Name: evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Yararlı yorum ve öneriler için yorumculara teşekkür ederiz. Aleen Saxton, Brandon Henderson ve Jade Stair'e olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Brian Kraemer ve Rebecca Kow'a bu tahlillerin geliştirilmesine yardımları için teşekkür ederiz. Bu malzeme, VA Puget Ses Sağlık Sistemi'ndeki kaynaklar ve tesislerin kullanımı ile desteklenen çalışmaların bir sonucudur. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) bir hibe ile desteklendi. Gazi İşleri Bakanlığı (VA) Biyomedikal Laboratuvar Araştırma ve Geliştirme Servisi [N.F.L.'ye Liyakat İnceleme Hibe #I01BX004044]

<ol>
	<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).</li><li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genetics,+mechanisms,+and+therapeutics:+Where+are+we+now.">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).</li><li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTLD:+Experimental+models+and+reality.">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li><li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList+2:+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes.">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li><li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy.">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li><li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G(o)/G(q)+signaling+network.">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li><li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1551 (2006).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir açıklama yapmadıklarını beyan ederler.

Radyal hareketlilik: Bu tahlilin çözünürlüğü zaman değişkeni değiştirilerek kolayca kontrol edilir. Sürenin artırılması, şiddetli fenotiplere sahip hayvanlar arasındaki farklılıkları gözlemlemeyi kolaylaştırır, böylece ince farklılıkları tanımlar. Bununla birlikte, bu test yer değiştirmeyi ölçtüğünden, tahlil süresi çok uzun uzatılırsa, N2 gibi normal hareketliliği olan hayvanlar plakanın kenarlarına seyahat eder ve yiyecek arama davranışı geriye doğru iz sürmeye yol açar. Bu, kat edilen mesafenin ölçümünü yapay olarak azaltacaktır. Çok uzun olan zaman aralıkları, özellikle daha az şiddetli motor fenotipleri olan hayvanlar arasındaki suşlar arasındaki farklılıkların kaybolmasına neden olabilir, çünkü hayvanlar plaka boyunca eşit olarak dağılır. Zaman değişkeninin kısaltılması, daha aktif solucanların plakanın kenarlarını bulmasını önleyecektir. Bu yöntem, her solucan için kat edilen toplam mesafeyi izlemez, ancak her solucan için kat edilen mesafeyi plakanın merkezinden doğrusal bir mesafeye sıkıştırır. Bu nedenle, doğası gereği tek tek solucanların toplam iz uzunluğunu kaydeden bir yöntemden daha az sağlamdır. Bununla birlikte, radyal locomotion testi çok az araştırmacı eğitimi gerektirir, çoğu solucan laboratuvarında yaygın olarak bulunan nispeten uygun fiyatlı reaktifleri kullanır ve önemli ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecek kadar hassastır. Otomatik video izlemeyi tercih eden laboratuvarlar için, gezinme hareketlerini izlemek ve analiz etmek için daha önce çeşitli yöntemler oluşturulmuştur12 veya bu makaledeki yüzme tahlilleri için kullanılan yazılım parametreleri tarama algılama ve analizine izin vermek için değiştirilebilir.
Bu deney genellikle üç taraflı bağımsız çoğaltmalarda yapılır ve çoğaltma başına 30-40 solucan kümesi vardır. Her çoğaltma, plaka başına 15-20 solucan ile iki farklı 100 mm veya 150 mm plakaya bölünür. Plaka başına önerilenden daha fazla solucan kullanmak, verimli bir şekilde puan almanın zor olmasını sağlayabilir. 90+ puan alan toplam sayı, hafif, orta veya şiddetli hareketlilik bozukluğu için önem oluşturmak için yeterince güçlendirilmiştir. Puanlanan suşlar arasındaki zamanlama ile tutarlı olmak doğruluk ve tekrarlanabilirlik için gereklidir. 30 dakika genellikle insan mutant TDP-43'ü ifade eden transgenik suşlar gibi orta ila şiddetli fenotipler arasında vahşi tip solucanlara kıyasla farklar oluşturacak kadar uzundur (Şekil 4). Zaman değişkeni uzatılacaksa, plakanın boyutunun 100 mm'den 150 mm'ye çıkarılması da önerilir. Sıcaklık ve nem gibi çevresel faktörler, tipik olarak ortam odası sıcaklığında gerçekleştirilen bu tahlilleri etkileyebilir, bu nedenle çoğaltmalar arasında karşılaştırma yaparken her zaman vahşi tip (N2) kontrolü kullanmak önemlidir. Ek olarak, bu test, sıvıda normal yüzme davranışı sergilemeyen bazı suşların hareketliliğini ölçebilir (kırbaçlama), yüzme testine yararlı bir tamamlayıcıdır.
