebben ernstiger stoornissen in de beweeglijkheid.
Zwemtest C. elegans houden zich bezig met stereotiepe zwembewegingen (thrashing) wanneer ze worden ondergedompeld in vloeistof. Onmiddellijk na onderdompeling beginnen wormen hoofd en staart karakteristiek naar elkaar toe te buigen met een buighoek van ongeveer 45 °, waarbij de hoekhoek het middelpunt van de worm is. Wormen wisselen buigingen af in de ventrale en dorsale richting. Eén thrash, zoals gemeten door de software, vertegenwoordigt de beweging van het gaan van recht naar een lichaamsbuighoek van 20 ° of meer, ongeacht de directionaliteit (hoekdrempelvorming kan nabewerking worden aangepast in het venster Analyse en Plotting [Workflow | Gegevens | analyseren Lichaamsvorm | Buighoek | Mid-Point | Amplitudedrempel: # graden]. De hier beschreven zwemtest maakt gebruik van geautomatiseerde computergebaseerde tracking en analyse om onbevooroordeelde scores van zwemactiviteit te bieden. Verwacht wordt dat wild-type (N2) wormen gemiddeld tussen de 150-200 thrashes per min zullen hebben wanneer ze worden opgetild en geregistreerd bij 20 °C. De voorbeeldgegevens in figuur 5 tonen de verwachte resultaten van het vergelijken van N2, twee verschillende transgene stammen die wild-type humaan TDP-43 tot expressie brengen met een mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] of sterker fenotype [TDP-43(WT-matig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en een transgene stam die een ander neurodegeneratief-ziekte geassocieerd eiwit tot expressie brengt, wild-type menselijke tau [tau (WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De transgene stam die ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] tot expressie brengt, wordt niet in vloeistof gegooid en wordt dus op de grafiek aangeduid als ND (geen gegevens). Deze test kan verschillende fenotypen onderscheiden dan de radiale voortbewegingstest in figuur 4. In de radiale voortbewegingstest (figuur 4) verschilde TDP-43 (WT-laag) bijvoorbeeld niet significant van N2. In de zwemtest (figuur 5) verschillen zowel TDP-43 (WT-laag) als TDP-43 (WT-hoog) echter aanzienlijk van N2 en verschillen ze aanzienlijk van elkaar. Ondanks dat zowel TDP-43 (M337V) als tau (WT) ernstige kruipstoornissen hebben door radiale voortbeweging (figuur 4), is alleen tau (WT) in staat om voldoende te worden gevolgd door de software (figuur 5). TDP-43 (M337V) dieren zijn niet in staat om te slaan, en software-gebaseerde analyse detecteert of volgt deze wormen niet nauwkeurig. Er werden dus geen gegevens over deze wormen verzameld (ND, geen gegevens).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg"> Figuur 1: Radiale locomotietestworkflow. Panelen A-E tonen de gegeneraliseerde stappen van de radiale locomotietest. De stappen zijn als volgt: (A) NGM-platen, met OP50 gezaaid tot aan de randen, worden voorbereid door centrale stip te labelen en te markeren, (B) wormen worden in het midden van de agar geplaatst zoals gemarkeerd door de centrale stip, (C) wormen mogen gedurende een bepaalde tijd vrij bewegen, (D) plaat wordt bottom-up omgedraaid en de uiteindelijke locatie van elke worm is gemarkeerd in een andere kleur dan de centrale stip, (E) De afstand van de middelste stip tot elke uiteindelijke wormlocatie wordt met de hand of digitaal gemeten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg"> Figuur 2: Digitale meting van de uiteindelijke locatie met behulp van ImageJ.  Afstand tot het midden metingen kunnen met de hand of digitaal worden gemeten, om digitaal te meten met behulp van ImageJ (A) scan achterkant van de plaat met een liniaal in het frame. (B) Teken een bekende lengte met het lijngereedschap. (C) Gebruik de bekende lengte getekend in (B) om schaal in te stellen [Analyseren | Schaal instellen...]