Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Ringraziamo i recensori per i commenti e i suggerimenti utili. Ringraziamo Aleen Saxton, Brandon Henderson e Jade Stair per l'eccezionale assistenza tecnica. Ringraziamo Brian Kraemer e Rebecca Kow per l'assistenza nello sviluppo di questi test. Questo materiale è il risultato del lavoro supportato con risorse e l'uso delle strutture del VA Puget Sound Health Care System. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione degli Stati Uniti (USA) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 a N.F.L.]

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Gli autori dichiarano di non avere divulgazioni.

Locomozione radiale: La risoluzione di questo test è facilmente controllabile modificando la variabile temporale. Aumentare il periodo di tempo rende più facile osservare le differenze tra animali con fenotipi gravi, identificando così sottili differenze. Tuttavia, poiché questo test misura lo spostamento, se il tempo di analisi è esteso troppo a lungo, gli animali con motilità normale, come N2, viaggeranno verso i bordi della piastra e il comportamento di foraggiamento porterà al backtracking. Ciò ridurrà artificialmente la misurazione della distanza percorsa. Periodi di tempo troppo lunghi possono comportare la scomparsa delle differenze tra i ceppi, in particolare tra gli animali con fenotipi motori meno gravi, poiché gli animali diventano uniformemente dispersi attraverso la piastra. Accorciare la variabile temporale impedirà ai vermi più attivi di trovare i bordi della piastra. Questo metodo non tiene traccia della distanza totale percorsa per ciascun verme, ma comprime la distanza percorsa per ciascun verme in una distanza lineare dal centro della piastra. Come tale, è intrinsecamente meno robusto di un metodo che registra la lunghezza totale della traccia dei singoli worm. Tuttavia, il test di locomozione radiale richiede pochissima formazione da parte dei ricercatori, utilizza reagenti relativamente convenienti che sono comunemente disponibili nella maggior parte dei worm lab ed è abbastanza sensibile da produrre risultati significativi e riproducibili. Per i laboratori che preferiscono il monitoraggio video automatizzato, sono stati precedentemente stabiliti diversi metodi per tracciare e analizzare i movimenti di scansione12, oppure i parametri software utilizzati per il test di nuoto in questo documento potrebbero essere modificati per consentire il rilevamento e l'analisi della scansione.
Questo esperimento viene solitamente eseguito in repliche indipendenti triplicate, con un insieme di 30-40 worm per replica. Ogni replica è divisa su due diverse piastre da 100 mm o 150 mm, con 15-20 vermi per piastra. L'uso di più vermi di quelli raccomandati per piatto può rendere difficile segnare in modo efficiente. Un numero totale di 90+ è sufficientemente potenziato per stabilire il significato per la compromissione della motilità lieve, moderata o grave. Essere coerenti con i tempi tra i ceppi valutati è essenziale per l'accuratezza e la riproducibilità. 30 minuti sono generalmente sufficienti per stabilire differenze tra fenotipi da moderati a gravi come i ceppi transgenici che esprimono TDP-43 mutante umano rispetto ai vermi wild-type (Figura 4). Se la variabile temporale verrà estesa, è consigliabile aumentare anche la dimensione della piastra da 100 mm a 150 mm. Fattori ambientali come la temperatura e l'umidità possono influenzare questo test, che viene tipicamente condotto a temperatura ambiente, quindi è importante utilizzare sempre un controllo wild-type (N2) quando si confrontano tra le repliche. Inoltre, questo test può misurare la motilità di alcuni ceppi che non mostrano un normale comportamento di nuoto nel liquido (thrashing), rendendolo un utile complemento al test di nuoto.
