Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Vi takker anmelderne for nyttige kommentarer og forslag. Vi takker Aleen Saxton, Brandon Henderson og Jade Stair for fremragende teknisk assistanse. Vi takker Brian Kraemer og Rebecca Kow for hjelp til å utvikle disse analysene. Dette materialet er et resultat av arbeid som støttes med ressurser og bruk av fasiliteter ved VA Puget Sound Health Care System. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra USA (USA) Institutt for veteransaker (VA) Biomedisinsk laboratorieforsknings- og utviklingstjeneste [Merit Review Grant #I01BX004044 til N.F.L.]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen avsløringer.

Sirkulær bevegelse: Oppløsningen av denne analysen styres enkelt ved å endre tidsvariabelen. Å øke tiden gjør det lettere å observere forskjeller mellom dyr med alvorlige fenotyper, og dermed identifisere subtile forskjeller. Men fordi denne analysen måler forskyvning, hvis analysetiden forlenges for lenge, vil dyr med normal bevegelighet, som N2, reise til kantene på platen, og foraging oppførsel vil føre til backtracking. Dette vil kunstig redusere målingen av tilbakelagt distanse. Tidsperioder som er for lange, kan føre til at forskjeller mellom stammer forsvinner, spesielt mellom dyr med mindre alvorlige motoriske fenotyper, da dyr blir jevnt spredt over platen. Forkorting av tidsvariabelen vil forhindre at mer aktive ormer finner kantene på platen. Denne metoden sporer ikke den totale tilbakelagte avstanden for hver orm, men komprimerer tilbakelagt distanse for hver orm i en lineær avstand fra midten av platen. Som sådan er det iboende mindre robust enn en metode som registrerer den totale sporlengden på individuelle ormer. Imidlertid krever radial bevegelsesanalyse svært lite forskeropplæring, bruker relativt rimelige reagenser som vanligvis er tilgjengelige i de fleste ormelaboratorier, og er følsom nok til å produsere betydelige og reproduserbare resultater. For laboratorier som foretrekker automatisert videosporing, er det tidligere etablert flere metoder for å spore og analysere gjennomsøkingsbevegelser12, eller programvareparametrene som brukes til svømmeanalysen i dette dokumentet, kan endres for å tillate krypedeteksjon og analyse.
Dette eksperimentet gjøres vanligvis i triplikate uavhengige repliker, med et sett med 30-40 ormer per replikering. Hver replikering er delt på to forskjellige 100 mm eller 150 mm plater, med 15-20 ormer per plate. Å bruke flere ormer enn anbefalt per plate kan gjøre det vanskelig å score effektivt. Et totalt antall skår på 90+ er tilstrekkelig drevet til å etablere betydning for mild, moderat eller alvorlig motilitetshemming. Å være i samsvar med timing mellom belastninger scoret er avgjørende for nøyaktighet og reproduserbarhet. 30 minutter er generelt lang nok til å etablere forskjeller mellom moderate til alvorlige fenotyper som transgene stammer som uttrykker human mutant TDP-43 sammenlignet med wild-type ormer (figur 4). Hvis tidsvariabelen forlenges, anbefales det også å øke størrelsen på platen fra 100 mm til 150 mm. Miljøfaktorer som temperatur og fuktighet kan påvirke denne analysen, som vanligvis utføres ved omgivelsestemperatur, så det er viktig å alltid bruke en wild-type (N2) kontroll når du sammenligner på tvers av repliker. I tillegg kan denne analysen måle motiliteten til noen stammer som ikke viser normal svømmeadferd i væske (thrashing), noe som gjør det til et nyttig supplement til svømmeanalysen.
