Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

אנו מודים לסוקרים על הערות והצעות מועילות. אנו מודים לאלין סקסטון, ברנדון הנדרסון וג'ייד סטיר על הסיוע הטכני יוצא הדופן. אנו מודים לבריאן קריימר ורבקה קו על הסיוע בפיתוח המעשים הללו. חומר זה הוא תוצאה של עבודה הנתמכת במשאבים ושימוש במתקנים במערכת הבריאות של VA Puget. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני יוצאי צבא (VA) מעבדה ביו-רפואית מחקר ופיתוח שירות [מענק סקירת הצטיינות #I01BX004044 N.F.L.]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם גילויים.

קטר רדיאלי: הרזולוציה של מעש זה נשלטת בקלות על ידי שינוי משתנה הזמן. הגדלת משך הזמן מקלה על התבוננות בהבדלים בין בעלי חיים עם פנוטיפים חמורים, ובכך מזהה הבדלים עדינים. עם זאת, מכיוון שניסיון זה מודד עקירה, אם זמן ההסתה הוארך זמן רב מדי, בעלי חיים עם תנועתיות נורמלית, כגון N2, ייסעו לשולי הצלחת, והתנהגות חיפוש מזון תוביל לנסיגה. זה יקטין באופן מלאכותי את מדידת המרחק שעבר. פרקי זמן ארוכים מדי עלולים לגרום להיעלמותם של הבדלים בין זנים, במיוחד בין בעלי חיים עם פנוטיפים מוטוריים פחות חמורים, כמו בעלי חיים להיות מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת. קיצור משתנה הזמן ימנע מתולעים פעילות יותר למצוא את קצוות הלוח. שיטה זו אינה עוקבת אחר המרחק הכולל שעבר עבור כל תולעת, אלא דוחסת את המרחק שעבר עבור כל תולעת למרחק ליניארי ממרכז הצלחת. ככזה, הוא מטבעו פחות חזק מאשר שיטה המתעדת את אורך המסלול הכולל של תולעים בודדות. עם זאת, הבדיקה של הקטר הרדיאלי דורשת מעט מאוד הכשרת חוקרים, משתמשת בריאגנטים זולים יחסית הזמינים בדרך כלל ברוב מעבדות התולעים, והיא רגישה מספיק כדי לייצר תוצאות משמעותיות וניתן לשחזור. עבור מעבדות המעדיפות מעקב אוטומטי אחר וידאו, הוקמו בעבר מספר שיטות כדי לעקוב ולנתח תנועות סריקה12, או שניתן לשנות את פרמטרי התוכנה המשמשים לבדיקת השחייה במאמר זה כדי לאפשר זיהוי וניתוח סריקה.
ניסוי זה נעשה בדרך כלל בשכפולים עצמאיים משולשים, עם קבוצה של 30-40 תולעים לכל שכפול. כל שכפול מחולק לשתי לוחות שונים של 100 מ"מ או 150 מ"מ, עם 15-20 תולעים לצלחת. שימוש ביותר תולעים מהמומלץ לכל צלחת יכול להקשות על הניקוד ביעילות. מספר כולל של 90+ מופעל מספיק כדי לקבוע משמעות לפגיעה קלה, בינונית או חמורה בתנועתיות. להיות עקבי עם תזמון בין זנים ציון חיוני לדיוק רבייה. 30 דקות זה בדרך כלל מספיק זמן כדי ליצור הבדלים בין פנוטיפים בינוניים עד חמורים כמו זנים מהונדסים המבטאים מוטציה אנושית TDP-43 בהשוואה לתולעים מסוג בר (איור 4). אם משתנה הזמן יוארך, מומלץ גם להגדיל את גודל הצלחת מ 100 מ"מ ל 150 מ"מ. גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחות יכולים להשפיע על בדיקת ישבן זו, אשר מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורת החדר הסביבה, ולכן חשוב תמיד להשתמש בבקרה מסוג בר (N2) בעת השוואה בין שכפולים. בנוסף, זה בדיקות יכול למדוד את תנועתיות של כמה זנים שאינם מפגינים התנהגות שחייה נורמלית בנוזל (חבטות), מה שהופך אותו השלמה שימושית כדי assay השחייה.
שחייה: השימוש במערכת ההדמיה והרכישה כדי להפוך את המעקב והניתוח של שחייה בתולעים לאוטומטיים מאפשר נתונים קפדניים ובלתי משוחדים. עם זאת, ישנם מספר גורמים במהלך ההתקנה הראשונית של הניסוי כי צריך להיות נשלט בין דגימות. אלה כוללים את הזמן להתאקלם לנוזל לפני תחילת ההקלטה, תנאי סביבה (כלומר, טמפרטורה, לחות), והגדרות אור והקלטה עקביות. בשלב ההקלטה, ישנן מספר תכונות המסייעות להפחית את השונות בין הצלחות. אלה כוללים מצלמה משולבת המותקנת על מסלול ושלב שדה בהיר שהופך את הקלטת הווידאו לעקבית בין לוחות, סיכוך סביב הבמה המונע השתקפויות, בוהק ותנועות אוויר בזמן ההקלטה, וחבילת תוכנה חזקה המזהה באופן אמין תולעים ומאפשרת תיקון ידני של רצועות בעיבוד וידאו. בפרוטוקול זה, קטעי וידאו של צלחת 35 מ"מ עם תולעים נרשמים במשך 1 דקה ולאחר מכן מעובד באמצעות חבילת התוכנה. לאחר העיבוד, תיקון ידני של רצועות מבטיח שהתנהגויות תולעת תירשם במדויק מבלי לבלבל שגיאות מעקב. נתוני ספירת הספירה והמעקב משמשים לקביעת תורות לדקה כהקראה סופית. כדי להבטיח רבייה, הנתונים נאספים על פני מינימום של 3 ניסויי שכפול עצמאיים, כל אחד עם 40-50 בעלי חיים ציון, כדי להשיג מספר סופי משולב של בעלי חיים 120-150. מספר זה מספיק כדי להפלות הבדלים קטנים בהתנהגות השחייה מתולעי בקרה. לחלק מהתולעים יש ליקויים מוטוריים חמורים מכדי להיתפס על ידי עשייה שוחה. לדוגמה, אם בעלי החיים ממוקמים בתלתל בינוני נוזלי במקום לבצע את התגובה החבטות הצפויה, תם זה לא לתעד תנועות אלה במדויק ובוחן תנועה אחר, כגון תנועה רדיאלית, עשוי ללכוד טוב יותר את פגמי תנועתיות אלה. הפרוטוקול שסופק משתמש במערכת הדמיה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים נוספים), אך מערכות מעקב אחר תולעים אחרות עשויות לספק כלי דומה, כאשר חלקן מקורות פתוחים12. שיטות שפורסמו בעבר מתארות ניקוד ידני של תולעת thrashing13. בעוד שהניתוח האוטומטי מייצר מספר מדדים עבור כל תולעת בודדת, זיהוי כיפופי גוף הנמדדים בתהכים לדקה, מספק תוצאות עקביות בין ניסויים ומעקבים היטב עם ניקוד קונבנציונלי של תולעים thrashes בעין.