Test di nuoto: L'uso del sistema di imaging e acquisizione per automatizzare il tracciamento e l'analisi del nuoto dei vermi consente di ottenere dati rigorosi e imparziali. Tuttavia, ci sono diversi fattori durante la configurazione iniziale dell'esperimento che devono essere controllati tra i campioni. Questi includono il tempo di acclimatarsi al liquido prima di iniziare la registrazione, le condizioni ambientali (ad esempio, temperatura, umidità) e la luce costante e le impostazioni di registrazione. Nella fase di registrazione, ci sono diverse caratteristiche che aiutano a ridurre la variabilità tra le piastre. Questi includono una telecamera integrata montata su traccia e uno stadio a campo luminoso che rende la registrazione video coerente tra le lastre, schermatura attorno al palco che impedisce riflessi, abbagliamento e movimenti d'aria durante la registrazione e un robusto pacchetto software che rileva in modo affidabile i worm e consente la correzione manuale delle tracce nella post-elaborazione video. In questo protocollo, i video di una piastra da 35 mm con worm vengono registrati per 1 minuto e quindi elaborati utilizzando il pacchetto software. Dopo l'elaborazione, la correzione manuale delle tracce garantisce che i comportamenti dei worm vengano registrati in modo accurato senza confondere gli errori di tracciamento. I dati relativi al conteggio dei turni e alla durata della traccia vengono utilizzati per determinare i turni al minuto come lettura finale. Per garantire la riproducibilità, i dati vengono raccolti su un minimo di 3 esperimenti di replica indipendenti, ciascuno con 40-50 animali valutati, per ottenere un numero finale combinato di animali 120-150. Questo numero è sufficiente per discriminare piccole differenze nel comportamento di nuoto dai vermi di controllo. Alcuni vermi hanno deficit motori troppo gravi per essere catturati da saggi di nuoto. Ad esempio, se gli animali vengono posti in un arricciatura media liquida invece di eseguire la risposta di thrashing prevista, questo test non registrerà accuratamente quei movimenti e un altro test di movimento, come la locomozione radiale, potrebbe catturare meglio quei difetti di motilità. Il protocollo fornito utilizza un sistema di imaging disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali per maggiori dettagli), ma altri sistemi di tracciamento dei worm possono fornire un'utilità simile, con alcuni open source12. I metodi pubblicati in precedenza descrivono il punteggio manuale del worm thrashing13. Mentre l'analisi automatizzata produce una serie di metriche per ogni singolo worm, il rilevamento delle curve del corpo che viene misurato in thrashes al minuto, fornisce risultati coerenti tra esperimenti e tracce ben con il punteggio convenzionale dei worm thrashes a occhio.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa debilitante, correlata all'invecchiamento, con un particolare impatto sui motoneuroni. La malattia presenta perdita di motoneuroni nel cervello e nel midollo spinale e compromissione motoria progressiva. Ciò si traduce in grave disabilità funzionale e morte prematura, in genere entro 3-5 anni dalla diagnosi1. Mutazioni in almeno 38 geni possono causare la SLA; tuttavia, la maggior parte dei pazienti con SLA accumula inclusioni ubiquitinate della proteina TDP-43 come patologia primaria nei neuroni e nelle cellule gliali2,3,4. Un certo numero di modelli animali sono stati sviluppati per studiare i meccanismi sottostanti che causano o contribuiscono alla SLA in vivo (esaminato in 5). In C. elegans, questi modelli includono mutazioni genetiche di perdita di funzione negli omologhi di geni che causano la SLA o l'espressione transgenica di geni umani della SLA. Ci sono numerosi vantaggi nel modellare la SLA in C. elegans. C. elegans è un animale semplice trattabile con un sistema nervoso differenziato, paradigmi comportamentali ben caratterizzati e una notevole omologia genetica per l'uomo6,7. Esistono molti strumenti per lavorare con C. elegans, tra cui robuste capacità di editing del genoma, reporter fluorescenti in vivo di neurodegenerazione, paradigmi di screening RNAi, genetica trattabile e saggi comportamentali e fenotipici stabiliti. I modelli di C. elegans della SLA ricapitolano aspetti della malattia umana, tra cui l'accumulo di proteine insolubili, la neurodegenerazione e la morte precoce8,9. Inoltre, la disfunzione motoria con disturbi dei comportamenti di gattonare e nuotare è presente in molti modelli di SLA di C. elegans.