. (D) Gebruik het lijngereedschap om een lijn van het middelpunt naar een definitieve locatiemarkering te tekenen, herhaal dit voor elke markering. (E) Een penseellijn die het eerste gemeten merk markeert, helpt bij het scoren (kronkelige zwarte lijn in de buurt van de 1-markering). De uiteindelijke locatiemarkeringen zijn geel genummerd om de richting van het scoren te illustreren. (F) Metingen worden geregistreerd in het venster Resultaten. Sla resultaten elders op voor statistische analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg"> Figuur 3: Materiaal- en hardwareaanpassingen voor het gebruik van de software. (A) Materialen die worden gebruikt voor de softwareondersteunde zwemtest. (B) Algemene instelling van de software en benodigde materialen, merk op dat de behuizing zich in de verhoogde positie bevindt. (C) De hoogte van de lensbevestigingsbeugel kan worden aangepast. Deze afbeelding toont de verstelbare track en een tape-indicator die de gewenste hoogte markeert voor het uitvoeren van zwemtests. Het is noodzakelijk om het felle veldlicht en de camerafocus aan te passen voordat u opneemt. (D) Een testplaat van 35 mm wordt op het podium geplaatst, dieren in M9 worden aan de plaat toegevoegd en een timer van 1 minuut wordt gestart. (E) Het is soms voordelig om de plaat voorzichtig te draaien om wormen dichter bij het midden te plaatsen - observeer de locatie op het live opnamescherm; als alternatief kunnen een paar druppels M9 van een pipettor worden gebruikt om wormen te scheiden. (F) Pas de scherpstelring op de cameralens aan, observeer wormen op het scherm om de optimale scherpstelling te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg"> Figuur 4: Radiale voortbewegingstests detecteren verschillen in kruipsnelheid. Niet-gestimuleerde dispersie van ontwikkelingsgeënsceneerde L4-larven werd gemeten met behulp van de radiale locomotietest die hierboven is beschreven en in een grafiek weergegeven als μm / min afgelegd (A-B). Dezelfde gegevens uitgezet in (A) en (B) tonen twee verschillende mogelijke grafische presentaties. In (A) worden gegevens weergegeven als een staafdiagram, waardoor relatieve verschillen tussen stammen duidelijker worden. In (B) wordt de uiteindelijke verplaatsing van elke worm in de grafiek weergegeven, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. Om de significantie tussen geteste stammen te evalueren, werd eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest gebruikt. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=niet significant. TDP-43 (M337V) en tau (WT) verschillen ook aanzienlijk van N2, p<0,0001. Foutbalken in (A) zijn standaardfout van het gemiddelde (SEM) en in (B) zijn standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg"> Figuur 5: Zwemtests detecteren verschillen in thrashing in vloeistof. Zwemsnelheden (thrashing of golvingsfrequentie in vloeistof) werden gemeten met behulp van onbevooroordeelde computerondersteunde scores en analyses die hierboven zijn beschreven en in een grafiek zijn weergegeven als thrashes / min (A-B). Dezelfde gegevens uitgezet in (A) en (B). In (A) worden gegevens weergegeven als een staafdiagram, waardoor relatieve verschillen tussen stammen gemakkelijker te zien zijn. In (B) worden gegevens van elke individuele gescoorde worm uitgezet in de grafiek, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. Om de significantie tussen geteste stammen te evalueren, werd een eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest gebruikt. p<0,0001, ns=niet significant. TDP-43 (WT-matig) en tau (WT) verschillen ook aanzienlijk van N2, p<0.0001.Foutbalken in (A) zijn standaardfout van het gemiddelde (SEM) en in (B) zijn standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg"> Figuur 6: Gemuteerde TDP-43 wormen reizen minder dan wild-type wormen. Platen met een representatief verschil in de uiteindelijke locatie van geënsceneerde L4 N2 (wild-type) en TDP-43 (M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), een stam die mutant humaan TDP-43 tot expressie brengt met een ernstig verminderde motorische functie na 1 uur ongestimuleerd kruipen bij kamertemperatuur. Platen zijn gemarkeerd met een rode stip voor het