Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
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Nous remercions les évaluateurs pour leurs commentaires et suggestions utiles. Nous remercions Aleen Saxton, Brandon Henderson et Jade Stair pour leur assistance technique exceptionnelle. Nous remercions Brian Kraemer et Rebecca Kow pour leur aide dans l’élaboration de ces essais. Ce matériel est le résultat d’un travail soutenu par des ressources et de l’utilisation des installations du système de soins de santé VA Puget Sound. Ce travail a été soutenu par une subvention des États-Unis (U.S.) Service de recherche et de développement de laboratoire biomédical du ministère des Anciens Combattants (VA) [Subvention d’examen du mérite #I01BX004044 à la N.F.L.]

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	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucune divulgation.

Locomotion radiale : La résolution de ce test est facilement contrôlée en modifiant la variable de temps. L’augmentation de la durée facilite l’observation des différences entre les animaux présentant des phénotypes sévères, identifiant ainsi des différences subtiles. Cependant, comme ce test mesure le déplacement, si le temps de dosage est prolongé trop longtemps, les animaux ayant une motilité normale, tels que N2, se déplaceront jusqu’aux bords de la plaque et le comportement de recherche de nourriture entraînera un retour en arrière. Cela diminuera artificiellement la mesure de la distance parcourue. Des périodes trop longues peuvent entraîner la disparition des différences entre les souches, en particulier entre les animaux ayant des phénotypes moteurs moins sévères, car les animaux se dispersent uniformément dans la plaque. Raccourcir la variable de temps empêchera les vers plus actifs de trouver les bords de la plaque. Cette méthode ne suit pas la distance totale parcourue pour chaque ver, mais comprime la distance parcourue pour chaque ver dans une distance linéaire du centre de la plaque. En tant que tel, il est intrinsèquement moins robuste qu’une méthode qui enregistre la longueur totale de la piste des vers individuels. Cependant, le test de locomotion radiale nécessite très peu de formation de chercheur, utilise des réactifs relativement abordables qui sont couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de vers, et est suffisamment sensible pour produire des résultats significatifs et reproductibles. Pour les laboratoires qui préfèrent le suivi vidéo automatisé, plusieurs méthodes ont déjà été établies pour suivre et analyser les mouvements de crawl12, ou les paramètres logiciels utilisés pour le test de natation dans ce document pourraient être modifiés pour permettre la détection et l’analyse du crawl.
Cette expérience est généralement réalisée en répliques indépendantes triples, avec un ensemble de 30 à 40 vers par réplique. Chaque réplique est divisée sur deux plaques différentes de 100 mm ou 150 mm, avec 15 à 20 vers par plaque. L’utilisation de plus de vers que recommandé par plaque peut rendre difficile la notation efficace. Un nombre total de plus de 90 est suffisamment puissant pour établir la signification d’une déficience motrice légère, modérée ou sévère. Être cohérent avec le timing entre les souches notées est essentiel pour la précision et la reproductibilité. 30 minutes sont généralement assez longues pour établir des différences entre les phénotypes modérés à sévères tels que les souches transgéniques exprimant le TDP-43 mutant humain par rapport aux vers de type sauvage (Figure 4). Si la variable de temps est prolongée, il est conseillé d’augmenter également la taille de la plaque de 100 mm à 150 mm. Des facteurs environnementaux tels que la température et l’humidité peuvent affecter ce test, qui est généralement effectué à température ambiante ambiante ambiante, il est donc important de toujours utiliser un contrôle de type sauvage (N2) lors de la comparaison entre les réplicats. De plus, ce test peut mesurer la motilité de certaines souches qui ne présentent pas un comportement de nage normal dans le liquide (battement), ce qui en fait un complément utile au test de natation.
Essai de natation: L’utilisation du système d’imagerie et d’acquisition pour automatiser le suivi et l’analyse de la nage des vers permet d’obtenir des données rigoureuses et impartiales. Cependant, plusieurs facteurs lors de la configuration initiale de l’expérience doivent être contrôlés entre les échantillons. Ceux-ci comprennent le temps d’acclimatation au liquide avant de commencer l’enregistrement, les conditions ambiantes (c.