Svømmeanalyse: Bruken av bilde- og oppkjøpssystemet for å automatisere sporing og analyse av ormsvømming gir mulighet for strenge og objektive data. Det er imidlertid flere faktorer under det første oppsettet av eksperimentet som må kontrolleres mellom prøver. Disse inkluderer tiden for å akklimatisere seg til væske før du begynner å registrere, omgivelsesforhold (dvs. temperatur, fuktighet) og konsekvente lys- og opptaksinnstillinger. På innspillingsstadiet er det flere funksjoner som bidrar til å redusere variasjon mellom plater. Disse inkluderer et integrert spormontert kamera og lysfeltstadium som gjør innspilling av video konsistent mellom plater, skjerming rundt scenen som forhindrer refleksjoner, gjenskinn og luftbevegelser mens du tar opp, og en robust programvarepakke som pålitelig oppdager ormer og muliggjør manuell korreksjon av spor i video etterbehandling. I denne protokollen blir videoer av en 35 mm plate med ormer spilt inn i 1 minutt og deretter behandlet ved hjelp av programvarepakken. Etter behandling sikrer manuell korrigering av spor at ormeatferd registreres nøyaktig uten å forvirre sporingsfeil. Svingantall og sporvarighetsdata brukes til å bestemme svinger per minutt som en endelig avlesning. For å sikre reproduserbarhet samles data over minst 3 uavhengige replikeringsforsøk, hver med 40-50 dyr scoret, for å oppnå et kombinert sluttnummer på dyr 120-150. Dette tallet er tilstrekkelig til å diskriminere små forskjeller i svømmeadferd fra kontrollormer. Noen ormer har motoriske underskudd som er for alvorlige til å bli fanget opp av svømmeanalyser. For eksempel, hvis dyrene plassert i en flytende middels krølle i stedet for å utføre den forventede bankende responsen, vil denne analysen ikke registrere disse bevegelsene nøyaktig, og en annen bevegelsesanalyse, for eksempel radial bevegelse, kan bedre fange opp disse motilitetsfeilene. Den medfølgende protokollen bruker et kommersielt tilgjengelig bildebehandlingssystem (se Tabell over materialer for mer informasjon), men andre ormsporingssystemer kan gi et lignende verktøy, der noen er åpen kildekode12. Tidligere publiserte metoder beskriver manuell scoring av orm thrashing13. Mens den automatiserte analysen produserer en rekke beregninger for hver enkelt orm, gir deteksjon av kroppsbøyninger som måles i thrashes per minutt, konsistente resultater mellom eksperimenter og spor godt med konvensjonell scoring av orm thrashes for øye.

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en svekkende, aldringsrelatert nevrodegenerativ sykdom med en spesiell innvirkning på motoriske nevroner. Sykdommen har tap av motoriske nevroner i hjernen og ryggmargen og progressiv motorisk svekkelse. Dette resulterer i stor funksjonell funksjonshemming og for tidlig død, vanligvis innen 3-5 år etter diagnosen1. Mutasjoner i minst 38 gener kan forårsake ALS; Imidlertid akkumulerer de fleste pasienter med ALS allestedsnærværende inneslutninger av proteinet TDP-43 som deres primære patologi i nevroner og glialceller2,3,4. En rekke dyremodeller er utviklet for å studere de underliggende mekanismene som forårsaker eller bidrar til ALS in vivo (gjennomgått in5). I C. elegans inkluderer disse modellene genetiske tap-av-funksjon mutasjoner i homologer av ALS-forårsakende gener eller transgent uttrykk for menneskelige ALS-gener. Det er mange fordeler med å modellere ALS i C. elegans. C. elegans er et gjennomførbart enkelt dyr med et differensiert nervesystem, godt karakteriserte atferdsparadigmer og betydelig genetisk homologi til mennesker6,7. Mange verktøy eksisterer for å jobbe med C. elegans, inkludert robuste genomredigeringsevner, in vivo fluorescerende reportere av nevrodegenerasjon, RNAi screening paradigmer, tractable genetikk, og etablerte atferdsmessige og fenotypiske analyser. C. elegans modeller av ALS recapitulate aspekter av menneskelig sykdom, inkludert akkumulering av uoppløselig protein, nevrodegenerasjon, og tidlig død8,9. Videre er motorisk dysfunksjon med forstyrrelse av både krypende og svømmende oppførsel til stede i mange C. elegans ALS-modeller.