Questo protocollo descrive due metodi per caratterizzare i fenotipi motori di C. elegans : il test di locomozione radiale per valutare il crawling su una superficie solida e la valutazione del nuoto in liquido (thrashing) utilizzando il tracciamento e l'analisi automatizzati di WormLab. Questi metodi sensibili per caratterizzare i deficit motori consentono confronti di gravità e offrono strumenti per misurare la soppressione e i miglioramenti dei fenotipi motori. Il test di locomozione radiale quantifica le differenze nella motilità strisciante (movimento sinusoidale su una superficie solida) tra le popolazioni di vermi. Questo test sfrutta il comportamento naturale di esplorazione non stimolata di C. elegans posizionando i vermi in una singola posizione su una piastra e segnando la loro posizione finale dopo un determinato periodo di tempo10. In alternativa, il nuoto in saggi liquidi (thrashing) conta le curve del corpo dei singoli vermi per un determinato periodo di tempo. Il conteggio manuale delle curve del corpo da parte dell'occhio umano richiede molto tempo e in genere presenta una notevole variabilità tra gli sperimentatori. L'uso del monitoraggio e dell'analisi automatizzati assistiti da computer può eliminare gran parte di tale variabilità. Oltre alla caratterizzazione della compromissione motoria al basale dei modelli di SLA, sia la locomozione radiale che i saggi di nuoto possono rilevare la modulazione di fenotipi locomotori distinti da interventi genetici o di piccole molecole. Questi metodi hanno utilità per studiare i modelli di SLA e qualsiasi ceppo di C. elegans che presenta una motilità alterata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

La malattia neurodegenerativa sclerosi laterale amiotrofica (SLA) presenta una progressiva perdita di motoneuroni accompagnata da debolezza muscolare e compromissione motoria che peggiora con il tempo. Mentre sono stati fatti notevoli progressi nel determinare i driver genetici della SLA per un sottogruppo di pazienti, la maggior parte dei casi ha un'eziologia sconosciuta. Inoltre, i meccanismi alla base della disfunzione e della degenerazione dei motoneuroni non sono ben compresi; pertanto, vi è una continua necessità di sviluppare e caratterizzare modelli rappresentativi per studiare questi processi. Caenorhabditis elegans può adattare il loro movimento ai vincoli fisici dell'ambiente circostante, con due paradigmi di movimento primari studiati in un ambiente di laboratorio: strisciare su una superficie solida e nuotare nel liquido. Questi rappresentano una complessa interazione tra sensazione, motoneuroni e muscoli. I modelli di C. elegans della SLA possono mostrare compromissione in uno o entrambi questi paradigmi di movimento. Questo protocollo descrive due saggi sensibili per valutare la motilità in C. elegans: un saggio di locomozione radiale ottimizzato che misura la strisciatura su una superficie solida e un metodo automatizzato per tracciare e analizzare il nuoto nel liquido (thrashing). Oltre alla caratterizzazione della compromissione motoria al basale dei modelli di SLA, questi saggi possono rilevare la soppressione o il miglioramento dei fenotipi da interventi genetici o di piccole molecole. Pertanto, questi metodi hanno utilità per studiare i modelli di SLA e qualsiasi ceppo di C. elegans che presenta una motilità alterata.

Sia la locomozione radiale che i saggi di nuoto offrono un rilevamento sensibile della compromissione della motilità (Figura 4 e Figura 5). Per studiare i meccanismi alla base del TDP-43 patologico nella SLA, sono stati sviluppati modelli di C. elegans che esprimono panneurnalmente il TDP-43 umano wild-type o ALS-mutante. Questi animali mostrano caratteristiche molecolari e cellulari che ricordano la SLA, compresa la disfunzione motoria9. È importante sottolineare che mostrano una moderata compromissione della motilità con l'espressione di TDP-43 umano wild-type e una compromissione della motilità più grave negli animali che esprimono TDP-43 mutante della SLA utilizzando sia la locomozione radiale che i saggi di nuoto. Alcuni animali mutanti o transgenici avranno una maggiore compromissione nel gattonare rispetto al nuoto, o viceversa. Utilizzando due diversi saggi di motilità, si ottiene un quadro più chiaro delle differenze fenotipiche tra i ceppi.