-à-d. température, humidité) et des paramètres de lumière et d’enregistrement constants. Sur la scène de l’enregistrement, plusieurs caractéristiques aident à réduire la variabilité entre les plaques. Il s’agit notamment d’une caméra intégrée montée sur piste et d’une scène en champ lumineux qui rend l’enregistrement vidéo cohérent entre les plaques, d’un blindage autour de la scène qui empêche les reflets, l’éblouissement et les mouvements d’air pendant l’enregistrement, ainsi que d’un progiciel robuste qui détecte de manière fiable les vers et permet la correction manuelle des pistes en post-traitement vidéo. Dans ce protocole, les vidéos d’une plaque de 35 mm avec des vers sont enregistrées pendant 1 minute, puis traitées à l’aide du progiciel. Après le traitement, la correction manuelle des pistes garantit que les comportements des vers sont enregistrés avec précision sans erreurs de suivi confondantes. Les données de nombre de tours et de durée de piste sont utilisées pour déterminer les virages par minute en tant que lecture finale. Pour assurer la reproductibilité, les données sont collectées sur un minimum de 3 expériences répliquées indépendantes, chacune avec 40 à 50 animaux notés, pour atteindre un nombre final combiné d’animaux 120-150. Ce nombre est suffisant pour distinguer les petites différences de comportement de nage des vers témoins. Certains vers ont des déficits moteurs trop graves pour être capturés par des tests de natation. Par exemple, si les animaux placés dans une boucle de milieu liquide au lieu d’effectuer la réponse de battement attendue, ce test n’enregistrera pas ces mouvements avec précision et un autre test de mouvement, tel que la locomotion radiale, peut mieux capturer ces défauts de motilité. Le protocole fourni utilise un système d’imagerie disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), mais d’autres systèmes de suivi des vers peuvent fournir une utilité similaire, certains étant open source12. Les méthodes publiées précédemment décrivent la notation manuelle du thrashing de vers13. Alors que l’analyse automatisée produit un certain nombre de mesures pour chaque ver individuel, la détection des courbures du corps, mesurée en battements par minute, fournit des résultats cohérents entre les expériences et suit bien avec la notation conventionnelle des battements de vers à l’œil.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative débilitante liée au vieillissement qui a un impact particulier sur les motoneurones. La maladie se caractérise par une perte de motoneurones dans le cerveau et la moelle épinière et une déficience motrice progressive. Il en résulte une incapacité fonctionnelle majeure et un décès prématuré, généralement dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic1. Des mutations dans au moins 38 gènes peuvent causer la SLA; cependant, la plupart des patients atteints de SLA accumulent des inclusions ubiquitinées de la protéine TDP-43 comme pathologie primaire dans les neurones et les cellules gliales2,3,4. Un certain nombre de modèles animaux ont été développés pour étudier les mécanismes sous-jacents causant ou contribuant à la SLA in vivo (examinés en 5). Chez C. elegans, ces modèles incluent des mutations génétiques de perte de fonction chez les homologues des gènes responsables de la SLA ou l’expression transgénique des gènes humains de la SLA. La modélisation de la SLA chez C. elegans présente de nombreux avantages. C. elegans est un animal simple et traitable avec un système nerveux différencié, des paradigmes comportementaux bien caractérisés et une homologie génétique considérable chez l’homme6,7. De nombreux outils existent pour travailler avec C. elegans, y compris des capacités robustes d’édition du génome, des rapporteurs fluorescents in vivo de la neurodégénérescence, des paradigmes de criblage de l’ARNi, une génétique traitable et des tests comportementaux et phénotypiques établis. Les modèles de la SLA de C. elegans récapitulent des aspects de la maladie humaine, y compris l’accumulation de protéines insolubles, la neurodégénérescence et la mort prématurée8,9. En outre, un dysfonctionnement moteur avec perturbation des comportements de rampe et de natation est présent dans de nombreux modèles de SLA de C. elegans.
Ce protocole décrit deux méthodes pour caractériser les phénotypes moteurs de C. elegans : le test de locomotion radiale pour évaluer le crawl sur une surface solide et l’évaluation de la nage dans le liquide (thrashing) à l’aide du suivi et de l’analyse automatisés WormLab. Ces méthodes sensibles pour caractériser les déficits moteurs permettent des comparaisons de gravité et offrent des outils pour mesurer la suppression et l’amélioration des phénotypes moteurs. Le test de locomotion radiale quantifie les différences de motilité rampante (mouvement sinusoïdal sur une surface solide) parmi les populations de vers. Ce test tire parti du comportement d’exploration naturel non stimulé de C. elegans en plaçant les vers à un seul endroit sur une plaque et en marquant leur emplacement final après une période de temps donnée10. Alternativement, nager dans des tests liquides (thrashing) compte les courbures corporelles des vers individuels sur une période de temps définie. Le comptage manuel des courbures du corps par l’œil humain prend beaucoup de temps et présente généralement une variabilité considérable entre les expérimentateurs. L’utilisation du suivi et de l’analyse automatisés assistés par ordinateur peut éliminer une grande partie de cette variabilité. En plus de la caractérisation de l’insuffisance motrice de base des modèles de SLA, les essais de locomotion radiale et de natation peuvent détecter la modulation de phénotypes locomoteurs distincts à partir d’interventions génétiques ou de petites molécules. Ces méthodes sont utiles pour étudier les modèles de SLA et toute souche de C. elegans qui présente une motilité altérée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