middelpunt en blauwe stippen voor de uiteindelijke locatie van de dieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Het vastleggen van zwemgedrag met behulp van de beeldvormings- en trackingsoftware. (A) De trackingworkflow en de locatie van het pictogram voor video-opname. (B) Het venster Video-opname wordt weergegeven in Live View en de belangrijkste aspecten worden gemarkeerd. De groene woorden "Live view" veranderen in een rode "Recording" wanneer de opnameknop wordt geactiveerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Voorbereiden en volgen van zwemgedrag. Deze afbeelding toont een reeks schermafbeeldingen om te helpen bij het instellen van een videobeeldreeks voor tracking. Het algemene protocol voor het voorbereiden van een videoreeks is om elk workflowmenu in deze volgorde te openen: Afbeeldingsreeks importeren | Set Sequence Info | Afbeelding aanpassen | Detecteer en volg | Project opslaan. Het venster Gegevens analyseren kan alleen worden gebruikt nadat een projectbestand is bijgehouden. (A) toont een geopend .avi (video) bestand na het importeren van de reeks in de software vanuit de Track workflow. (B) Het venster Set Sequence Info biedt een plek voor notities, het instellen/wijzigen van de schaal en het controleren van de metadata voor een videosequentie. Instructies voor het wijzigen van de schaal zijn te vinden in dit venster en moeten worden gevolgd wanneer de camera wordt neergelaten of verhoogd (B). Afbeelding (C) toont de instellingen van het venster Afbeelding aanpassen . (D) Schermafbeelding van het detectietabblad van het venster Detecteren en volgen . Het detecteren van wormen wordt gebruikt om de software te trainen en moet voor elke videosequentie worden ingesteld. Indien gewenst kunnen hier aanvullende detectieparameters worden ingesteld. (E) Screenshot van het tabblad Tracking van het venster Detecteren en volgen met de aanbevolen instellingen voor het volgen van zwemgedrag. Dit is de laatste stap bij het instellen van een videosequentie. Sla de reeks op als een project met behulp van het venster Project opslaan . Herhaal deze stappen voor elke videoreeks. Instellingen kunnen worden opgeslagen als een configuratie om de werklast te verminderen en ervoor te zorgen dat alle sequenties hetzelfde worden behandeld (niet weergegeven). Als u projectbestanden wilt bijhouden voor analyse, navigeert u naar de batchwerkstroom . (F) toont het pictogram dat wordt gebruikt om naar de batchworkflow te navigeren en (G) toont het batchverwerkingsvenster, markeert de knoppen toevoegen en starten en toont het verwachte uiterlijk van een projectbestand dat is bijgehouden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3: Zwemgedragsanalyse. Nadat een projectbestand is bijgehouden, kan het worden geopend met [Bestand | Open Project]. Wormen verschijnen in het groen zoals weergegeven in (A). Scrubben door de video biedt een snelle controle dat de video is verwerkt zoals verwacht, groene markering zal verdwijnen tijdens het schrobben. Het venster Gegevensanalyse en -plotten wordt geopend vanuit het werkstroomitem Gegevens analyseren . (B) toont het venster Gegevensanalyse en plotten met positieweergave geopend (standaard), alle tracks zijn gemarkeerd. Onder de datapunten bevindt zich een plot met het opgenomen spoor voor elke gemarkeerde worm. De track summary analyse wordt gebruikt om bochten per minuut te berekenen. (C-D) het tracksamenvattingsrapport en exportdetails weergeven. (E-F) toont de tracksamenvatting in een spreadsheet en hoe de beurten per minuut te berekenen, de output gemeten in deze test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Dit protocol beschrijft twee gevoelige testen voor het onderscheid tussen milde, matige en ernstige motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose, met algemeen nut voor C. elegans-stammen , met veranderde beweeglijkheid.