Locomozione radiale Quando viene posto su un piatto di agar seminato, C. elegans esplora l'ambiente circostante, anche cercando i confini della loro fonte di cibo. I test di locomozione radiale sono un modo per sfruttare quel comportamento come metrica per la forma fisica. Analizzando il comportamento locomotore (strisciando su una superficie solida) in modo controllato e quantificabile, il test locomotore radiale offre uno strumento semplice ed efficace per valutare la gravità dei deficit motori e di altri fenotipi legati al motore. I saggi di locomozione radiale catturano le differenze di motilità nei vermi modello di SLA moderatamente o gravemente compromessi e offrono una linea di base per confrontare la modulazione dei fenotipi della motilità o i cambiamenti nella motilità con l'età (Figura 6). Questa strategia può essere applicata per quantificare il comportamento di strisciamento di qualsiasi ceppo che ha alterato il movimento da wild type (N2) o vermi di controllo. Tuttavia, questo metodo potrebbe non essere una buona scelta per valutare gli animali incapaci di strisciare normalmente, come i mutanti a rulli o gli animali paralizzati. Tipicamente, i vermi wild-type presentano uno spostamento medio tra 200-300 μm/min quando vengono sollevati e testati a 20 °C. I dati di esempio presentati nella Figura 4 mostrano risultati attesi confrontando N2, due diversi ceppi transgenici che esprimono TDP-43 umano wild-type con un fenotipo lieve [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] o fenotipo più forte [TDP-43(WT-moderato), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], un ceppo transgenico che esprime TDP-43 umano mutante con fenotipo grave [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), e un ceppo transgenico che esprime un'altra proteina associata a malattie neurodegenerative, la tau umana wild-type [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. I due ceppi che esprimono TDP-43 wild-type hanno diversi gradi di compromissione rilevati dalla locomozione radiale. TDP-43 (WT-low) non è significativamente diverso da N2, mentre TDP-43 (WT-high) mostra chiare differenze nella motilità. I ceppi TDP-43 (M337V) e tau (WT) hanno menomazioni più gravi nella motilità.
Saggio di nuoto C. elegans si impegna in movimenti stereotipati di nuoto (thrashing) quando sono immersi nel liquido. Immediatamente dopo l'immersione, i vermi iniziano a piegare tipicamente la testa e la coda l'una verso l'altra con un angolo di curvatura di circa 45 °, con il vertice angolare che è il punto medio del verme. I vermi alternano la flessione nelle direzioni ventrale e dorsale. Un thrash, misurato dal software, rappresenta il movimento di passare da un angolo di piegatura del corpo di 20° o superiore, indipendentemente dalla direzionalità (la soglia angolare può essere regolata in post-elaborazione all'interno della finestra Analisi e stampa [Workflow | Analizzare i dati | Forma del corpo | Angolo di piegatura | | a metà punto Soglia di ampiezza: # gradi]. Il test di nuoto qui descritto utilizza il monitoraggio e l'analisi automatizzati basati su computer per fornire un punteggio imparziale dell'attività di nuoto. Si prevede che i vermi wild-type (N2) avranno una media di 150-200 thrashes al minuto quando sollevati e registrati a 20 °C. I dati di esempio presentati nella Figura 5 mostrano i risultati attesi confrontando N2, due diversi ceppi transgenici che esprimono TDP-43 umano wild-type con un fenotipo lieve [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] o fenotipo più forte [TDP-43(WT-moderato), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], e un ceppo transgenico che esprime un'altra proteina associata a malattie neurodegenerative, la tau umana wild-type [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Il ceppo transgenico che esprime il mutante ALS TDP-43 [TDP-43(M337V)] non si scioglie nel liquido, e quindi è indicato sul grafico come ND (nessun dato). Questo test può discriminare fenotipi diversi rispetto al test di locomozione radiale mostrato nella Figura 4. Ad esempio, nel test di locomozione radiale (Figura 4), TDP-43 (WT-low) non era significativamente diverso da N2. Tuttavia, nel test di nuoto (Figura 5), sia TDP-43 (WT-low) che TDP-43 (WT-high) sono significativamente diversi da N2, oltre che significativamente diversi l'uno dall'altro. Inoltre, nonostante sia TDP-43 (M337V) che tau (WT) abbiano gravi disturbi di scansione da locomozione radiale (Figura 4), solo tau (WT) è in grado di thrash abbastanza da essere tracciato dal software (Figura 5). Gli animali TDP-43 (M337V) non sono in grado di colpire e l'analisi basata su software non rileva o traccia questi vermi in modo accurato. Pertanto, i dati su questi worm non sono stati raccolti (ND, nessun dato).