La maladie neurodégénérative de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) présente une perte progressive des motoneurones accompagnée d’une faiblesse musculaire et d’une déficience motrice qui s’aggrave avec le temps. Bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la détermination des facteurs génétiques de la SLA pour un sous-ensemble de patients, la majorité des cas ont une étiologie inconnue. De plus, les mécanismes sous-jacents au dysfonctionnement et à la dégénérescence des motoneurones ne sont pas bien compris; par conséquent, il est toujours nécessaire d’élaborer et de caractériser des modèles représentatifs pour étudier ces processus. Caenorhabditis elegans peut adapter son mouvement aux contraintes physiques de son environnement, avec deux paradigmes de mouvement primaires étudiés dans un environnement de laboratoire: ramper sur une surface solide et nager dans un liquide. Ceux-ci représentent une interaction complexe entre la sensation, les motoneurones et les muscles. Les modèles de la SLA de C. elegans peuvent présenter une déficience dans l’un ou l’autre de ces paradigmes de mouvement ou dans les deux. Ce protocole décrit deux tests sensibles pour évaluer la motilité chez C. elegans : un test de locomotion radiale optimisé mesurant le crawl sur une surface solide et une méthode automatisée de suivi et d’analyse de la nage dans le liquide (thrashing). En plus de la caractérisation de l’insuffisance motrice de base des modèles de SLA, ces essais peuvent détecter la suppression ou l’amélioration des phénotypes à partir d’interventions génétiques ou de petites molécules. Ainsi, ces méthodes ont une utilité pour étudier les modèles de SLA et toute souche de C. elegans qui présente une motilité altérée.

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Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Ce protocole décrit deux tests sensibles pour discriminer les déficiences motrices légères, modérées et sévères dans les modèles C. elegans de sclérose latérale amyotrophique, avec une utilité générale pour les souches de C. elegans , avec une motilité altérée.