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא מחלה נוירודגנרטיבית מתישה הקשורה להזדקנות עם השפעה מיוחדת על נוירונים מוטוריים. המחלה כוללת אובדן נוירונים מוטוריים במוח ובחוט השדרה ופגיעה מוטורית מתקדמת. התוצאה היא נכות תפקודית גדולה ומוות בטרם עת, בדרך כלל בתוך 3-5 שנים לאחר האבחון1. מוטציות בלפחות 38 גנים יכולות לגרום ל- ALS; עם זאת, רוב החולים עם ALS לצבור בכל מקום תכלילים של חלבון TDP-43 כמו הפתולוגיה העיקרית שלהם נוירונים ותאי גליה2,3,4. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים הגורמים או תורמים ALS in vivo (נבדק ב5). ב- C. elegans, מודלים אלה כוללים מוטציות גנטיות של אובדן תפקוד בהומולוגים של גנים הגורמים ל- ALS או ביטוי מהונדס של גנים אנושיים של ALS. ישנם יתרונות רבים לדגמן ALS ב C. elegans. C. elegans הם חיה פשוטה ומתיחה עם מערכת עצבים מובחנת, פרדיגמות התנהגותיות מאופיינות היטב, והומולוגיה גנטית ניכרת לבני אדם6,7. קיימים כלים רבים לעבודה עם C. elegans, כולל יכולות עריכת גנום חזקות, בכתבים פלואורסצנטיים של ניוון עצבי, פרדיגמות סינון RNAi, גנטיקה מתיחה, ובדיקות התנהגותיות ופנוטיפיות מבוססות. ג. מודלים אלגנס של ALS recapitulate היבטים של מחלות אנושיות, כולל הצטברות של חלבון מסיס, ניוון עצבי, ומוות מוקדם8,9. יתר על כן, תפקוד מוטורי הכולל הפרעה של התנהגויות זחילה ושחייה קיים במודלים רבים של C. elegans ALS.
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לאפיון פנוטיפים מוטוריים C. elegans : בחן הקטר הרדיאלי להערכת זחילה על משטח מוצק והערכת שחייה בנוזל (חבטות) באמצעות מעקב וניתוח אוטומטיים של WormLab. שיטות רגישות אלה לאפיון ליקויים מוטוריים מאפשרות השוואות של חומרה ומציעות כלים למדידת דיכוי ושיפורים של פנוטיפים מוטוריים. תנועת הקטר הרדיאלית מסמיכה הבדלים בתנועתיות זוחלת (תנועה סינוסורלית על משטח מוצק) בין אוכלוסיות של תולעים. בדיקה זו מנצלת את התנהגות המחקר הטבעית של C. elegans unstimulated על ידי הצבת תולעים במיקום אחד על צלחת וסימון מיקומם הסופי לאחר פרק זמן נתון10. לחלופין, שחייה בנוזל (חבטות) ספירת כיפופי גוף של תולעים בודדות לאורך פרק זמן מוגדר. הספירה הידנית של כיפופי הגוף על ידי העין האנושית היא עתירת זמן ובדרך כלל מציגה שונות ניכרת בין הנסיינים. השימוש במעקב וניתוח אוטומטיים בסיוע מחשב יכול לחסל חלק גדול מההשתנות הזו. בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, הן קטר רדיאלי והן בדיקות שחייה יכולות לזהות אפנון של פנוטיפים לוקומוטוריים מובחנים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