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro del saggio di locomozione radiale. I pannelli A-E mostrano le fasi generalizzate del test di locomozione radiale. I passaggi sono i seguenti: (A) Le piastre NGM, con OP50 seminato ai bordi, sono preparate etichettando e contrassegnando il punto centrale, (B) i vermi sono posizionati al centro dell'agar come contrassegnato dal punto centrale, (C) i vermi sono autorizzati a muoversi liberamente per un determinato periodo di tempo, (D) la piastra è capovolta dal basso verso l'alto e la posizione finale di ciascun verme è contrassegnata in un colore diverso dal punto centrale, (E) La distanza dal punto centrale a ciascuna posizione finale del worm misurata a mano o digitalmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg"> Figura 2: Misurazione digitale della posizione finale utilizzando ImageJ.  La distanza dalle misurazioni centrali può essere misurata a mano o digitalmente, per misurare digitalmente utilizzando la scansione ImageJ (A) sul retro della piastra con un righello nella cornice. (B) Disegnare una lunghezza nota utilizzando lo strumento linea. (C) Utilizzare la lunghezza nota disegnata in (B) per impostare la scala [Analizza | Imposta Scala...]. (D) Utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea dal punto centrale a un segno di posizione finale, ripetere per ogni segno. (E) Una linea di pennello che segna il primo segno misurato aiuta a segnare (linea nera ondulata vicino al segno 1). I segni di posizione finali sono numerati in giallo per illustrare la direzionalità del punteggio. (F) Le misurazioni sono registrate nella finestra Risultati. Salva i risultati altrove per l'analisi statistica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg"> Figura 3: Regolazioni dei materiali e dell'hardware per l'utilizzo del software. (A) Materiali utilizzati per il test di nuoto assistito da software. (B) Impostazione generale del software e dei materiali necessari, si noti che l'alloggiamento è in posizione rialzata. (C) L'altezza della staffa di montaggio dell'obiettivo può essere regolata. Questa immagine mostra la traccia regolabile e un indicatore a nastro che segna l'altezza preferita per l'esecuzione di saggi di nuoto. È necessario regolare la luce a campo brillante e la messa a fuoco della fotocamera prima della registrazione. (D) Una piastra di dosaggio da 35 mm viene posizionata sul palco, gli animali in M9 vengono aggiunti alla piastra e viene avviato un timer di 1 minuto. (E) A volte è vantaggioso ruotare delicatamente la piastra per spostare i vermi più vicino al centro - osservare la posizione sullo schermo di cattura dal vivo; in alternativa, alcune gocce di M9 da un pipettor possono essere utilizzate per separare i vermi. (F) Regolare la ghiera di messa a fuoco sull'obiettivo della fotocamera, osservare i vermi sullo schermo per determinare la messa a fuoco ottimale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg"> Figura 4: I saggi di locomozione radiale rilevano le differenze nella velocità di scansione. La dispersione non stimolata delle larve L4 in fase di sviluppo è stata misurata utilizzando il test di locomozione radiale sopra descritto e rappresentata graficamente come μm / min viaggiato (A-B). Gli stessi dati tracciati in (A) e (B) dimostrano due diverse possibili presentazioni grafiche. In (A), i dati vengono visualizzati come un grafico a barre, rendendo più chiare le differenze relative tra i ceppi. In (B), lo spostamento finale di ciascun worm è suddiviso all'interno del grafico, consentendo di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. Per valutare la significatività tra i ceppi testati, è stata utilizzata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test di confronto multiplo di Tukey. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=non significativo. TDP-43 (M337V) e tau (WT) sono anche significativamente diversi da N2, p<0.0001. Le barre di errore in (A) sono errori standard della media (SEM) e in (B) sono deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg"> Figura 5: I saggi di nuoto rilevano le differenze di thrashing nel liquido. I tassi di nuoto (frequenza di battitura o ondulazione nel liquido) sono stati misurati utilizzando un punteggio imparziale assistito da computer e analisi sopra descritte e rappresentate graficamente come thrashes / min (A-B). Stessi dati tracciati in (A) e (B). In (A), i dati sono rappresentati graficamente come un grafico a barre, il che rende più facili da vedere le differenze relative tra i ceppi. In (B), i dati di ogni singolo worm segnato sono tracciati all'interno del grafico, consentendo di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. Per valutare la significatività tra i ceppi testati, è stata utilizzata un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test