Yüzme tahlil: Solucan yüzmesinin izlenmesini ve analizini otomatikleştirmek için görüntüleme ve edinme sisteminin kullanılması, titiz ve tarafsız verilere izin verir. Bununla birlikte, denemenin ilk kurulumu sırasında örnekler arasında kontrol edilmesi gereken birkaç faktör vardır. Bunlar, kayda başlamadan önce sıvıya alışma süresini, ortam koşullarını (örneğin sıcaklık, nem) ve tutarlı ışık ve kayıt ayarlarını içerir. Kayıt aşamasında, plakalar arasındaki değişkenliği azaltmaya yardımcı olan çeşitli özellikler vardır. Bunlar arasında, video kaydına plakalar arasında tutarlı hale getiren entegre bir parçaya monte kamera ve parlak alan aşaması, kayıt sırasında yansımaları, parlamayı ve hava hareketlerini önleyen sahne alanının etrafında koruma ve solucanları güvenilir bir şekilde algılayan ve video sonrası işlemdeki parçaların manuel olarak düzeltilmesini sağlayan sağlam bir yazılım paketi bulunur. Bu protokolde, solucanlı 35 mm'lik bir plakanın videoları 1 dakika boyunca kaydedilir ve daha sonra yazılım paketi kullanılarak işlenir. İşlemden sonra, izlerin manuel olarak düzeltilmesi, solucan davranışlarının şaşırtıcı izleme hataları olmadan doğru bir şekilde kaydedilmesini sağlar. Dönüş sayısı ve izleme süresi verileri, son okuma olarak dakika başına dönüşleri belirlemek için kullanılır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, her biri 40-50 hayvan puanlanmış en az 3 bağımsız çoğaltma deneyi üzerinden veri toplanır ve toplam son hayvan sayısı 120-150'ye ulaşır. Bu sayı, yüzme davranışındaki küçük farklılıkları kontrol solucanlarından ayırt etmek için yeterlidir. Bazı solucanların yüzerek test edilemeyecek kadar ciddi motor açıkları vardır. Örneğin, beklenen dayak tepkisini yerine sıvı bir orta kıvrılmaya yerleştirilen hayvanlar, bu tahlil bu hareketleri doğru bir şekilde kaydetmez ve radyal hareketlilik gibi başka bir hareket testi bu hareketlilik kusurlarını daha iyi yakalayabilir. Sağlanan protokol ticari olarak kullanılabilen bir görüntüleme sistemi kullanır (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'na bakın), ancak diğer solucan izleme sistemleri benzer bir yardımcı program sağlayabilir ve bazıları açık kaynak12'dir. Daha önce yayınlanan yöntemler solucan kırbaçlamanın manuel puanlamasını açıklar13. Otomatik analiz her bir solucan için bir dizi ölçüm üretirken, dakikada thrashes ile ölçülen vücut bükümlerinin tespiti, deneyler ve izler arasında, solucan kırbaçlarının gözle geleneksel puanlamasıyla tutarlı sonuçlar sağlar.

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronlar üzerinde özel bir etkisi olan zayıflatıcı, yaşlanmaya bağlı bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık, beyin ve omurilikte motor nöron kaybı ve ilerleyici motor bozukluk içerir. Bu, tipik olarak tanıdan sonraki 3-5 yıl içinde majör fonksiyonel sakatlık ve erken ölümle sonuçlanır1. En az 38 gendeki mutasyonlar ALS'ye neden olabilir; Bununla birlikte, ALS'li hastaların çoğu nöronlarda ve glial hücrelerde birincil patoloji olarak TDP-43 proteininin her yerde bulunan inklüzyonlarını biriktirir2,3,4. ALS in vivo'ya neden olan veya katkıda bulunan temel mekanizmaları incelemek için bir dizi hayvan modeli geliştirilmiştir (in5'te gözden geçirilmiştir). C. elegans'ta bu modeller ALS'ye neden olan genlerin homologlarında genetik fonksiyon kaybı mutasyonlarını veya insan ALS genlerinin transgenik ekspresyonunu içerir. C. elegans'ta ALS modellemenin sayısız avantajı vardır. C. elegans, farklılaşmış bir sinir sistemine, iyi karakterize edilmiş davranış paradigmalarına ve insanlara önemli genetik homolojiye sahip çekilebilir basit bir hayvandır6,7. Güçlü genom düzenleme yetenekleri, nörodejenerasyon in vivo floresan muhabirleri, RNAi tarama paradigmaları, çekişli genetik ve yerleşik davranışsal ve fenotipik tahliller de dahil olmak üzere C. elegans ile çalışmak için birçok araç mevcuttur. C. ELEGANS ALS modelleri, çözünmeyen protein birikimi, nörodejenerasyon ve erken ölüm de dahil olmak üzere insan hastalığının yönlerini yeniden özetler8,9. Ayrıca, hem emekleme hem de yüzme davranışlarında rahatsızlık içeren motor disfonksiyon birçok C. elegans ALS modelinde mevcuttur.
