Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
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Wir danken den Rezensenten für hilfreiche Kommentare und Anregungen. Wir danken Aleen Saxton, Brandon Henderson und Jade Stair für die hervorragende technische Unterstützung. Wir danken Brian Kraemer und Rebecca Kow für die Unterstützung bei der Entwicklung dieser Assays. Dieses Material ist das Ergebnis der Arbeit, die mit Ressourcen und der Nutzung von Einrichtungen im VA Puget Sound Health Care System unterstützt wird. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Vereinigten Staaten (U.S.) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 an N.F.L.]

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S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Offenlegungen haben.

Radiale Fortbewegung: Die Auflösung dieses Assays kann leicht durch Ändern der Zeitvariablen gesteuert werden. Die Vergrößerung der Zeitdauer erleichtert die Beobachtung von Unterschieden zwischen Tieren mit schweren Phänotypen und identifiziert so subtile Unterschiede. Da dieser Assay jedoch die Verdrängung misst, wandern Tiere mit normaler Motilität, wie z. B. N2, zu den Rändern der Platte, und das Futterverhalten führt zu einem Backtracking. Dadurch wird die Messung der zurückgelegten Strecke künstlich verringert. Zu lange Zeiträume können zum Verschwinden von Unterschieden zwischen Stämmen führen, insbesondere zwischen Tieren mit weniger schweren motorischen Phänotypen, da die Tiere gleichmäßig über die Platte verteilt werden. Durch die Verkürzung der Zeitvariablen wird verhindert, dass aktivere Würmer die Kanten der Platte finden. Diese Methode verfolgt nicht die Gesamtstrecke, die für jeden Wurm zurückgelegt wird, sondern komprimiert die für jeden Wurm zurückgelegte Strecke in einen linearen Abstand von der Mitte der Platte. Als solches ist es von Natur aus weniger robust als eine Methode, die die gesamte Spurlänge einzelner Würmer aufzeichnet. Der radiale Fortbewegungsassay erfordert jedoch sehr wenig Forscherausbildung, verwendet relativ erschwingliche Reagenzien, die in den meisten Wurmlabors allgemein verfügbar sind, und ist empfindlich genug, um signifikante und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Für Labore, die eine automatisierte Videoverfolgung bevorzugen, wurden zuvor mehrere Methoden zur Verfolgung und Analyse von Kriechbewegungen12 etabliert, oder die in diesem Papier für den Schwimmassay verwendeten Softwareparameter könnten geändert werden, um eine Crawling-Erkennung und -Analyse zu ermöglichen.
Dieses Experiment wird normalerweise in dreifachen unabhängigen Replikaten mit einem Satz von 30-40 Würmern pro Replikat durchgeführt. Jedes Replikat wird auf zwei verschiedene 100-mm- oder 150-mm-Platten mit 15-20 Würmern pro Platte aufgeteilt. Die Verwendung von mehr Würmern als pro Platte empfohlen kann es schwierig machen, effizient zu punkten. Eine Gesamtzahl von 90+ ist ausreichend, um die Signifikanz für eine leichte, mittelschwere oder schwere Motilitätsbeeinträchtigung zu ermitteln. Die Konsistenz des Timings zwischen den bewerteten Dehnungen ist für die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit unerlässlich. 30 Minuten sind im Allgemeinen lang genug, um Unterschiede zwischen mittelschweren bis schweren Phänotypen wie transgenen Stämmen, die menschliche mutante TDP-43 exprimieren, im Vergleich zu Wildtypwürmern festzustellen (Abbildung 4). Wenn die Zeitvariable verlängert wird, ist es ratsam, auch die Größe der Platte von 100 mm auf 150 mm zu erhöhen. Umweltfaktoren wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit können diesen Assay beeinflussen, der typischerweise bei Raumtemperatur durchgeführt wird, daher ist es wichtig, beim Vergleich zwischen Replikaten immer eine Wildtyp-Kontrolle (N2) zu verwenden. Darüber hinaus kann dieser Assay die Motilität einiger Stämme messen, die kein normales Schwimmverhalten in Flüssigkeit (Thrashing) aufweisen, was ihn zu einer nützlichen Ergänzung des Schwimmassays macht.