Denne protokollen beskriver to metoder for å karakterisere C. elegans motorfenotyper: radial bevegelsesanalyse for evaluering av kryping på en solid overflate og vurdering av svømming i væske (thrashing) ved hjelp av WormLab automatisert sporing og analyse. Disse sensitive metodene for karakterisering av motorunderskudd tillater sammenligninger av alvorlighetsgrad og tilbyr verktøy for måling av undertrykkelse og forbedringer av motoriske fenotyper. Den radiale bevegelsesanalysen kvantifiserer forskjeller i krypende bevegelighet (sinusformet bevegelse på en solid overflate) blant populasjoner av ormer. Denne analysen drar nytte av C. elegans naturlige ustimulerte leteatferd ved å plassere ormer på ett sted på en tallerken og markere deres endelige plassering etter en gitt periode10. Alternativt teller svømming i flytende (bankende) analyser kroppsbøyninger av individuelle ormer over en bestemt tidsperiode. Den manuelle tellingen av kroppsbøyninger av det menneskelige øye er tidkrevende og viser vanligvis betydelig variasjon mellom eksperimenter. Bruken av dataassistert automatisert sporing og analyse kan eliminere mye av denne variasjonen. I tillegg til karakteriseringen av baseline motorisk svekkelse av ALS-modeller, kan både radial bevegelse og svømmeanalyser oppdage modulering av distinkte lokomotoriske fenotyper fra genetiske eller små molekylintervensjoner. Disse metodene har verktøy for å studere ALS-modeller og enhver C. elegans belastning som viser endret bevegelighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

Den nevrodegenerative sykdommen amyotrofisk lateral sklerose (ALS) har progressiv tap av motoriske nevroner ledsaget av muskelsvakhet og motorisk svekkelse som forverres med tiden. Mens det er gjort betydelige fremskritt for å bestemme genetiske drivere av ALS for en undergruppe av pasienter, har de fleste tilfeller en ukjent etiologi. Videre er mekanismene som ligger til grunn for motorisk nevron dysfunksjon og degenerasjon ikke godt forstått; Derfor er det et løpende behov for å utvikle og karakterisere representative modeller for å studere disse prosessene. Caenorhabditis elegans kan tilpasse bevegelsen til de fysiske begrensningene i omgivelsene, med to primære bevegelsesparadigmer studert i et laboratoriemiljø som kryper på en fast overflate og svømmer i væske. Disse representerer et komplekst samspill mellom sensasjon, motoriske nevroner og muskler. C. elegans modeller av ALS kan vise svekkelse i ett eller begge disse bevegelsesparadigmene. Denne protokollen beskriver to sensitive analyser for evaluering av bevegelighet i C. elegans: en optimalisert radial bevegelsesanalyse som måler kryping på en solid overflate og en automatisert metode for sporing og analyse av svømming i væske (thrashing). I tillegg til karakteriseringen av baseline motorisk svekkelse av ALS-modeller, kan disse analysene oppdage undertrykkelse eller forbedring av fenotypene fra genetiske eller små molekylintervensjoner. Dermed har disse metodene verktøy for å studere ALS-modeller og enhver C. elegans belastning som viser endret bevegelighet.

Både radial bevegelse og svømmeanalyser gir sensitiv påvisning av bevegelighetshemming (figur 4 og figur 5). For å undersøke mekanismene som ligger til grunn for patologisk TDP-43 i ALS, er det utviklet C. elegans-modeller som uttrykker villtype eller ALS-mutant menneskelig TDP-43 pan-neuronally. Disse dyrene viser molekylære og cellulære egenskaper som minner om ALS, inkludert motorisk dysfunksjon9. Viktigst, de viser moderat bevegelighet svekkelse med uttrykk for vill type menneskelig TDP-43 og mer alvorlig bevegelighet svekkelse hos dyr som uttrykker ALS-mutant TDP-43 ved hjelp av både radial bevegelse og svømming analyser. Noen mutante eller transgene dyr vil ha større svekkelse i kryping enn svømming, eller omvendt. Ved å bruke to forskjellige motilitetsanalyser oppnås et klarere bilde av fenotypiske forskjeller mellom stammer.