Bu protokol , C. elegans motor fenotiplerini karakterize etmek için iki yöntemi açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi değerlendirmek için radyal hareketlilik testi ve WormLab otomatik izleme ve analizini kullanarak sıvıda yüzmenin (kırbaçlama) değerlendirilmesi. Motor açıklarını karakterize etmek için bu hassas yöntemler, şiddetin karşılaştırılmasına izin verir ve motor fenotiplerin baskılanması ve geliştirilmesini ölçmek için araçlar sunar. Radyal hareketlilik testi, solucan popülasyonları arasında sürünen hareketlilikteki (katı bir yüzeydeki sinüzoidal hareket) farklılıkları ölçen testtir. Bu tahlil, solucanları bir tabağa tek bir yere yerleştirerek ve belirli bir süre sonra son konumlarını işaretleyerek C. elegans doğal uyarılmamış keşif davranışından yararlanır10. Alternatif olarak, sıvı (kırbaçlama) testlerinde yüzmek, belirli bir süre boyunca bireysel solucanların vücut bükülmelerini sayar. Vücut virajlarının insan gözüyle manuel olarak sayılması zaman yoğundur ve tipik olarak deneyciler arasında önemli bir değişkenlik gösterir. Bilgisayar destekli otomatik izleme ve analizin kullanılması, bu değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırabilir. ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri, genetik veya küçük molekül müdahalelerinden farklı lokomotor fenotiplerinin modülasyonunu tespit edebilir. Bu yöntemler, ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>-</td>
			<td>Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pasteur pipets, borosilicate glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>Glass pipet used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 35x10mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>Assay plates for WormLab Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 60x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-090</td>
			<td>Stock plates for worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 100x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Standard radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dishes, 150x15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Longer time frame radial locomotion assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped markers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-810</td>
			<td>Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flatbed Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Epson Perfection V850</td>
			<td>Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional free software provided by the NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>IC113037012</td>
			<td>Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM (Nematode Growth Medium)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76347-412</td>
			<td>Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50&#160; bacteria</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Primary food source for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76207-552</td>
			<td>Pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-384</td>
			<td>Tips for pipettor, used in swimming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.2032mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT136585-5M</td>
			<td>Fine gauge platinum wire used to create worm pick - hold glass pipette in one hand and ~1&#34; of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56510-001</td>
			<td>Need to score radial locomotion assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormLab Imaging System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>WormLab</td>
			<td>The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of motor impairment in c. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis

Nörodejeneratif hastalık amyotrofik lateral skleroz (ALS), zamanla kötüleşen kas zayıflığı ve motor bozukluk eşliğinde motor nöronların ilerleyici kaybına sahiptir. Hastaların bir alt kümesi için ALS'nin genetik sürücülerinin belirlenmesinde önemli ilerlemeler elde edilmiş olsa da, vakaların çoğunda bilinmeyen bir etiyoloji vardır. Ayrıca, motor nöron disfonksiyonu ve dejenerasyonun altında kalan mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır; bu nedenle, bu süreçleri incelemek için temsili modeller geliştirmek ve karakterize etmek için devam eden bir ihtiyaç vardır. Caenorhabditis elegans , laboratuvar ortamında incelenen iki birincil hareket paradigması ile hareketlerini çevrelerinin fiziksel kısıtlamalarına uyarlayabilir - katı bir yüzeyde sürünür ve sıvı içinde yüzer. Bunlar duyum, motor nöronlar ve kaslar arasında karmaşık bir etkileşimi temsil eder. C. ELEGANS ALS modelleri bu hareket paradigmalarından birinde veya her ikisinde de bozulma oluşturabilir. Bu protokol, C. elegans'taki hareketliliği değerlendirmek için iki hassas tahlil açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi ölçen optimize edilmiş bir radyal hareketlilik testi ve sıvıda yüzmeyi izlemek ve analiz etmek için otomatik bir yöntem (kırbaçlama). ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, bu tahliller fenotiplerin genetik veya küçük molekül müdahalelerinden baskılanmasını veya arttırılmasını tespit edebilir. Bu nedenle, bu yöntemler ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.

Hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri hareketlilik bozukluğunun hassas bir şekilde tespitini sağlar (Şekil 4 ve Şekil 5). ALS'de patolojik TDP-43'ün altında kalan mekanizmaları araştırmak için, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 pan-nöronally'yi ifade eden C. elegans modelleri geliştirilmiştir. Bu hayvanlar, motor disfonksiyon9 da dahil olmak üzere ALS'yi anımsatan moleküler ve hücresel özellikler gösterir. Daha da önemlisi, hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri kullanarak ALS-mutant TDP-43'ü ifade eden hayvanlarda vahşi tip insan TDP-43 ekspresyasyonu ve daha şiddetli hareketlilik bozukluğu ile orta derecede hareketlilik bozukluğu gösterirler. Bazı mutant veya transgenik hayvanlar, emeklemede yüzmekten daha fazla bozulmaya sahip olacaktır veya bunun tersi de olabilir. İki farklı hareketlilik tahlilleri kullanılarak, suşlar arasındaki fenotipik farklılıkların daha net bir resmi elde edilir.
Radyal hareketlilik Tohumlu bir ağar tabağına yerleştirildiğinde, C. eleganlar besin kaynaklarının sınırlarını aramak da dahil olmak üzere çevrelerini keşfederler. Radyal hareketlilik tahlilleri, fiziksel uygunluk için bir metrik olarak bu davranışlardan yararlanmanın bir yoludur. Radyal lokomotor testi, lokomotor davranışını (katı bir yüzeyde sürünerek) kontrollü ve ölçülebilir bir şekilde analiz ederek, motor açıklarının ve motorla ilgili diğer fenotiplerin şiddetini değerlendirmek için basit ve etkili bir araç sunar. Radyal hareketlilik tahlilleri, orta veya ağır derecede bozulmuş ALS model solucanlarında hareketlilik farklılıklarını yakalar ve hareketlilik fenotiplerinin modülasyonunu veya hareketlilikteki değişiklikleri yaşla karşılaştırmak için bir taban çizgisi sunar (Şekil 6). Bu strateji, hareketi vahşi tipten (N2) veya kontrol solucanlarından değiştiren herhangi bir türün gezinme davranışını ölçmek için uygulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, silindir mutantlar veya felçli hayvanlar gibi normal şekilde sürünemeyen hayvanları değerlendirmek için iyi bir seçim olmayabilir. Tipik olarak, vahşi tip solucanlar 20 °C'de yükseltildiğinde ve test edildiğinde ortalama 200-300 μm / dk arasında bir yer değiştirme sunacaktır. Şekil 4'te sunulan örnek veriler, vahşi tip insan TDP-43'ü hafif bir fenotip [TDP-43(WT-hafif), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] veya daha güçlü fenotip [TDP-43(WT-orta), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]], mutant insan TDP-43'ü şiddetli fenotip [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]) ve başka bir nörodejeneratif hastalık ilişkili proteini ifade eden transgenik bir suş, vahşi tip insan tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Vahşi tip TDP-43'i ifade eden iki suş, radyal locomotion tarafından tespit edildiği gibi farklı derecelerde bozulmaya sahiptir. TDP-43(WT-low) N2'den önemli ölçüde farklı değildir, TDP-43 (WT-yüksek) ise hareketlilikte net farklılıklar sergiler. TDP-43(M337V) ve tau (WT) suşları hareketlilikte daha ciddi bozukluklara sahiptir.
Yüzme tahlilleri C. eleganlar sıvıya daldırıldığında basmakalıp yüzme (kırbaçlama) hareketine girerler. Dalgıçlık anında, solucanlar karakteristik olarak baş ve kuyruğu yaklaşık 45 ° büküm açısıyla birbirlerine doğru bükmeye başlar ve açı köşesi solucanın orta noktasıdır. Solucanlar ventral ve dorsal yönlerde bükme dönüşümlü. Yazılım tarafından ölçülen bir dayak, yönlülükten bağımsız olarak doğrudan 20° veya daha büyük bir gövde büküm açısına gitme hareketini temsil eder (açı eşiği , Analiz ve Çizim penceresinde işlem sonrası ayarlanabilir [İş Akışı | Veri | Çözümleme Vücut Şekli | Bükme Açısı | Orta Nokta | Genlik Eşiği: # derece]. Burada açıklanan yüzme tahlili, yüzme aktivitesinin tarafsız puanlamasını sağlamak için otomatik bilgisayar tabanlı izleme ve analiz kullanır. Vahşi tip (N2) solucanların 20 °C'de yükseltildiğinde ve kaydedildiğinde dakikada ortalama 150-200 kırbaç olması