di confronto multiplo di Tukey. p<0.0001, ns=non significativo. TDP-43 (WT-moderato) e tau (WT) sono anche significativamente diversi da N2, p <0.0001.Le barre di errore in (A) sono errori standard della media (SEM) e in (B) sono deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg"> Figura 6: I vermi mutanti TDP-43 viaggiano meno dei vermi selvatici. Piastre che mostrano una differenza rappresentativa nella posizione finale di L4 N2 (wild-type) e TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), un ceppo che esprime TDP-43 umano mutante con funzione motoria gravemente compromessa dopo 1 ora di strisciamento non stimolato a temperatura ambiente. Le piastre sono contrassegnate con un punto rosso per il punto centrale e punti blu per la posizione finale degli animali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Registrazione del comportamento di nuoto utilizzando il software di imaging e tracciamento. (A) Il flusso di lavoro di tracciamento e la posizione dell'icona di acquisizione video. (B) La finestra Acquisizione video viene visualizzata in Live View e vengono evidenziati gli aspetti più importanti. Le parole verdi "Live view" cambieranno in un rosso "Registrazione" quando il pulsante di registrazione è attivato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Preparazione e monitoraggio del comportamento di nuoto. Questa figura mostra una serie di schermate per aiutare a impostare una sequenza di immagini video per il monitoraggio. Il protocollo generale per la preparazione di una sequenza video consiste nell'aprire ogni menu del flusso di lavoro in questo ordine: Importa sequenza di immagini | Impostare le informazioni sulla sequenza | Regolare | immagine Rileva e tieni traccia delle | Salva progetto. La finestra Analizza dati può essere utilizzata solo dopo aver registrato un file di progetto. (A) mostra un file .avi (video) aperto dopo aver importato la sequenza nel software dall'interno del flusso di lavoro Track . (B) La finestra Imposta informazioni sequenza fornisce un posto per le note, impostare/modificare la scala e controllare i metadati per una sequenza video. Le istruzioni per cambiare la bilancia si trovano in questa finestra e devono essere seguite quando la fotocamera è abbassata o sollevata (B). L'immagine (C) mostra le impostazioni della finestra Regola immagine . (D) Screenshot che mostra la scheda di rilevamento della finestra Rileva e traccia . Il rilevamento dei worm viene utilizzato per addestrare il software e deve essere impostato per ogni sequenza video. Ulteriori parametri di rilevamento possono essere impostati qui, se lo si desidera. (E) Screenshot della scheda Tracciamento della finestra Rileva e traccia con le impostazioni consigliate per il monitoraggio del comportamento di nuoto. Questo è l'ultimo passaggio per impostare una sequenza video. Salvate la sequenza come progetto utilizzando la finestra Salva progetto . Ripetete questi passaggi per ogni sequenza video. Le impostazioni possono essere salvate come configurazione per ridurre il carico di lavoro e garantire che tutte le sequenze siano trattate allo stesso modo (non visualizzate). Per tenere traccia dei file di progetto per l'analisi, passare al flusso di lavoro batch . (F) mostra l'icona utilizzata per passare al flusso di lavoro Batch e (G) mostra la finestra di elaborazione batch, evidenzia i pulsanti Aggiungi e Avvia e mostra l'aspetto previsto di un file di progetto che è stato monitorato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Analisi del comportamento di nuoto. Dopo aver monitorato un file di progetto, è possibile aprirlo utilizzando [File | Apri Progetto]. I worm appariranno in verde come mostrato nella (A). Pulire il video offre un rapido controllo che il video elaborato come previsto, l'evidenziazione verde scomparirà durante lo scrubbing. La finestra Analisi e stampa dei dati viene aperta dall'elemento del flusso di lavoro Analizza dati . (B) mostra la finestra Analisi dati e plottaggio con la vista Posizione aperta (impostazione predefinita), tutte le tracce sono evidenziate. Sotto i punti dati c'è un grafico che mostra la traccia registrata per ogni worm evidenziato. L'analisi di riepilogo della traccia viene utilizzata per calcolare i giri al minuto. (C-D) mostra il rapporto di riepilogo della traccia e i dettagli di esportazione. (E-F) mostra il riepilogo della traccia in un foglio di calcolo e come calcolare i giri al minuto, l'output misurato in questo test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Questo protocollo descrive due saggi sensibili per discriminare tra compromissione motoria lieve, moderata e grave in modelli di sclerosi laterale amiotrofica di C. elegans , con utilità generale per ceppi di C. elegans , con motilità alterata.