Sirkulær bevegelse Når de plasseres på en frø agar tallerken, C. elegans utforske sine omgivelser, inkludert oppsøke grensene for deres matkilde. Radiale bevegelsesanalyser er en måte å dra nytte av den oppførselen som en beregning for fysisk form. Ved å analysere lokomotorisk oppførsel (krypende på en solid overflate) på en kontrollert og kvantifiserbar måte, tilbyr radial lokomotorisk analyse et enkelt og effektivt verktøy for å vurdere alvorlighetsgraden av motorunderskudd og andre motorrelaterte fenotyper. Radiale bevegelsesanalyser fanger opp forskjeller i bevegelighet i moderat eller alvorlig svekkede ALS-modellormer og tilbyr en basislinje for å sammenligne modulering av motilitetsfenotyper eller endringer i bevegelighet med alderen (figur 6). Denne strategien kan brukes til å kvantifisere krypende oppførsel av enhver belastning som har endret bevegelse fra vill type (N2) eller kontroll ormer. Denne metoden er imidlertid kanskje ikke et godt valg for å vurdere dyr som ikke klarer å krype normalt, for eksempel rullemutanter eller dyr som er lammet. Vanligvis vil wild-type ormer presentere en gjennomsnittlig forskyvning mellom 200-300 μm / min når de heves og testes ved 20 °C. Eksempeldataene som presenteres i figur 4 , viser forventede resultater som sammenligner N2, to forskjellige transgene stammer som uttrykker villtype menneskelig TDP-43 med en mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller sterkere fenotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en transgen stamme som uttrykker mutant menneskelig TDP-43 med en alvorlig fenotype [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), og en transgen stamme som uttrykker en annen nevrodegenerativ sykdom assosiert protein, vill type menneskelig tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De to stammene som uttrykker villtype TDP-43 har forskjellige grader av svekkelse som påvist ved radial bevegelse. TDP-43 (WT-low) er ikke signifikant forskjellig fra N2, mens TDP-43 (WT-høy) viser klare forskjeller i bevegelighet. TDP-43(M337V) og tau (WT) stammer har mer alvorlige svekkelser i motilitet.
Svømmeanalyse C. elegans engasjerer seg i stereotypisk svømming (thrashing) bevegelse når de er nedsenket i væske. Umiddelbart ved nedsenking begynner ormer å karakteristisk bøye hodet og halen mot hverandre med en bøyevinkel på ca. 45°, med vinkeltoppunktet som midtpunktet til ormen. Ormer veksler bøyning i ventrale og dorsale retninger. En thrash, målt ved programvaren, representerer bevegelsen av å gå fra rett til en kroppsbøyevinkel på 20 ° eller større, uavhengig av retning (vinkelterskel kan justeres etter behandling i analyse- og plottingsvinduet [Arbeidsflyt | Analysere data | Kroppsform | Bøyevinkel | Midtpunkt | AmplitudeTerskel: # grader]. Svømmeanalysen som er beskrevet her, bruker automatisert databasert sporing og analyse for å gi objektiv scoring av svømmeaktivitet. Det forventes at wild-type (N2) ormer i gjennomsnitt vil være mellom 150-200 thrashes per min når de heves og registreres ved 20 °C. Eksempeldataene som presenteres i figur 5, viser forventede resultater som sammenligner N2, to forskjellige transgene stammer som uttrykker villtype menneskelig TDP-43 med en mild fenotype [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller sterkere fenotype [TDP-43(WT-moderat), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], og en transgen stamme som uttrykker en annen nevrodegenerativ sykdom assosiert protein, vill type menneskelig tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Den transgene stammen som uttrykker ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] banker ikke i væske, og det er derfor betegnet på grafen som ND (ingen data). Denne analysen kan diskriminere forskjellige fenotyper enn den radiale bevegelsesanalysen vist i figur 4. I den radiale bevegelsesanalysen (figur 4) var for eksempel TDP-43(WT-low) ikke signifikant forskjellig fra N2. I svømmeanalysen (figur 5) er imidlertid både TDP-43(WT-low) og TDP-43(WT-high) signifikant forskjellig fra N2, samt vesentlig forskjellig fra hverandre. Til tross for at både TDP-43(M337V) og tau(WT) har alvorlige gjennomsøkingshemminger ved radial bevegelse (figur 4), er det bare tau(WT) som kan banke nok til å spores av programvaren (figur 5). TDP-43(M337V) dyr er ikke i stand til å banke, og programvarebasert analyse oppdager eller sporer ikke disse ormene nøyaktig. Dermed ble data om disse ormene ikke samlet inn (ND, ingen data).