Schwimm-Assay: Die Verwendung des Bildgebungs- und Erfassungssystems zur Automatisierung der Verfolgung und Analyse des Wurmschwimmens ermöglicht rigorose und unvoreingenommene Daten. Es gibt jedoch mehrere Faktoren während der Ersteinrichtung des Experiments, die zwischen den Proben kontrolliert werden müssen. Dazu gehören die Zeit, um sich vor Beginn der Aufnahme an Flüssigkeit zu gewöhnen, Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Luftfeuchtigkeit) sowie konsistente Licht- und Aufnahmeeinstellungen. Auf der Aufnahmebühne gibt es mehrere Funktionen, die dazu beitragen, die Variabilität zwischen den Platten zu reduzieren. Dazu gehören eine integrierte Spurkamera und eine Hellfeldbühne, die die Videoaufzeichnung zwischen den Platten konsistent macht, eine Abschirmung um die Bühne, die Reflexionen, Blendung und Luftbewegungen während der Aufnahme verhindert, und ein robustes Softwarepaket, das Würmer zuverlässig erkennt und die manuelle Korrektur von Spuren in der Videonachbearbeitung ermöglicht. In diesem Protokoll werden Videos einer 35-mm-Platte mit Würmern für 1 Minute aufgezeichnet und dann mit dem Softwarepaket verarbeitet. Nach der Verarbeitung stellt die manuelle Korrektur der Spuren sicher, dass das Wurmverhalten genau aufgezeichnet wird, ohne Tracking-Fehler zu verwirren. Turn Count- und Track-Duration-Daten werden verwendet, um Turns pro Minute als endgültige Anzeige zu bestimmen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden Daten über mindestens 3 unabhängige Wiederholungsexperimente mit jeweils 40-50 bewerteten Tieren gesammelt, um eine kombinierte endgültige Anzahl von Tieren von 120-150 zu erreichen. Diese Zahl reicht aus, um kleine Unterschiede im Schwimmverhalten von Kontrollwürmern zu unterscheiden. Einige Würmer haben motorische Defizite, die zu schwerwiegend sind, um durch Schwimmtests erfasst zu werden. Wenn sich beispielsweise die Tiere in einem flüssigen Medium zusammenrollen, anstatt die erwartete Schlagreaktion auszuführen, zeichnet dieser Assay diese Bewegungen nicht genau auf, und ein anderer Bewegungsassay, wie z. B. die radiale Fortbewegung, kann diese Motilitätsfehler besser erfassen. Das bereitgestellte Protokoll verwendet ein kommerziell erhältliches Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien für weitere Details), aber andere Wurmverfolgungssysteme können ein ähnliches Dienstprogramm bieten, wobei einige Open Source sind12. Zuvor veröffentlichte Methoden beschreiben die manuelle Bewertung von Wurm-Thrashing13. Während die automatisierte Analyse eine Reihe von Metriken für jeden einzelnen Wurm liefert, liefert die Erkennung von Körperbiegungen, die in Thrashes pro Minute gemessen wird, konsistente Ergebnisse zwischen Experimenten und Tracks gut mit herkömmlicher Bewertung von Wurm-Thrashes nach Auge.