Evaluatie van motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Ons protocol presenteert twee assays, die de beweging van C.elegans kwantificeren. Deze methoden evalueren motiliteitsfenotypes zoals die worden tentoongesteld door modellen van Amyotrofische Laterale Sclerose, of ALS. De Radial Locomotion Assay is een kosteneffectieve en eenvoudige methode om kruipen op een vast oppervlak te detecteren.De Swimming Assay maakt gebruik van computergebaseerde tracking voor onbevooroordeelde detectie van thrashing-bewegingen in vloeistof. Deze methoden zijn nuttig voor het kwantificeren van bewegingsverschillen in C.elegans. Hoewel we ALS bestuderen, kunnen ze worden gebruikt voor elke soort met veranderde beweeglijkheid.Draai de NGM-testplaten ondersteboven. En label de bodem met een identificatie voor de C.elegans-stammen die moeten worden getest. Maak een kleine stip met de stift in het midden van de onderstebovenplaat.Breng tijdens het werken met een ontleedmicroscoop wormen over naar het midden van de testplaat. En stel een timer in voor 30 minuten. Leg het deksel terug op het bord en zet het apart.Ga door met het overbrengen van wormen totdat alle stammen op de aangewezen testplaten staan. Begin na 30 minuten met het scoren van de eerste plaat door het deksel te verwijderen en de plaat met de voorkant naar beneden onder de ontleedmicroscoop te plaatsen. Pas de microscoopfocus aan totdat alle wormen zichtbaar zijn door de vijzel.Gebruik een andere gekleurde viltstift vanaf het middelpunt en plaats een kleine stip op de locatie van elke worm. Controleer de rand van de plaat, want daar kunnen sommige wormen terechtkomen. Tel en noteer ook hoeveel wormen niet van het middelpunt zijn verplaatst.Meet de afstand van het middelpunt tot de uiteindelijke locatiemarkeringen voor elke worm en noteer de afstand met een liniaal. Het eerste wormpunt is gemarkeerd met een streepje. Noteer lengtegegevens voor elke stip achtereenvolgens door de plaat met de klok mee te draaien.Open de bijbehorende software om de video's in te stellen en op te nemen. Klik op het pictogram voor het vastleggen van video's. Druk op de dimmerknop en draai deze met de klok mee om het licht aan te passen.Klik in het video-opnamevenster op het tabblad Instellingen en pas de videomodus aan op 2456x2052_Mono8, framesnelheid naar 14, uitvoer als monochroom. Belichting van 0,00300 seconden. Versterking tot 1 dB.Gamma op één. En roteren naar 180. Ga terug naar het tabblad Vastleggen, selecteer de opnamemap en wijs een bestandsnaam toe door deze in te voeren in het tekstvak voor het bestandsvoorvoegsel.Stel andere opname-instellingen zoals buffer in op 128 frames en de duur op één minuut. Plaats de testplaat verlicht op het apparaatpodium en centreer deze in het video-opnamescherm en verwijder vervolgens het deksel. Gebruik een micropipette om ongeveer 50 wormen in 1 ml M9 op de testplaat te wassen.Draai de plaat voorzichtig om de dieren naar het midden te brengen, of gebruik een micropipette om een paar druppels M9 toe te voegen om de dieren te scheiden. Stel een timer in voor 60 seconden om wormen te laten wennen aan het zwemmen. Stel de lichtknop zo in dat het display zo helder mogelijk is zonder overbelichting.Pas de camerafocus handmatig aan door de scherpstelring op de lensbehuizing van de camera te draaien, terwijl u naar het scherm kijkt. Druk na 60 seconden op de opnameknop, selecteer de eerste knop in het workflowmenu Afbeeldingsreeks importeren "en zoek en dubbelklik op een video. Selecteer in het workflowmenu Volgorde-informatie instellen"Controleer in het nieuwe menuvenster het naamgevingsschema, voeg notities toe en valideer metagegevens.Selecteer Afbeelding aanpassen en er wordt een nieuw pop-upmenu met de naam Afbeeldingsaanpassingen geopend. Pas de instellingen voor beeldverwerking aan door de achtergrond vloeiend te maken op 10, Gaussiaanse vloeiendheid op vijf, gaten vullen op twee, klein objectfilter op nul en integrale afgeleide segmentatie over te slaan. Pas het drempelniveau zo aan dat de dieren volledig gevuld zijn met groen, maar nog steeds verschillen