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyt for stråleoppgraderingsanalyse. Paneler A-E viser de generaliserte trinnene i radial bevegelsesanalyse. Trinnene er som følger: (A) NGM-plater, med OP50 frø til kantene, fremstilles ved å merke og markere sentrale prikker, (B) ormer plasseres i midten av agaren som er merket med den sentrale prikken, (C) ormer kan bevege seg fritt i en bestemt tidsperiode, (D) platen vendes nedenfra og den endelige plasseringen av hver orm er merket i en annen farge enn den sentrale prikken, (E) Avstanden fra midtpunktet til hver endelige ormplassering målt enten for hånd eller digitalt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg"> Figur 2: Digital måling av endelig plassering ved hjelp av ImageJ.  Avstand fra sentermålinger kan måles for hånd eller digitalt, for å måle digitalt ved hjelp av ImageJ (A) skanne baksiden av platen med en linjal i rammen. (B) Tegn en kjent lengde ved hjelp av linjeverktøyet. (C) Bruk den kjente lengden som er trukket inn (B) for å angi skala [Analyser | Angi skala...]. (D) Bruk linjeverktøyet til å tegne en linje fra midtpunktet til et endelig stedsmerke, gjenta for hvert merke. (E) En pensellinje som markerer det første merket målte hjelpemidler i skåring (bølgete svart linje nær 1-merket). Endelige plasseringsmerker nummereres i gult for å illustrere retningen på poengsummen. (F) Målinger registreres i Resultat-vinduet. Lagre resultater andre steder for statistisk analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg"> Figur 3: Material- og maskinvarejusteringer for bruk av programvaren. (A) Materialer som brukes til den programvareassisterte svømmeanalysen. (B) Generelt oppsett av programvaren og nødvendige materialer, vær oppmerksom på at huset er i hevet posisjon. (C) Høyden på linsemonteringsbraketten kan justeres. Dette bildet viser det justerbare sporet og en båndindikator som markerer den foretrukne høyden for å utføre svømmeanalyser. Det er nødvendig å justere brightfield-lyset og kamerafokuset før opptak. (D) En 35 mm analyseplate er plassert på scenen, dyr i M9 legges til platen, og en 1 min timer startes. (E) Det er noen ganger fordelaktig å forsiktig virvle platen for å flytte ormer nærmere midten - observere plassering på live fangstskjermen; Alternativt kan noen dråper M9 fra en pipettor brukes til å skille ormer. (F) Juster fokusringen på kameralinsen, følg ormene på skjermen for å bestemme optimal fokus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg"> Figur 4: Radiale bevegelsesanalyser oppdager forskjeller i gjennomsøkingshastighet. Ustimulert spredning av utviklingsoppredede L4 larver ble målt ved hjelp av radial bevegelsesanalyse beskrevet ovenfor og grafert som μm / min reist (A-B). De samme dataene som er tegnet inn i (A) og (B), demonstrerer to forskjellige mulige grafiske presentasjoner. I (A) vises data som en stolpediagram, noe som gjør relative forskjeller mellom stammer tydeligere. I (B) lagres den endelige forskyvningen av hver orm i grafen, slik at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. For å evaluere signifikans blant belastninger som ble testet, ble enveisanalyse av varians (ANOVA) med Tukeys multisammenligningstest brukt. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=ikke signifikant. TDP-43(M337V) og tau(WT) er også vesentlig forskjellig fra N2, p<0.0001. Feilfelt i (A) er standardfeil av gjennomsnittet (SEM) og i (B) er standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg"> Figur 5: Svømmeanalyser oppdager forskjeller i banking i væske. Svømmehastigheter (thrashing eller undulation frekvens i væske) ble målt ved hjelp av objektiv dataassistert scoring og analyse beskrevet ovenfor og grafert som thrashes / min (A-B). Samme data tegnet inn (A) og (B). I (A) vises data som en stolpediagram, noe som gjør det enklere å se relative forskjeller mellom stammer. I (B) tegnes data fra hver enkelt orm i diagrammet, slik at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. For å evaluere