המחלה הנוירודגנרטיבית אמיוטרופית אמיוטרופית טרשת לרוחב (ALS) תכונות אובדן הדרגתי של נוירונים מוטוריים מלווה בחולשת שרירים ופגיעה מוטורית המחמירה עם הזמן. בעוד התקדמות ניכרת נעשתה בקביעת מניעים גנטיים של ALS עבור תת קבוצה של חולים, רוב המקרים יש אטיולוגיה לא ידועה. יתר על כן, המנגנונים שבביסת תפקוד לקוי של נוירון מוטורי והתנוונות אינם מובנים היטב; לכן, יש צורך מתמשך לפתח ולאפיין מודלים מייצגים ללמוד תהליכים אלה. אלגנים Caenorhabditis יכול להתאים את תנועתם לאילוצים הפיזיים של סביבתם, עם שתי פרדיגמות תנועה עיקריות נחקרו בסביבת מעבדה - זוחל על משטח מוצק ושוחה בנוזל. אלה מייצגים יחסי הגומלין מורכבים בין תחושה, נוירונים מוטוריים ושרירים. ג. מודלים אלגנס של ALS יכולים להפגין ליקוי באחת פרדיגמות התנועה האלה או בשתיהן. פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להערכת תנועתיות ב - C. elegans: מתקן קטר רדיאלי ממוטב המודד זחילה על משטח מוצק ושיטה אוטומטית למעקב וניתוח שחייה בנוזל (חבטות). בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, בדיקות אלה יכולות לזהות דיכוי או שיפור של הפנוטיפים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. לכן, שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