Valutazione della compromissione motoria in modelli di C. elegans di sclerosi laterale amiotrofica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Il nostro protocollo presenta due saggi, quantificando il movimento di C.elegans. Questi metodi valutano fenotipi di motilità come quelli esibiti da modelli di sclerosi laterale amiotrofica o SLA. Il test di locomozione radiale è un metodo economico e semplice per rilevare la strisciatura su una superficie solida.Il Swimming Assay utilizza il tracciamento basato su computer per il rilevamento imparziale dei movimenti di thrashing nel liquido. Questi metodi sono utili per quantificare le differenze di movimento in C.elegans. Sebbene studiamo la SLA, possono essere utilizzati per qualsiasi ceppo con motilità alterata.Capovolgere le piastre di analisi NGM a testa in giù. Ed etichettare il fondo con un identificatore per i ceppi di C.elegans da analizzare. Crea un piccolo punto con il pennarello al centro della piastra capovolta.Mentre si lavora con un microscopio di dissezione, trasferire i vermi al centro della piastra di analisi. E imposta un timer per 30 minuti. Rimettere il coperchio sul piatto e metterlo da parte.Continuare a trasferire i vermi fino a quando tutti i ceppi non si trovano sulle piastre di dosaggio designate. Dopo 30 minuti, iniziare a segnare la prima piastra rimuovendo il coperchio e posizionando la piastra a faccia in giù sotto il microscopio di dissezione. Regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando tutti i vermi sono visibili attraverso la coclea.Usando un pennarello di colore diverso dal punto centrale, metti un piccolo punto nella posizione di ciascun verme. Controlla il bordo del piatto poiché alcuni vermi potrebbero finire lì. Inoltre, conta e registra quanti worm non si sono spostati dal punto centrale.Misurare la distanza dal punto centrale ai contrassegni di posizione finali per ogni worm e registrare la distanza utilizzando un righello. Il primo punto worm è contrassegnato da un trattino. Registrare i dati di lunghezza per ogni punto consecutivamente ruotando la piastra in senso orario.Apri il software associato per configurare e registrare i video. Fare clic sull'icona di acquisizione video. Premere verso il basso sulla manopola del dimmer e ruotarla in senso orario per regolare la luce.Nella finestra di acquisizione video, fai clic sulla scheda Impostazioni e regola la modalità video per 2456x2052_Mono8, frequenza fotogrammi a 14, output monocromatico. Esposizione di 0,00300 secondi. Guadagno a 1 dB.Gamma a uno. E ruota a 180. Tornare alla scheda acquisizione, selezionare la cartella di registrazione e assegnare un nome di file immettendolo nella casella di testo prefisso file.Imposta altre impostazioni di acquisizione come buffer, su 128 fotogrammi e durata su un minuto. Posizionare la piastra di analisi illuminata sul palco del dispositivo e centrarla nella schermata di acquisizione video, quindi rimuovere il coperchio. Utilizzare una micropipetta per lavare circa 50 vermi in 1 ml di M9 sulla piastra di dosaggio.Ruotare delicatamente la piastra per portare gli animali al centro o utilizzare una micropipetta per aggiungere alcune gocce di M9 per separare gli animali. Imposta un timer per 60 secondi per consentire ai vermi di acclimatarsi al nuoto. Regolare la manopola della luce in modo che il display sia il più luminoso possibile senza sovraesposizione.Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera ruotando la ghiera di messa a fuoco sul corpo dell'obiettivo della fotocamera, mentre si guarda il display. Dopo 60 secondi premere il pulsante di registrazione, selezionare il primo pulsante nel menu del flusso di lavoro Importa sequenza immagine"e trovare e fare doppio clic su un video. Dal menu del flusso di lavoro selezionare Imposta informazioni sequenza"Nella finestra nuovo menu controllare lo schema di denominazione, aggiungere note e convalidare i metadati.Seleziona Regola immagine"e si aprirà un nuovo menu a comparsa chiamato Regolazioni immagine". Regola le impostazioni di elaborazione delle immagini impostando