signifikans blant tester av stammer ble det brukt en enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) med Tukeys multisammenligningstest. p<0.0001, ns=ikke signifikant. TDP-43 (WT-moderat) og tau(WT) er også vesentlig forskjellig fra N2, p<0.0001.Feilfelt i (A) er standardfeil av gjennomsnittet (SEM) og i (B) er standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg"> Figur 6: Mutant TDP-43-ormer reiser mindre enn wild-type ormer. Plater som viser en representativ forskjell i den endelige plasseringen av iscenesatt L4 N2 (wild-type) og TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en stamme som uttrykker mutant menneskelig TDP-43 med alvorlig nedsatt motorisk funksjon etter 1 time med ustimulert kryping ved romtemperatur. Plater er merket med en rød prikk for midtpunktet og blå prikker for dyrets endelige plassering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Registrere svømmeatferd ved hjelp av bilde- og sporingsprogramvaren. (A) Sporingsarbeidsflyten og plasseringen av videoopptaksikonet. (B) Video Capture-vinduet vises i Live View, og de viktigste aspektene er uthevet. De grønne "Live view" ordene endres til en rød "Opptak" når opptaksknappen er aktivert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: Klargjøring og sporing av svømmeatferd. Denne figuren viser en rekke skjermbilder for å hjelpe deg med å sette opp en videobildesekvens for sporing. Den generelle protokollen for å klargjøre en videosekvens er å åpne hver arbeidsflytmeny i denne rekkefølgen: Importer bildesekvens | Angi | for sekvensinformasjon Juster bilde | Oppdage og spore | Lagre prosjekt. Vinduet Analyser data kan bare brukes etter at en prosjektfil er sporet. (A) viser en åpnet .avi (videofil) etter at du har importert sekvensen til programvaren fra Spor-arbeidsflyten . (B) Vinduet Angi sekvensinformasjon gir deg et sted for notater, angir/endrer skalaen og kontrollerer metadataene for en videosekvens. Instruksjoner for endring av vekten finnes i dette vinduet og bør følges når kameraet senkes eller heves (B). Bilde (C) viser innstillingene for Juster bilde-vinduet . (D) Skjermbilde som viser gjenkjenningsfanen i Finn og spor-vinduet . Detektering av ormer brukes til å lære opp programvaren og må angis for hver videosekvens. Flere gjenkjenningsparametere kan angis her hvis ønskelig. (E) Skjermbilde av Kategorien Sporing i vinduet Finn og spor med de anbefalte innstillingene for å spore svømmeatferd. Dette er det siste trinnet når du skal konfigurere en videosekvens. Lagre sekvensen som et prosjekt ved hjelp av Vinduet Lagre prosjekt . Gjenta disse trinnene for hver videosekvens. Innstillinger kan lagres som en konfigurasjon for å redusere arbeidsmengden og sikre at alle sekvenser behandles likt (vises ikke). Hvis du vil spore prosjektfiler for analyse, navigerer du til den satsvise arbeidsflyten. (F) viser ikonet som brukes til å navigere til den satsvise arbeidsflyten, og (G) viser vinduet for satsvis behandling, uthever legg til- og startknappene og viser det forventede utseendet til en prosjektfil som er sporet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 3: Analyse av svømmeatferd. Når en prosjektfil er sporet, kan den åpnes ved hjelp av [Fil | Åpne Prosjekt]. Ormer vises i grønt som vist i (A). Skrubbing gjennom videoen gir en rask sjekk av at videoen som behandles som forventet, grønn utheving vil forsvinne mens du skrubber. Vinduet Dataanalyse og plotting åpnes fra arbeidsflytelementet Analyser data . (B) viser vinduet Dataanalyse og plotting med posisjonsvisning åpnet (standard), alle sporene er uthevet. Under datapunktene er det et tegn som viser det registrerte sporet for hver uthevede orm. Analysen av sporsammendrag brukes til å beregne svinger per minutt. (C-D) viser rapporten for sporsammendrag og eksporterer detaljer. (E-F) viser sporsammendraget i et regneark og hvordan du beregner svinger per minutt, utdataene målt i denne analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Denne protokollen beskriver to sensitive analyser for diskriminering blant milde, moderate og alvorlige motoriske svekkelse i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral sklerose, med generell nytte for C. elegans stammer, med endret bevegelighet.