beklenir. Şekil 5'te sunulan örnek veriler, vahşi tip insan TDP-43'ü hafif bir fenotip [TDP-43(WT-hafif), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43) ile ifade eden iki farklı transgenik suş olan N2'yi karşılaştıran beklenen sonuçları gösterir; Pmyo-3::GFP])] veya daha güçlü fenotip [TDP-43(WT-orta), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])] ve başka bir nörodejeneratif hastalık ilişkili proteini ifade eden transgenik bir suş, vahşi tip insan tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] ifade eden transgenik suş sıvıda çırpınmaz ve bu nedenle grafikte ND (veri yok) olarak gösterilir. Bu test, Şekil 4'te gösterilen radyal locomotion testinden farklı fenotipleri ayırt edebilir. Örneğin radyal locomotion testinde (Şekil 4), TDP-43(WT-low) N2'den önemli ölçüde farklı değildi. Bununla birlikte, yüzme testinde (Şekil 5), hem TDP-43 (WT-low) hem de TDP-43 (WT-high) N2'den önemli ölçüde farklı olduğu gibi, bir birinden de önemli ölçüde farklıdır. Ayrıca, hem TDP-43 (M337V) hem de tau (WT) radyal hareketlilik nedeniyle ciddi emekleme bozukluklarına sahip olmasına rağmen (Şekil 4), sadece tau (WT) yazılım tarafından izlenecek kadar kırbaçlanabilir (Şekil 5). TDP-43(M337V) hayvanlar kırbaçlayamaz ve yazılım tabanlı analiz bu solucanları doğru bir şekilde algılamaz veya izlemez. Böylece, bu solucanlarla ilgili veriler toplanmadı (ND, veri yok).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg"> Şekil 1: Radyal locomotion test iş akışı. Paneller A-E radyal locomotion testinin genelleştirilmiş adımlarını gösterir. Adımlar şu şekildedir: (A) KENARLARINA OP50 tohumlu NGM Plakaları, merkezi nokta ile işaretlenerek ve işaretlenerek hazırlanır, (B) solucanlar orta nokta ile işaretlenmiş olarak agarın ortasına yerleştirilir, (C) solucanların belirli bir süre serbestçe hareket etmesine izin verilir, (D) plakası aşağıdan yukarıya çevrilir ve her solucanın son konumu orta noktadan farklı bir renkte işaretlenir, (E) Elle veya dijital olarak ölçülen orta noktadan her son solucan konumuna olan mesafe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg"> Şekil 2: ImageJ kullanılarak nihai konumun dijital ölçümü.  Plakanın ImageJ (A) tarama arka tarafını çerçevede bir cetvelle dijital olarak ölçmek için merkez ölçümlerinden uzaklık elle veya dijital olarak ölçülebilir. (B) Çizgi aracını kullanarak bilinen bir uzunluk çizin. (C) Ölçeği ayarlamak için (B) içinde çizilen bilinen uzunluğu kullanın [Analiz | Ölçeği Ayarla...]. (D) Orta noktadan son konum işaretine bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın, her işaret için yineleyin. (E) Puanlamada ölçülen ilk işareti işaretleyen bir boya fırçası çizgisi (1 işaretin yanındaki dalgalı siyah çizgi). Son konum işaretleri, puanlamanın yönünü göstermek için sarı olarak numaralandırilir. (F) Ölçümler Sonuçlar penceresine kaydedilir. İstatistiksel analiz için sonuçları başka bir yere kaydedin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg"> Şekil 3: Yazılımın kullanılmasına yönelik malzeme ve donanım ayarlamaları. (A) Yazılım destekli yüzme tahlilleri için kullanılan malzemeler. (B) Yazılımın ve gerekli malzemelerin genel kurulumu, muhafazanın yükseltilmiş konumda olduğunu unutmayın. (C) Lens montaj braketi yüksekliği ayarlanabilir. Bu görüntüde, ayarlanabilir pist ve yüzme testlerini gerçekleştirmek için tercih edilen yüksekliği işaretleyen bir bant göstergesi gösterilebilir. Kayıt yapmadan önce parlak alan ışığını ve kamera odağını ayarlamak gerekir. (D) Sahneye 35 mm'lik bir test plakası yerleştirilir, plakaya M9'daki hayvanlar eklenir ve 1 dakikalık bir zamanlayıcı başlatılır. (E) Solucanları merkeze yaklaştırmak için plakayı hafifçe döndürmek bazen avantajlıdır - canlı yakalama ekranında konumu gözlemleyin; alternatif olarak, solucanları ayırmak için bir pipettörden birkaç damla M9 kullanılabilir. (F) Kamera lensinin netleme halkasını ayarlayın, en iyi odağı belirlemek için ekrandaki solucanları