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung mit besonderen Auswirkungen auf Motoneuronen. Die Krankheit kennzeichnet den Verlust von Motoneuronen im Gehirn und Rückenmark sowie eine fortschreitende motorische Beeinträchtigung. Dies führt zu einer schweren funktionellen Behinderung und einem vorzeitigen Tod, typischerweise innerhalb von 3-5 Jahren nach der Diagnose1. Mutationen in mindestens 38 Genen können ALS verursachen; Die meisten Patienten mit ALS akkumulieren jedoch ubiquitinierte Einschlüsse des Proteins TDP-43 als primäre Pathologie in Neuronen und Gliazellen2,3,4. Eine Reihe von Tiermodellen wurde entwickelt, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die ALS in vivo verursachen oder dazu beitragen (überprüft in5). In C. elegans umfassen diese Modelle genetische Loss-of-Function-Mutationen in Homologen von ALS-verursachenden Genen oder transgene Expression von menschlichen ALS-Genen. Es gibt zahlreiche Vorteile bei der Modellierung von ALS in C. elegans. C. elegans sind ein handhabbares einfaches Tier mit einem differenzierten Nervensystem, gut charakterisierten Verhaltensparadigmen und einer beträchtlichen genetischen Homologie für den Menschen6,7. Es gibt viele Werkzeuge für die Arbeit mit C. elegans, darunter robuste Genom-Editing-Fähigkeiten, In-vivo-Fluoreszenz-Reporter der Neurodegeneration, RNAi-Screening-Paradigmen, handhabbare Genetik und etablierte verhaltens- und phänotypische Assays. C. elegans-Modelle von ALS rekapitulieren Aspekte menschlicher Erkrankungen, einschließlich der Akkumulation unlöslicher Proteine, der Neurodegeneration und des frühen Todes8,9. Darüber hinaus ist eine motorische Dysfunktion mit Störungen des Krabbel- und Schwimmverhaltens bei vielen C. elegans ALS-Modellen vorhanden.
Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Charakterisierung der motorischen Phänotypen von C. elegans : den radialen Fortbewegungstest zur Bewertung des Kriechens auf einer festen Oberfläche und die Beurteilung des Schwimmens in Flüssigkeit (Thrashing) mit dem automatisierten Tracking und der Analyse von WormLab. Diese sensitiven Methoden zur Charakterisierung motorischer Defizite ermöglichen Schweregradvergleiche und bieten Werkzeuge zur Messung der Unterdrückung und Verbesserung motorischer Phänotypen. Der radiale Fortbewegungsassay quantifiziert Unterschiede in der Kriechmotilität (sinusförmige Bewegung auf einer festen Oberfläche) zwischen Populationen von Würmern. Dieser Assay nutzt das natürliche unstimulierte Explorationsverhalten von C. elegans , indem er Würmer an einer einzigen Stelle auf einer Platte platziert und ihre endgültige Position nach einer bestimmten Zeit markiert10. Alternativ zählen Schwimmen in flüssigen (Thrashing) Assays Körperbiegungen einzelner Würmer über einen bestimmten Zeitraum. Die manuelle Zählung von Körperbeugen durch das menschliche Auge ist zeitintensiv und weist typischerweise eine erhebliche Variabilität zwischen den Experimentatoren auf. Die Verwendung von computergestützter automatisierter Verfolgung und Analyse kann einen Großteil dieser Variabilität eliminieren. Zusätzlich zur Charakterisierung der motorischen Beeinträchtigung von ALS-Modellen zu Studienbeginn können sowohl radiale Fortbewegungs- als auch Schwimmassays die Modulation verschiedener lokomotorischer Phänotypen aus genetischen oder niedermolekularen Interventionen nachweisen. Diese Methoden sind nützlich für die Untersuchung von ALS-Modellen und jedem C. elegans-Stamm , der eine veränderte Motilität aufweist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