הפרוטוקול שלנו מציג שתי גישות, כימות תנועת C.elegans. שיטות אלה להעריך פנוטיפים תנועתיות כגון אלה המוצגים על ידי מודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב, או ALS. הפחתת הקטר הרדיאלית היא שיטה חסכונית וקלה לזיהוי זחילה על משטח מוצק.ה-Swimming Assay משתמש במעקב מבוסס מחשב לגילוי לא משוחד של תנועות חבטות בנוזל. שיטות אלה שימושיות לכימות הבדלי תנועה ב- C.elegans. למרות שאנו לומדים ALS, הם יכולים לשמש עבור כל זן עם תנועתיות שונה.הפוך את לוחות ההסתה של NGM. ולסמן את התחתית עם מזהה לזני C.elegans שיש לתייג. הפוך נקודה קטנה עם הסמן במרכז הצלחת ההפוכה.תוך כדי עבודה עם מיקרוסקופ מנתח, העבר תולעים למרכז צלחת ה- assay. ותקבע שעון שעון במשך 30 דקות. מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת ומניחים אותו בצד.ממשיכים להעביר תולעים עד שכל הזנים נמצאים על לוחות ההסתה המיועדים. לאחר 30 דקות, להתחיל להבקיע את הצלחת הראשונה על ידי הסרת המכסה והנחת הצלחת עם הפנים כלפי מטה תחת המיקרוסקופ הניתוח. כוונן את מוקד המיקרוסקופ עד שכל התולעים ייראות דרך האוגר.באמצעות עט קצה לבד בצבע אחר מנקודת המרכז, שים נקודה קטנה במיקום של כל תולעת. בדוק את קצה הצלחת כמו כמה תולעים עלולות בסופו של דבר שם. כמו כן, לספור ולתעד כמה תולעים לא זזו מנקודת המרכז.מדוד את המרחק מנקודת המרכז לסימוני המיקום הסופיים עבור כל תולעת, ותיעד את המרחק באמצעות סרגל. נקודת התולעת הראשונה מסומנת בלוח דש. תעד נתוני אורך עבור כל נקודה ברציפות על-ידי סיבוב הלוח בצורה בכיוון השעון.פתח את התוכנה המשויכת כדי להגדיר ולהקליט את סרטוני הווידאו. לחץ על סמל לכידת הווידאו. לחץ על ידית העמעום וסובב אותה בכיוון השעון כדי לכוונן את האור.בחלון לכידת הווידאו, לחץ על כרטיסיית ההגדרות והתאם את מצב הווידאו 2456x2052_Mono8, קצב הפריימים ל- 14, פלט כמונוכרום. חשיפה של 0.00300 שניות. רווח ל-1 די.בי.גמא לאחד. ותסובב ל-180. חזור לכרטיסיה לכידה, בחר את תיקיית ההקלטה והקצה שם קובץ על-ידי הזנתו לתיבת הטקסט של קידומת הקובץ.הגדר הגדרות לכידה אחרות כגון מאגר, ל- 128 מסגרות ומשך דקה אחת. הנח את צלחת בדיקת ה- assay מוארת על במת המכשיר ומרכז אותה במסך לכידת הווידאו ולאחר מכן הסר את המכסה. השתמש micropipette לשטוף כ 50 תולעים ב 1 מ"ל של M9 על צלחת בדיקות.מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להביא את בעלי החיים למרכז, או להשתמש micropipette להוסיף כמה טיפות של M9 כדי להפריד את בעלי החיים. הגדר טיימר במשך 60 שניות כדי לאפשר לתולעים להתאקלם לשחייה. התאם את ידית האור כך שהצג יהיה בהיר ככל האפשר ללא חשיפת יתר.כוונן ידנית את מוקד המצלמה על-ידי הפיכת טבעת המיקוד על גוף העדשה של המצלמה, תוך כדי צפייה בתצוגה. לאחר 60 שניות לחץ על לחצן הרשומה, בחר את הלחצן הראשון בתפריט זרימת העבודה ייבוא רצף תמונות", ומצא ולחץ פעמיים על וידאו. מתפריט זרימת העבודה בחר הגדר פרטי רצף"בחלון התפריט החדש בדוק את ערכת מתן השמות, הוסף הערות ואמת מטה-נתונים.בחרו 'התאם תמונה' ותפריט נפתח חדש בשם 'התאמות תמונה'. התאם את הגדרות עיבוד התמונה על-ידי הגדרת החלקת הרקע ל- 10, החלקה גסית לחמש, מילוי חורים לשניים, מסנן אובייקט קטן לאפס ודילוג על פילוח נגזר אינטגרלי. התאם את רמת הסף כך שבעלי החיים מלאים לחלוטין בירוק, אך עדיין נבדלים מהרקע.