gözlemleyin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg"> Şekil 4: Radyal hareketlilik tahlilleri tarama hızındaki farklılıkları tespit eder. Gelişimsel olarak sahnelenen L4 larvalarının uyarılmamış dağılımı, yukarıda açıklanan radyal locomotion testi kullanılarak ölçüldü ve μm/dk seyahat (A-B) olarak grafiklendi. (A) ve (B) öğelerinde çizilen aynı veriler iki farklı olası grafik sunuyu gösterir. (A) içinde, veriler bir çubuk grafik olarak görüntülenir ve gerinimler arasındaki göreli farkları daha net hale getirir. (B) içinde, her solucanın son yer değiştirmesi grafik içinde yer alır ve popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Test edilen suşlar arasındaki önemi değerlendirmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile varyansın (ANOVA) tek yönlü analizi kullanılmıştır. **p=0.0022, ****p<0.0001, ns=önemli değil. TDP-43(M337V) ve tau(WT) da N2, p<0.0001'den önemli ölçüde farklıdır. (A) hata çubukları ortalamanın standart hatasıdır (SEM) ve (B) standart sapmadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg"> Şekil 5: Yüzme tahlilleri sıvıdaki dayaktan farklılıkları tespit eder. Yüzme oranları (sıvıda kırbaçlama veya dalgalanma sıklığı) yukarıda açıklanan tarafsız bilgisayar destekli puanlama ve analiz kullanılarak ölçüldü ve thrashes/dk (A-B) olarak grafiklendi. (A) ve (B) içinde çizilen verilerle aynıdır. (A) içinde veriler, suşlar arasındaki göreli farklılıkların görülmesini kolaylaştıran bir çubuk grafik olarak grafiklendirilir. (B) içinde, puanlanan her bir solucandan elde edilen veriler grafik içinde çizilir ve popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Test edilen suşlar arasındaki önemi değerlendirmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile varyansın (ANOVA) tek yönlü analizi kullanılmıştır. s<0.0001, ns=anlamlı değildir. TDP-43(WT-orta) ve tau(WT) da N2'den önemli ölçüde farklıdır, p<0.0001.A) hata çubukları ortalamanın standart hatasıdır (SEM) ve (B) standart sapmadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg"> Şekil 6: Mutant TDP-43 solucanları vahşi tip solucanlardan daha az seyahat eder. Sahnelenmiş L4 N2 (vahşi tip) ve TDP-43(M337V) (CK423(bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), oda sıcaklığında 1 saat boyunca uyarılmadan süründükten sonra ciddi şekilde bozulmuş motor fonksiyonu olan mutant insan TDP-43'ü ifade eden bir suş. Plakalar orta nokta için kırmızı bir nokta ve hayvanların son konumu için mavi noktalar ile işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Görüntüleme ve izleme yazılımı kullanılarak yüzme davranışının kaydedilme şekli. (A) İzleme iş akışı ve video yakalama simgesinin konumu. (B) Video Yakalama penceresi Canlı Görüntü'de gösterilir ve en önemli hususlar vurgulanır. Kayıt düğmesi etkinleştirildiğinde yeşil "Canlı görüntü" sözcükleri kırmızı bir "Kayıt" olarak değişir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: Yüzme davranışının hazırlanması ve izlenmesi. Bu şekilde, izleme için bir video görüntü dizisi ayarlamaya yardımcı olacak bir dizi ekran görüntüsü gösterilir. Video dizisi hazırlamanın genel protokolü, her iş akışı menüsünü şu sırada açmaktır: Görüntü Sırası | Sıra Bilgisi | Ayarlama Görüntü | Ayarla | Algılama ve İzleme Projeyi Kaydet. Verileri Çözümle penceresi yalnızca bir proje dosyası izlendikten sonra kullanılabilir. (A) Diziyi İzleme iş akışı içinden yazılıma aldıktan sonra açılmış bir .avi (video) dosyası gösterir. (B) Sıra Bilgilerini Ayarla penceresi notlar için bir yer sağlar, ölçeği ayarlar/değiştirir ve bir video dizisi için meta verileri denetler. Ölçeği değiştirme yönergeleri bu pencerede bulunur ve fotoğraf makinesi alçaltılırken veya yükseltildiğinde (B) takip edilmelidir. Resim (C), Görüntüyü Ayarla penceresi ayarlarını gösterir. (D) Algıla ve İzle penceresinin algılama sekmesini gösteren ekran görüntüsü. Solucanları algılamak yazılımı eğitmek için kullanılır ve her video dizisi için ayarlanmalıdır. İsterseniz ek algılama