Évaluation de l’insuffisance motrice dans les modèles C. elegans de la sclérose latérale amyotrophique

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Notre protocole présente deux tests, quantifiant le mouvement de C.elegans. Ces méthodes évaluent les phénotypes de motilité tels que ceux présentés par les modèles de sclérose latérale amyotrophique, ou SLA. Le test de locomotion radiale est une méthode rentable et facile pour détecter le rampement sur une surface solide.Le test de natation utilise le suivi informatisé pour la détection impartiale des mouvements de battement dans le liquide. Ces méthodes sont utiles pour quantifier les différences de mouvement chez C.elegans. Bien que nous étudions la SLA, ils peuvent être utilisés pour n’importe quelle souche avec une motilité altérée.Retournez les plaques de dosage NGM à l’envers. Et étiquetez le fond avec un identifiant pour les souches de C.elegans à analyser. Faites un petit point avec le marqueur au centre de la plaque à l’envers.Lorsque vous travaillez avec un microscope à dissection, transférez les vers au centre de la plaque d’essai. Et réglez une minuterie pendant 30 minutes. Remettez le couvercle sur la plaque et mettez-le de côté.Continuez à transférer les vers jusqu’à ce que toutes les souches se trouvent sur les plaques d’essai désignées. Après 30 minutes, commencez à marquer la première plaque en retirant le couvercle et en plaçant la plaque face cachée sous le microscope à dissection. Ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que tous les vers soient visibles à travers la tarière.À l’aide d’un stylo à pointe en feutre de couleur différente à partir du point central, placez un petit point à l’emplacement de chaque ver. Vérifiez le bord de la plaque car certains vers peuvent s’y retrouver. En outre, comptez et notez combien de vers ne se sont pas déplacés du point central.Mesurez la distance entre le point central et les marques d’emplacement finales pour chaque ver et enregistrez la distance à l’aide d’une règle. Le premier point de ver est marqué d’un tiret. Enregistrez les données de longueur pour chaque point consécutivement en faisant pivoter la plaque dans le sens des aiguilles d’une montre.Ouvrez le logiciel associé pour configurer et enregistrer les vidéos. Cliquez sur l’icône de capture vidéo. Appuyez sur le bouton du gradateur et tournez-le dans le sens des aiguilles d’une montre pour régler la lumière.Dans la fenêtre de capture vidéo, cliquez sur l’onglet Paramètres et ajustez le mode vidéo à 2456x2052_Mono8, fréquence d’images à 14, sortie monochrome. Exposition de 0,00300 seconde. Gain à 1 dB.Gamma à un. Et tournez à 180. Revenez à l’onglet Capture, sélectionnez le dossier d’enregistrement et attribuez un nom de fichier en le saisissant dans la zone de texte Préfixe de fichier.Définissez d’autres paramètres de capture tels que la mémoire tampon sur 128 images et la durée sur une minute. Placez la plaque de dosage allumée sur la scène de l’appareil et centrez-la sur l’écran de capture vidéo, puis retirez le couvercle. Utilisez une micropipette pour laver environ 50 vers dans 1 ml de M9 sur la plaque d’essai.Faites tourbillonner doucement la plaque pour amener les animaux au centre, ou utilisez une micropipette pour ajouter quelques gouttes de M9 pour séparer les animaux. Réglez une minuterie pendant 60 secondes pour permettre aux vers de s’acclimater à la natation. Réglez le bouton lumineux de manière à ce que l’écran soit aussi lumineux que possible sans surexposition.Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo en tournant la bague de mise au point sur le corps de l’objectif de l’appareil photo, tout en regardant l’écran. Après 60 secondes, appuyez sur le bouton d’enregistrement, sélectionnez le premier bouton du menu de workflow Importer une séquence d’images et recherchez et double-cliquez sur une vidéo. Dans le menu du flux de travail, sélectionnez Définir les informations de séquence"Dans la nouvelle fenêtre de menu, vérifiez le schéma de nommage, ajoutez des notes et validez les métadonnées.Sélectionnez Ajuster l’image et un nouveau menu contextuel appelé Réglages de l’image s’ouvrira. Ajustez les paramètres de traitement d’image en réglant le lissage de l’arrière-plan sur 10, le lissage gaussien sur cinq, le remplissage des trous sur deux, le filtre petit objet sur zéro et en ignorant la segmentation dérivée intégrale. Ajustez le niveau de seuil de sorte que les animaux soient complètement remplis de vert, mais toujours distincts de l’arrière-plan.Cliquez