Die neurodegenerative Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) weist einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen auf, der von Muskelschwäche und motorischen Beeinträchtigungen begleitet wird, die sich mit der Zeit verschlimmern. Während bei der Bestimmung der genetischen Treiber von ALS für eine Untergruppe von Patienten erhebliche Fortschritte erzielt wurden, hat die Mehrheit der Fälle eine unbekannte Ätiologie. Darüber hinaus sind die Mechanismen, die der Dysfunktion und Degeneration der Motoneuronen zugrunde liegen, nicht gut verstanden; Daher besteht ein ständiger Bedarf, repräsentative Modelle zu entwickeln und zu charakterisieren, um diese Prozesse zu untersuchen. Caenorhabditis elegans kann ihre Bewegung an die physischen Einschränkungen ihrer Umgebung anpassen, wobei zwei primäre Bewegungsparadigmen in einer Laborumgebung untersucht wurden - auf einer festen Oberfläche kriechen und in Flüssigkeit schwimmen. Diese stellen ein komplexes Zusammenspiel zwischen Empfindung, Motoneuronen und Muskeln dar. C. elegans-Modelle von ALS können in einem oder beiden dieser Bewegungsparadigmen eine Beeinträchtigung aufweisen. Dieses Protokoll beschreibt zwei empfindliche Assays zur Bewertung der Motilität in C. elegans: einen optimierten radialen Fortbewegungsassay, der das Crawlen auf einer festen Oberfläche misst, und eine automatisierte Methode zur Verfolgung und Analyse des Schwimmens in Flüssigkeit (Thrashing). Zusätzlich zur Charakterisierung der motorischen Beeinträchtigung von ALS-Modellen zu Studienbeginn können diese Assays eine Unterdrückung oder Verbesserung der Phänotypen durch genetische oder niedermolekulare Interventionen nachweisen. Daher haben diese Methoden einen Nutzen für die Untersuchung von ALS-Modellen und jedem C. elegans-Stamm , der eine veränderte Motilität aufweist.

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Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Dieses Protokoll beschreibt zwei empfindliche Assays zur Unterscheidung zwischen leichter, mittelschwerer und schwerer motorischer Beeinträchtigung in C. elegans-Modellen der amyotrophen Lateralsklerose, mit allgemeinem Nutzen für C. elegans-Stämme mit veränderter Motilität.

Evaluation der motorischen Beeinträchtigung bei C. elegans Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Unser Protokoll enthält zwei Assays, die die Bewegung von C.elegans quantifizieren. Diese Methoden bewerten Motilitätsphänotypen, wie sie von Modellen der Amyotrophen Lateralsklerose oder ALS gezeigt werden. Der Radial Locomotion Assay ist eine kostengünstige und einfache Methode zur Erkennung von Kriechen auf einer festen Oberfläche.Der Swimming Assay verwendet computergestütztes Tracking zur unvoreingenommenen Erkennung von Schlagbewegungen in Flüssigkeit. Diese Methoden sind nützlich, um Bewegungsunterschiede in C.elegans zu quantifizieren. Obwohl wir ALS untersuchen, können sie für jeden Stamm mit veränderter Motilität verwendet werden.Drehen Sie die NGM-Assay-Platten auf den Kopf. Und beschriften Sie den Boden mit einem Identifikator für die zu untersuchenden C.elegans-Stämme. Machen Sie einen kleinen Punkt mit dem Marker in der Mitte der umgedrehten Platte.Während Sie mit einem Seziermikroskop arbeiten, übertragen Sie Würmer in die Mitte der Assay-Platte. Und stellen Sie einen Timer für 30 Minuten ein. Legen Sie den Deckel wieder auf den Teller und legen Sie ihn beiseite.Setzen Sie die Übertragung von Würmern fort, bis sich alle Stämme auf den dafür vorgesehenen Testplatten befinden. Beginnen Sie nach 30 Minuten mit der Ritzung der ersten Platte, indem Sie den Deckel entfernen und die Platte mit der Vorderseite nach unten unter das Seziermikroskop legen. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis alle Würmer durch die Schnecke sichtbar sind.Verwenden Sie einen andersfarbigen Filzstift vom Mittelpunkt aus, setzen Sie einen kleinen Punkt an die Position jedes Wurms. Überprüfen Sie den Rand der Platte, da einige Würmer dort landen können. Zählen und notieren Sie auch, wie viele Würmer sich nicht vom Mittelpunkt bewegt haben.Messen Sie den Abstand vom Mittelpunkt bis zu den endgültigen Positionsmarkierungen für jeden Wurm und zeichnen Sie den Abstand mit einem Lineal auf. Der erste Wurmpunkt ist mit einem Bindestrich markiert. Zeichnen Sie die Längendaten für jeden Punkt nacheinander auf, indem Sie die Platte im Uhrzeigersinn drehen.Öffnen Sie die zugehörige Software, um die Videos einzurichten und aufzunehmen. Klicken Sie auf das Videoaufnahmesymbol. Drücken Sie auf den Dimmerknopf und drehen Sie ihn im Uhrzeigersinn, um das Licht einzustellen.Klicken Sie im Videoaufnahmefenster auf die Registerkarte Einstellungen und passen Sie den Videomodus auf 2456x2052_Mono8, die Bildrate auf 14 und die Ausgabe als Monochrom an. Belichtung von 0,00300 Sekunden. Verstärkung bis 1 dB.Gamma zu eins. Und drehen Sie auf 180. Wechseln Sie zurück zur Registerkarte Aufnahme, wählen Sie den Aufnahmeordner aus und weisen Sie einen Dateinamen zu, indem Sie ihn in das Textfeld Dateipräfix eingeben.Legen Sie andere Aufnahmeeinstellungen wie Puffer auf 128 Frames und Dauer auf eine Minute fest. Legen Sie die Assay-Platte auf die Gerätebühne und zentrieren Sie sie auf dem Videoaufnahmebildschirm, und entfernen Sie dann den Deckel. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 50 Würmer in 1 ml M9 auf die Assay-Platte zu waschen.Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Tiere in die Mitte zu bringen, oder verwenden Sie eine Mikropipette, um ein paar Tropfen M9 hinzuzufügen, um die Tiere zu trennen. Stellen Sie einen Timer für 60 Sekunden ein, damit sich Würmer an das Schwimmen gewöhnen können. Stellen Sie den Lichtregler so ein, dass das Display ohne Überbelichtung so hell wie möglich ist.Passen Sie den Kamerafokus manuell an, indem Sie den Fokussierring am Objektivgehäuse der Kamera drehen, während Sie das Display betrachten. Nach 60 Sekunden drücken Sie die Aufnahmetaste, wählen Sie die erste Taste im Workflow-Menü "Bildsequenz importieren" und suchen und doppelklicken Sie auf ein Video. Wählen Sie im Workflow-Menü Sequenzinformationen festlegen aus"Überprüfen Sie im neuen Menüfenster das Benennungsschema, fügen Sie Notizen hinzu und validieren Sie Metadaten.Wählen Sie "Bild anpassen" und ein neues Popup-Menü mit dem Namen "Bildanpassungen" wird geöffnet. Passen Sie die Bildverarbeitungseinstellungen an, indem Sie die Hintergrundglättung auf 10, die Gaußsche Glättung auf fünf, das Füllen von Löchern auf zwei, den Filter für kleine Objekte auf Null und das Überspringen der Segmentierung der integralen Ableitung festlegen. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass die Tiere vollständig mit Grün gefüllt sind, sich aber dennoch vom Hintergrund unterscheiden.Klicken Sie dann auf "Übernehmen" Wählen Sie im Workflow-Menü "Erkennen und Verfolgen" drei bis sieben Würmer aus und klicken Sie auf der Registerkarte "Erkennung" auf die Schaltfläche "Würmer erkennen". Wechseln Sie zur Registerkarte Nachverfolgung. Aktivieren Sie in den Tracking-Parametern "Backtracking verwenden" und deaktivieren Sie "Würmer am Bildrand verfolgen".Legen Sie die maximal verfolgte Hypothese auf fünf fest. Stellen Sie den Tracking-Modus auf Schwimmen ein. Wechseln Sie zum Abschnitt "Erweiterte Einstellungen" und legen Sie die Frames fest, die Würmer die Grenze berühren können, auf 50.Frames-Würmer können sich bis zu 500 überlappen. Positionstoleranz bis 0,50. Und Formtoleranz