l'arrotondamento dello sfondo su 10, l'arrotondamento gaussiano su cinque, i fori di riempimento su due, il filtro oggetto piccolo a zero e saltando la segmentazione derivata integrale. Regola il livello di soglia in modo che gli animali siano completamente pieni di verde, ma ancora distinti dallo sfondo.Quindi fare clic su Applica"Dal menu del flusso di lavoro, selezionare Rileva e traccia" selezionare da tre a sette worm e fare clic sul pulsante Rileva worm nella scheda di rilevamento. Passare alla scheda di monitoraggio. Nei parametri di tracciamento selezionare Usa backtracking" e deselezionare Traccia worm sul bordo dell'immagine.Impostare l'ipotesi massima tracciata su cinque. Imposta la modalità di tracciamento sul nuoto. Passare alla sezione delle impostazioni avanzate e impostare i frame worm possono toccare il limite su 50.I worm dei frame possono sovrapporsi a 500. Tolleranza di posizione a 0,50. E tolleranza di forma a 0,50.Salva queste impostazioni e distribuiscile per tutti i video di un esperimento salvandole come configurazione. Passare a Gestione configurazione nel menu dell'icona in alto a sinistra e fare clic sull'icona Salva. Assegnare a questa configurazione un nome e una descrizione.E fai clic su OK"Nel menu del flusso di lavoro, fai clic su Salva progetto"Traccia i video andando al menu del flusso di lavoro e facendo clic sull'icona Batch". Fare clic sul pulsante Aggiungi" nella sezione di selezione dei file di questo menu di elaborazione batch. individuare e selezionare tutti i file di progetto da elaborare.Quindi fare clic su Apri"Fare clic sul pulsante Start" e annotare l'indicatore di avanzamento verde sul primo file. Consentire l'elaborazione di tutti i file. Al termine di tutti i file letti, chiudere il software.Seleziona Analizza dati"Passare al riepilogo della traccia. E usa il pulsante Esporta" in basso a destra per esportare i dati in un formato leggibile da un foglio di calcolo. Usa il conteggio dei giri e la durata della traccia per calcolare i giri al minuto per ogni traccia utilizzando le funzioni di foglio di calcolo.La dispersione non stimolata della larva L4 in fase di sviluppo di cinque diversi ceppi è stata misurata utilizzando il radiale locomozione. E rappresentato graficamente come micro metro al minuto viaggiato. I dati visualizzati come grafici a barre rendono più chiare le differenze relative tra i ceppi.Mentre lo spostamento finale di ogni verme tracciato all'interno del grafico, consente di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. I tassi di nuoto in termini di frequenza di thrashing o ondulazione nel liquido, sono stati misurati utilizzando punteggi e analisi imparziali assistiti da computer. E rappresentato graficamente come thrash al minuto.I dati del grafico a barre rendono più facili da vedere le differenze relative tra i ceppi. Mentre i dati di ogni singolo worm segnato sono tracciati all'interno del grafico, consentendo di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. Nel Radial Locomotion Assay, il ceppo TDP-43 lieve non era significativamente diverso dal ceppo N2 wild-type.Tuttavia, nel Swimming Assay, sia i ceppi TDP-43 lievi che quelli forti non erano solo significativamente diversi dal wild-type N2, ma anche l'uno dall'altro. Il ceppo mutante della SLA TDP-43 ha una grave compromissione strisciante da parte della locomozione radiale e non si agita nel liquido. Il ceppo che esprime la tau ha gravi menomazioni nella locomozione radiale, ma può colpire nel test di nuoto.L'aspetto più importante da considerare con questi metodi è il mantenimento di controlli coerenti tra le repliche. Ciò garantisce che le variazioni della motilità siano causate da differenze fenotipiche e non da condizioni ambientali. Questi metodi forniscono una valutazione completa di due principali paradigmi di motilità di C.elegans.I metodi di follow-up potrebbero includere un'ulteriore caratterizzazione comportamentale, analisi biochimica o indagine sulla funzione muscolare o neuronale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

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