ensuite sur Appliquer"Dans le menu du flux de travail, sélectionnez Détecter et suivre"sélectionnez trois à sept vers et cliquez sur le bouton Détecter les vers » dans l’onglet détection. Accédez à l’onglet de suivi. Dans les paramètres de suivi, cochez Utiliser le retour en arrière et décochez la case Suivre les vers sur le bord de l’image.Définissez l’hypothèse maximale suivie sur cinq. Réglez le mode de suivi sur natation. Accédez à la section paramètres avancés et définissez les cadres que les vers peuvent toucher à la limite sur 50.Les vers Frames peuvent se chevaucher jusqu’à 500. Tolérance de position à 0,50. Et la tolérance de forme à 0,50.Enregistrez ces paramètres et déployez-les pour toutes les vidéos d’une expérience en les enregistrant en tant que configuration. Accédez au gestionnaire de configuration dans le menu d’icônes en haut à gauche, puis cliquez sur l’icône Enregistrer. Donnez un nom et une description à cette configuration.Et cliquez sur OK"Dans le menu du flux de travail, cliquez sur Enregistrer le projet"Suivre les vidéos en accédant au menu du flux de travail et en cliquant sur l’icône Batch ». Cliquez sur le bouton Ajouter sous la section de sélection de fichiers de ce menu de traitement par lots. naviguez jusqu’à tous les fichiers de projet à traiter et sélectionnez-les.Cliquez ensuite sur Ouvrir"Cliquez sur le bouton Démarrer » et notez l’indicateur de progression vert sur le premier fichier. Autorisez le traitement de tous les fichiers. Lorsque tous les fichiers lus sont terminés, fermez le logiciel.Sélectionnez Analyser les données"Accédez au résumé de la piste. Et utilisez le bouton Exporter en bas à droite pour exporter des données dans un format lisible par feuille de calcul. Utilisez le nombre de tours et la durée de la piste pour calculer les tours par minute pour chaque piste à l’aide des fonctions de feuille d’étalement.La dispersion non stimulée de la larve L4 au stade du développement de cinq souches différentes a été mesurée à l’aide du test de locomotion radiale. Et représenté graphiquement en micro mètre par minute parcourue. Les données affichées sous forme de graphiques à barres clarifient les différences relatives entre les souches.Alors que le déplacement final de chaque ver tracé dans le graphique, permet de mieux visualiser la variation au sein de la population. Les taux de nage en termes de fréquence de battement ou d’ondulation dans le liquide ont été mesurés à l’aide d’une notation et d’une analyse assistées par ordinateur non biaisées. Et représenté graphiquement sous forme de thrashes par minute.Les données du graphique à barres rendent les différences relatives entre les souches plus faciles à voir. Alors que les données de chaque ver individuel marqué sont tracées dans le graphique, ce qui permet de mieux visualiser la variation au sein de la population. Dans le test de locomotion radiale, la souche légère TDP-43 n’était pas significativement différente de la souche N2 de type sauvage.Cependant, dans le test de natation, les souches TDP-43 douces et fortes étaient non seulement significativement différentes du type sauvage N2, mais aussi les unes des autres. La souche TDP-43 mutante de la SLA a une altération grave du crawl par locomotion radiale, et elle ne se jette pas dans le liquide. La souche exprimant le tau a de graves déficiences dans la locomotion radiale, mais peut battre dans le test de natation.L’aspect le plus important à considérer avec ces méthodes est le maintien de contrôles cohérents entre les réplications. Cela garantit que les variations de motilité sont causées par des différences phénotypiques et non par des conditions environnementales. Ces méthodes fournissent une évaluation complète de deux paradigmes majeurs de motilité de C.elegans.Les méthodes de suivi pourraient inclure une caractérisation comportementale supplémentaire, une analyse biochimique ou une étude de la fonction musculaire ou neuronale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

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Recherche

Neurosciences

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

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We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Analyse automatisée de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportement Swim Utiliser Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Programme complet d'autopsie pour les personnes atteintes de sclérose en plaques

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...