Evaluering av motorisk svekkelse i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral sklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Vår protokoll presenterer to analyser, og kvantifiserer C.elegans bevegelse. Disse metodene evaluerer motilitet fenotyper som de som er utstilt av modeller av amyotrofisk lateral sklerose, eller ALS. Radial Locomotion Assay er en kostnadseffektiv og enkel metode for å oppdage kryping på en solid overflate.Swimming Assay bruker databasert sporing for objektiv deteksjon av bankende bevegelser i væske. Disse metodene er nyttige for å kvantifisere bevegelsesforskjeller i C.elegans. Selv om vi studerer ALS, kan de brukes til enhver belastning med endret bevegelighet.Snu NGM-analyseplatene opp ned. Og merk bunnen med en identifikator for C.elegans-stammene som skal analyses. Lag en liten prikk med markøren i midten av opp-ned-platen.Når du arbeider med et dissekerende mikroskop, overfør ormer til midten av analyseplaten. Og still inn en timer i 30 minutter. Sett lokket tilbake på platen og sett det til side.Fortsett å overføre ormer til alle stammer er på de angitte analyseplatene. Etter 30 minutter begynner du å score den første platen ved å fjerne lokket og plassere platen med forsiden ned under dissekeringsmikroskopet. Juster mikroskopfokuset til alle ormer er synlige gjennom snøskruen.Bruk en annen farget filtpenn fra midtpunktet, legg en liten prikk på plasseringen av hver orm. Kontroller kanten på platen, da noen ormer kan ende opp der. Tell også og registrer hvor mange ormer som ikke flyttet seg fra midtpunktet.Mål avstanden fra midtpunktet til de endelige stedsmarkeringene for hver orm, og registrer avstanden ved hjelp av en linjal. Det første ormepunktet er merket med en tankestrek. Registrer lengdedata for hver prikk fortløpende ved å rotere platen med klokken.Åpne den tilknyttede programvaren for å sette opp og spille inn videoene. Klikk på videoopptaksikonet. Trykk ned på dimmerknappen og vri den med klokken for å justere lyset.I videoopptaksvinduet klikker du på innstillingsfanen og justerer videomodusen for å 2456x2052_Mono8, bildefrekvens til 14, utgang som monokrom. Eksponering på 0,00300 sekunder. Gevinst til 1 dB.Gamma til en. Og roter til 180. Gå tilbake til opptaksfanen, velg innspillingsmappen og tilordne et filnavn ved å skrive det inn i tekstboksen for filprefiks.Sett andre opptaksinnstillinger som buffer, til 128 bilder og varighet til ett minutt. Plasser analyseplaten opplyst på enhetsstadiet og midtstill den i videoopptaksskjermen, og fjern deretter lokket. Bruk en mikropipette til å vaske ca. 50 ormer i 1 ml M9 på analyseplaten.Virvle platen forsiktig for å bringe dyrene til midten, eller bruk en mikropipette for å legge til noen dråper M9 for å skille dyrene. Still inn en tidtaker i 60 sekunder slik at ormer akklimatiseres til svømming. Juster lysknappen slik at skjermen er så lys som mulig uten overeksponering.Juster kamerafokuset manuelt ved å dreie fokuseringsringen på objektivets kropp på kameraet mens du ser på skjermen. Etter 60 sekunder trykker du på opptaksknappen, velger den første knappen på arbeidsflytmenyen Importer bildesekvens"og finner og dobbeltklikker på en video. Velg Angi sekvensinformasjon på arbeidsflytmenyen"I det nye menyvinduet kontrollerer du navneskjemaet, legger til notater og validerer metadata.Velg Juster bilde"og en ny hurtigmeny kalt Bildejusteringer"åpnes. Juster innstillingene for bildebehandling ved å sette bakgrunnsutjevningen til 10, gaussisk utjevning til fem, Fyll hull til to, Filter for små objekter til null og hopp over integralderivatsegmentering. Juster terskelnivået slik at dyrene er helt fylt med grønt, men fortsatt forskjellig fra bakgrunnen.Klikk deretter på Bruk"Fra arbeidsflytmenyen velger du Finn og spor"Velg tre til syv ormer og klikk på Oppdag ormer"-knappen i deteksjonsfanen. Gå til oppfølgingsfanen. I sporingsparameterne merker du av for Bruk Tilbakesporing" og fjerner