bis 0,50.Speichern Sie diese Einstellungen und stellen Sie sie für alle Videos in einem Experiment bereit, indem Sie sie als Konfiguration speichern. Navigieren Sie zum Konfigurationsmanager im Menü des Symbols oben links und klicken Sie auf das Symbol "Speichern". Geben Sie dieser Konfiguration einen Namen und eine Beschreibung.Und klicken Sie auf Okay"Klicken Sie im Workflow-Menü auf Projekt speichern"Verfolgen Sie die Videos, indem Sie zum Workflow-Menü gehen und auf das Stapelsymbol klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" im Abschnitt "Dateiauswahl" dieses Stapelverarbeitungsmenüs. Navigieren Sie zu allen zu verarbeitenden Projektdateien, und wählen Sie sie aus.Klicken Sie dann auf Öffnen"Klicken Sie auf die Schaltfläche Start" und notieren Sie sich die grüne Fortschrittsanzeige in der ersten Datei. Lassen Sie zu, dass alle Dateien verarbeitet werden. Wenn alle gelesenen Dateien abgeschlossen sind, schließen Sie die Software.Wählen Sie Daten analysieren"Navigieren Sie zur Track-Zusammenfassung. Und verwenden Sie die Schaltfläche "Exportieren" unten rechts, um Daten in einem lesbaren Tabellenkalkulationsformat zu exportieren. Verwenden Sie die "Turn Count" und "Track Duration", um Die Umdrehungen pro Minute für jede Spur mithilfe von Tabellenkalkulationsfunktionen zu berechnen.Die unstimulierte Ausbreitung der entwicklungsbedingten L4-Larve von fünf verschiedenen Stämmen wurde mit dem Radial Locomotion Assay gemessen. Und grafisch als Mikrometer pro zurückgelegter Minute. Die als Balkendiagramme dargestellten Daten verdeutlichen die relativen Unterschiede zwischen den Dehnungen.Während die endgültige Verschiebung jedes Wurms, die innerhalb der Grafik dargestellt wird, es ermöglicht, die Variation innerhalb der Population besser zu visualisieren. Die Schwimmraten in Form von Schlag- oder Wellenfrequenz in der Flüssigkeit wurden mit unvoreingenommener computergestützter Bewertung und Analyse gemessen. Und grafisch dargestellt als Thrashes pro Minute.Die Balkendiagrammdaten machen relative Unterschiede zwischen Dehnungen leichter sichtbar. Während die Daten von jedem einzelnen bewerteten Wurm innerhalb der Grafik dargestellt werden, kann die Variation innerhalb der Population besser visualisiert werden. Im Radial Locomotion Assay unterschied sich der milde TDP-43-Stamm nicht signifikant vom Wildtyp-N2-Stamm.Im Swimming Assay unterschieden sich jedoch sowohl die milden als auch die starken TDP-43-Stämme nicht nur signifikant vom Wildtyp N2, sondern auch voneinander. Der ALS-mutierte TDP-43-Stamm hat eine schwere Kriechstörung durch Radial Locomotion und sie werfen keine Flüssigkeit ein. Der Tau-exprimierende Stamm hat schwere Beeinträchtigungen in der radialen Fortbewegung, kann aber im Swimming Assay schlagen.Der wichtigste Aspekt, der bei diesen Methoden zu berücksichtigen ist, ist die Aufrechterhaltung konsistenter Kontrollen zwischen Replikaten. Dies stellt sicher, dass Motilitätsschwankungen durch phänotypische Unterschiede und nicht durch Umweltbedingungen verursacht werden. Diese Methoden bieten eine umfassende Bewertung von zwei wichtigen C.elegans-Motilitätsparadigmen.Follow-up-Methoden könnten zusätzliche Verhaltenscharakterisierung, biochemische Analyse oder Untersuchung der Muskel- oder Neuronenfunktion umfassen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Forschung

Neurowissenschaften

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automatische Analyse von<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Verhalten mit CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Umfassendes Autopsieprogramm für Personen mit Multipler Sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...