parametreleri burada ayarlanabilir. (E) Yüzme davranışını izlemek için önerilen ayarları içeren Algıla ve İzle penceresinin İzleme sekmesinin ekran görüntüsü. Bu, bir video dizisi ayarlamanın son adımıdır. Projeyi Kaydet penceresini kullanarak sırayı proje olarak kaydedin . Her video dizisi için bu adımları yineleyin. Ayarlar, iş yükünü azaltmak ve tüm dizilerin aynı şekilde ele alınmasından (gösterilmemesini) sağlamak için bir yapılandırma olarak kaydedilebilir. Proje dosyalarını analiz için izlemek için Toplu İş Akışı'na gidin. (F) Toplu İş akışına gitmek için kullanılan simgeyi gösterir ve (G) toplu işlem penceresini gösterir, ekle ve başlat düğmelerini vurgular ve izlenen bir proje dosyasının beklenen görünümünü gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 3: Yüzme davranış analizi. Bir proje dosyası izlendikten sonra [Dosya | kullanılarak açılabilir Projeyi Aç]. Solucanlar (A) içinde gösterildiği gibi yeşil renkte görünecektir. Videoyu ovalamak, videonun beklediği gibi işlendiğini hızlı bir şekilde kontrol etmeyi teklif ediyor, yeşil vurgulama ovma yaparken kaybolacak. Veri Çözümleme ve Çizim penceresi Verileri Çözümle iş akışı öğesinden açılır. (B) Konum görünümü açıkken (varsayılan) Veri Analizi ve Çizim penceresini gösterir, tüm izler vurgulanır. Veri noktalarının altında, vurgulanan her solucan için kaydedilen parçayı gösteren bir çizim vardır. Parça özeti analizi, dakika başına hesaplanan dönüşler için kullanılır. (C-D) parça özeti raporunu ve dışa aktarma ayrıntılarını gösterir. (E-F) bir elektronik tabloda parça özetini ve dakika başına dönüşlerin nasıl hesaplanacağını, bu testte ölçülen çıktıyı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.

C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Protokolümüz C.elegans hareketini ölçen iki tahlil sunuyor. Bu yöntemler, Amyotrofik Lateral Skleroz veya ALS modelleri tarafından sergilenenler gibi hareketlilik fenotiplerini değerlendirir. Radyal Locomotion Testi, katı bir yüzeyde gezinmeyi tespit etmek için uygun maliyetli ve kolay bir yöntemdir.Yüzme Tahlilleri, sıvıdaki kırbaçlama hareketlerinin tarafsız tespiti için bilgisayar tabanlı izleme kullanır. Bu yöntemler C.elegans hareket farklılıklarını ölçmek için yararlıdır. ALS'yi incelememize rağmen, değiştirilmiş hareketlilik ile herhangi bir suş için kullanılabilirler.NGM test plakalarını ters çevirin. Ve c.elegans suşlarının tahlil edilmesi için alt kısmı bir tanımlayıcı ile etiketle. Baş aşağı plakanın ortasındaki işaretleyici ile küçük bir nokta yapın.Bir diseksiyon mikroskobu ile çalışırken, solucanları test plakasının ortasına aktarın. Ve 30 dakikalığına bir zamanlayıcı ayarlayın. Kapağı tekrar tabağa koyun ve bir kenara koyun.Tüm suşlar belirlenen test plakalarına gelene kadar solucanları aktarmaya devam edin. 30 dakika sonra, kapağı çıkararak ve plakayı kesme mikroskobu altında yüzüstü yerleştirerek ilk plakayı puanlamaya başlayın. Tüm solucanlar Auger'dan görünene kadar mikroskop odağını ayarlayın.Orta noktadan farklı bir renkli keçeli uç kalem kullanarak, her solucanın konumuna küçük bir nokta koyun. Bazı solucanlar oraya varabileceğinden plakanın kenarını kontrol edin. Ayrıca, merkez noktadan kaç solucanın hareket etmediğini sayın ve kaydedin.Her solucan için merkez noktasından son konum işaretlerine olan mesafeyi ölçün ve bir cetvel kullanarak mesafeyi kaydedin. İlk solucan noktası bir çizgi ile işaretlenir. Plakayı saat yönünde döndürerek her nokta için ardışık olarak uzunluk verilerini kaydedin.Videoları ayarlamak ve kaydetmek için ilişkili yazılımı açın. Video yakalama simgesine tıklayın. Dimmer düğmesine bastırın ve ışığı ayarlamak için saat yönünde çevirin.Video yakalama penceresinde, ayarlar sekmesine tıklayın ve video modunu 2456x2052_Mono8, kare hızı 14'e, tek renkli olarak çıkışa ayarlayın. 