merket for Spor ormer på kanten av bildet.Sett den maksimale sporede hypotesen til fem. Sett sporingsmodusen til svømming. Flytt til delen for avanserte innstillinger, og angi at rammeormene kan berøre grensen til 50.Rammeormer kan overlappe til 500. Posisjonstoleranse til 0,50. Og form toleranse til 0,50.Lagre disse innstillingene og distribuer dem for alle videoer i et eksperiment ved å lagre dem som en konfigurasjon. Naviger til konfigurasjonsbehandling øverst til venstre ikonmenyen, og klikk på Lagre"ikonet. Gi denne konfigurasjonen et navn og en beskrivelse.Og klikk ok"I arbeidsflytmenyen klikker du på Lagre prosjekt"Spor videoene ved å gå til arbeidsflytmenyen og klikke på Batch"-ikonet. Klikk legg til under filvalgdelen på denne menyen for satsvis behandling. navigere til og velge alle prosjektfilene som skal behandles.Klikk deretter på Åpne"Klikk på Start"-knappen, og noter den grønne fremdriftsindikatoren på den første filen. Tillat at alle filene behandles. Når alle filene som leses, er fullført, lukker du programvaren.Velg Analyser data"Naviger til sporsammendraget. Og bruk Eksporter"-knappen nederst til høyre for å eksportere data i et regneark lesbart format. Bruk Svingtelling" og Spor varighet"til å beregne svinger per minutt for hvert spor i ved hjelp av oppslagsarkfunksjoner.Ustimulert spredning av utviklingsmessig iscenesatt L4 larve av fem forskjellige stammer, ble målt ved hjelp av Radial Locomotion Assay. Og grafert som mikrometer per minutt reist. Dataene som vises som stolpediagrammer, gjør relative forskjeller mellom stammer klarere.Mens den endelige forskyvningen av hver orm som er tegnet inn i grafen, gjør at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. Svømmehastigheter når det gjelder thrashing eller undulation frekvens i væsken, ble målt ved hjelp av objektiv dataassistert scoring og analyse. Og grafert som thrashes per minutt.Stolpediagramdataene gjør det enklere å se relative forskjeller mellom stammer. Mens data fra hver enkelt orm som scores, tegnes inn i diagrammet, slik at variasjonen i populasjonen kan visualiseres bedre. I Radial Locomotion Assay var mild TDP-43-stamme ikke signifikant forskjellig fra den ville N2-stammen.Men i svømmeanalysen var både de milde og sterke TDP-43-stammene ikke bare vesentlig forskjellig fra villtype N2, men også fra hverandre. ALS-mutanten TDP-43-stammen har alvorlig krypende svekkelse av Radial Locomotion, og de banker ikke i væske. Den tau-uttrykkende stammen har alvorlige nedskrivninger i Radial Locomotion, men kan banke i svømmeanalysen.Det viktigste aspektet å vurdere med disse metodene, er å opprettholde konsekvente kontroller mellom replikeringer. Dette sikrer at variasjoner i bevegelighet er forårsaket av fenotypiske forskjeller og ikke miljøforhold. Disse metodene gir en omfattende vurdering av to store C.elegans motility paradigmer.Oppfølgingsmetoder kan omfatte ytterligere atferdskarakterisering, biokjemisk analyse eller undersøkelse av muskel- eller nevronfunksjon.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatisert Kvantifisering av Synaptic fluorescens i<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Sporing og Behavioral Måling

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylær Avlesning av Long-term olfactory Tilpasning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisering neuroblast Cytokinesis Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo avbildning av Dauer-spesifikke nevronale ombygging i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automatisert analyse av<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Opptreden Bruke Celest programvare

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Omfattende obduksjon program for personer med multippel sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D kinematisk analyse for funksjonell evaluering i rottemodellen av siattisk nerveknuseskade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...