לאחר מכן לחץ על החל"מתפריט זרימת העבודה, בחר זהה ועקוב", בחר שלוש עד שבע תולעים ולחץ על לחצן זיהוי תולעים" בכרטיסיית הזיהוי. עבור לכרטיסיה מעקב. בפרמטרים של המעקב, סמן את השתמש במעקב לאחור" ובטל את הסימון לעקוב אחר תולעים בקצה התמונה.הגדר את ההשערה המרבית למעקב לחמש. הגדר את מצב המעקב לשחייה. מעבר למקטע ההגדרות המתקדמות והגדר את המסגרות תולעים יכולות לגעת בגבול ל- 50.תולעי מסגרות יכולות לחפוף ל-500. מיקום עמידות ל 0.50. וסובלנות צורה ל-0.50.שמור הגדרות אלה ופרוס אותן עבור כל סרטוני הווידאו בניסוי על-ידי שמירתן כתצורה. נווט אל מנהל התצורה בתפריט הסמל הימני העליון ולחץ על סמל שמור". תן לתצורה זו שם ותיאור.ולחץ על אישור"בתפריט זרימת העבודה, לחץ על שמור פרוייקט"עקוב אחר קטעי הווידאו על ידי הולך לתפריט זרימת העבודה ולחץ על סמל אצווה". לחץ על לחצן הוסף", תחת המקטע בחירת קבצים בתפריט עיבוד אצווה זה. נווט אל כל קבצי הפרוייקט שיש לעבד ובחר אותם.לאחר מכן לחץ על פתח"לחץ על לחצן התחל", ושים לב למחוון ההתקדמות הירוקה בקובץ הראשון. אפשר עיבוד של כל הקבצים. לאחר סיום כל הקבצים שנקראו, סגור את התוכנה.בחר ניתוח נתונים"נווט לסיכום הרצועה. והשתמש בלחצן ייצוא בפינה השמאלית התחתונה כדי לייצא נתונים בתבנית הניתנת לקריאה בגיליון אלקטרוני. השתמש בספירת הסיבובים ובמשך המעקב כדי לחשב תורות לדקה עבור כל רצועה באמצעות פונקציות יריעות כפולות.פיזור לא מוגדר של זחל L4 מבוים התפתחותית של חמישה זנים שונים, נמדד באמצעות אסיית הקטר הרדיאלי. וגרף כמו מיקרו מטר לדקה נסע. הנתונים המוצגים תרשימי עמודות מבהירים את ההבדלים היחסיים בין הזנים.בעוד שהעקירה הסופית של כל תולעת המתוותת בתוך הגרף, מאפשרת לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. שיעורי השחייה במונחים של חבטות או תדירות גלגול בנוזל, נמדדו באמצעות ניקוד וניתוח לא משוחדים בסיוע מחשב. וגרף כמו חבטות לדקה.נתוני גרף העמודות הופכים את ההבדלים היחסיים בין זנים לקלים יותר לצפייה. בעוד שנתונים מכל תולעת בודדת שציון שלהם מתווים בתוך הגרף, ומאפשרים לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. ב- Radial Locomotion Assay, זן TDP-43 קל לא היה שונה באופן משמעותי מזן N2 מסוג בר.עם זאת, בשחייה Assay, הן זני TDP-43 מתון וחזק לא רק שונים באופן משמעותי מן N2 סוג פראי, אלא גם אחד מהשני. זן TDP-43 מוטציה ALS יש ליקוי זחילה חמור על ידי קמצנות רדיאלית, והם לא חבטות בנוזל. לזן הטא-מבטא יש ליקויים חמורים בקטר רדיאלי, אך הוא עלול להכות באסי השחייה.ההיבט החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון בשיטות אלה, הוא שמירה על פקדים עקביים בין שכפולים. זה מבטיח כי וריאציות תנועתיות נגרמות על ידי הבדלים פנוטיפיים ולא תנאים סביבתיים. שיטות אלה מספקות הערכה מקיפה של שתי פרדיגמות תנועתיות ראשיות של C.elegans.שיטות מעקב יכולות לכלול אפיון התנהגותי נוסף, ניתוח ביוכימי או חקירה של תפקוד שרירים או נוירונים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

ניתוח אוטומטי של<em&gt; C. elegans</em&gt; התנהגות שח שימוש CeleST תוכנה

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

שלאחר המוות תוכנית מקיפה עבור אנשים עם טרשת נפוצה

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...