van de achtergrond.Klik vervolgens op Toepassen "Selecteer in het workflowmenu Detecteren en volgen" selecteer drie tot zeven wormen en klik op de knop Wormen detecteren op het tabblad Detectie. Ga naar het tabblad Tracking. Vink in de trackingparameters Use Backtracking" aan en schakel Trackwormen aan de rand van de afbeelding uit.Stel de max tracked hypothese in op vijf. Stel de trackingmodus in op zwemmen. Ga naar het gedeelte geavanceerde instellingen en stel de frames in die wormen kunnen raken grens op 50.Frameswormen kunnen overlappen tot 500. Positietolerantie tot 0,50. En vormtolerantie tot 0,50.Sla deze instellingen op en implementeer ze voor alle video's in een experiment door ze op te slaan als een configuratie. Navigeer naar configuratiebeheer in het pictogrammenu linksboven en klik op het pictogram Opslaan. Geef deze configuratie een naam en beschrijving.En klik op OK"Klik in het workflowmenu op Project opslaan"Volg de video's door naar het workflowmenu te gaan en op het pictogram Batch" te klikken. Klik op de knop Toevoegen onder het gedeelte bestandsselectie van dit batchverwerkingsmenu. navigeer naar en selecteer alle projectbestanden die moeten worden verwerkt.Klik vervolgens op de knop Openen "Klik op de start" en noteer de groene voortgangsindicator op het eerste bestand. Sta toe dat alle bestanden worden verwerkt. Wanneer alle gelezen bestanden zijn voltooid, sluit u de software.Selecteer Gegevens analyseren"Navigeer naar het overzicht van de track. En gebruik de knop Exporteren rechtsonder om gegevens te exporteren in een leesbaar formaat voor spreadsheets. Gebruik de Turn Count "en Track Duration" om bochten per minuut voor elke track te berekenen met behulp van spread sheeting-functies.Niet-gestimuleerde dispersie van ontwikkelingsgefaseerde L4-larve van vijf verschillende stammen werd gemeten met behulp van de Radial Locomotion Assay. En in een grafiek weergegeven als micrometer per afgelegde minuut. De gegevens die als staafdiagrammen worden weergegeven, maken relatieve verschillen tussen stammen duidelijker.Terwijl de uiteindelijke verplaatsing van elke worm die in de grafiek is uitgezet, het mogelijk maakt om de variatie binnen de populatie beter te visualiseren. De zwemsnelheid in termen van thrashing of golvingsfrequentie in de vloeistof, werd gemeten met behulp van onbevooroordeelde computerondersteunde scoring en analyse. En weergegeven als thrashes per minuut.De staafdiagramgegevens maken relatieve verschillen tussen stammen gemakkelijker te zien. Terwijl gegevens van elke individuele gescoorde worm in de grafiek worden uitgezet, waardoor de variatie binnen de populatie beter kan worden gevisualiseerd. In de Radial Locomotion Assay verschilde de milde TDP-43-stam niet significant van de wildtype N2-stam.In de Swimming Assay verschilden zowel de milde als de sterke TDP-43-stammen echter niet alleen aanzienlijk van de wild-type N2, maar ook van elkaar. De ALS-mutante TDP-43-stam heeft een ernstige kruipstoornis door radiale voortbeweging en ze gooien niet in vloeistof. De tau-expresserende spanning heeft ernstige beperkingen in radiale voortbeweging, maar kan in de swimming assay thrashen.Het belangrijkste aspect om te overwegen met deze methoden, is het handhaven van consistente controles tussen replicaties. Dit zorgt ervoor dat variaties in motiliteit worden veroorzaakt door fenotypische verschillen en niet door omgevingsomstandigheden. Deze methoden bieden een uitgebreide beoordeling van twee belangrijke C.elegans motiliteitsparadigma's.Vervolgmethoden kunnen aanvullende gedragskarakterisering, biochemische analyse of onderzoek van de spier- of neuronfunctie omvatten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Geautomatiseerde analyse van<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Gedrag Met behulp van Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Uitgebreid autopsie programma voor individuen met multiple sclerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...