0.00300 saniye pozlama. Kazanç 1 dB'ye.Gama bire. Ve 180'e dön. Yakalama sekmesine geri dönün, kayıt klasörünü seçin ve dosya öneki metin kutusuna girerek bir dosya adı atayın.Arabellek gibi diğer yakalama ayarlarını 128 kareye ve süreyi bir dakikaya ayarlayın. Test plakasını cihaz sahnesine yerleştirin ve video yakalama ekranına ortalayın, ardından kapağı çıkarın. 1 ml M9'da yaklaşık 50 solucanı test plakasına yıkamak için bir mikropipette kullanın.Hayvanları merkeze getirmek için plakayı hafifçe döndürün veya hayvanları ayırmak için birkaç damla M9 eklemek için bir mikropipette kullanın. Solucanların yüzmeye alışmasına izin vermek için 60 saniye boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın. Işık düğmesini, ekranın mümkün olduğunca parlak olacak şekilde aşırı pozlamadan ayarlayın.Ekranı izlerken odaklama halkasını kameranın lens gövdesine çevirerek kamera odağını manuel olarak ayarlayın. 60 saniye sonra kayıt düğmesine basın, görüntü sırasını içe aktar" iş akışı menüsünden ilk düğmeyi seçin ve bir videoyu bulup çift tıklayın. İş akışı menüsünden Sıra Bilgilerini Ayarla'yı seçin"Yeni menü penceresinde adlandırma düzenini denetleyin, notlar ekleyin ve meta verileri doğrulayın.Görüntüyü Ayarla"yı seçtiğinizde Görüntü Ayarlamaları" adlı yeni bir açılır menü açılır. Arka plan yumuşatmayı 10, Gauss yumuşatmayı beşe, Delikleri ikiye, Küçük nesne filtresini sıfıra doldurarak ve İntegral Türev Segmentasyonunu atlayarak görüntü işleme ayarlarını yapın. Eşik seviyesini, hayvanların tamamen yeşille doldurulması, ancak yine de arka plandan farklı olması için ayarlayın.Ardından Uygula'yı tıklatın"İş akışı menüsünden Algıla ve İzle'yi seçin"üç ila yedi solucan seçin ve algılama sekmesinde solucanları algıla"düğmesini tıklatın. İzleme sekmesine gidin. İzleme parametrelerinde Geri İzlemeYi Kullan"ı işaretleyin ve görüntünün kenarındaki solucanları izleme seçeneğinin işaretini kaldırın.Maksimum izlenen hipotezi beşe ayarla. İzleme modunu yüzmeye ayarlayın. Gelişmiş ayarlar bölümüne gidin ve solucanların sınıra dokunabileceği çerçeveleri 50 olarak ayarlayın.Çerçeve solucanları 500'e kadar çakıtabilir. Pozisyon toleransı 0,50'ye. Ve şekil toleransı 0.50'ye.Bu ayarları kaydedin ve yapılandırma olarak kaydederek bir denemedeki tüm videolar için dağıtın. Sol üst simge menüsünde yapılandırma yöneticisine gidin ve Kaydet" simgesini tıklatın. Bu yapılandırmaya bir ad ve açıklama verin.Ve Tamam'ı tıklatın"İş akışı menüsünde Projeyi Kaydet"İş akışı menüsüne gidip Toplu İşlem"i tıklatarak videoları izleyin'e tıklayın. Bu toplu işleme menüsünün dosya seçimi bölümünün altındaki Ekle düğmesini tıklatın. işlenecek tüm proje dosyalarına gidin ve seçin.Ardından Aç"Başlat'a tıklayın" düğmesine tıklayın ve ilk dosyadaki yeşil ilerleme göstergesine dikkat edin. Tüm dosyaların işlenmesine izin verin. Okunan tüm dosyalar tamamlandığında, yazılımı kapatın.Verileri Çözümle"parça özetine gidin. Ve verileri elektronik tablo okunabilir bir biçimde dışa aktarmak için sağ alttaki Dışa Aktar düğmesini kullanın. Forma sayfalama işlevlerini kullanarak her parça için dakika başına dönüşleri hesaplamak için Dönüş Sayısı"nı ve İzleme Süresini"ni kullanın.Beş farklı türün gelişimsel olarak sahnelenmiş L4 larvalarının uyarılmamış dağılımı Radyal Locomotion Testi kullanılarak ölçüldü. Ve dakikada mikro metre olarak grafiklendi. Çubuk grafikler olarak görüntülenen veriler, gerinimler arasındaki göreli farkları daha net hale getirir.Grafik içinde çizilen her solucanın son yer değiştirmesi, popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Sıvıdaki daralma veya dalgalanma sıklığı açısından yüzme oranları, tarafsız bilgisayar destekli puanlama ve analiz kullanılarak ölçüldü. Ve dakikada kırbaç olarak grafiklendi.Çubuk grafik verileri, suşlar arasındaki göreli farklılıkların görülmesini kolaylaştırır. Puanlanan her bir solucandan elde edilen veriler grafik içinde çizilirken, popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Radyal Locomotion Tahlilinde hafif TDP-43 suşu vahşi tip N2 suşundan önemli ölçüde farklı değildi.Bununla birlikte, Yüzme Testinde, hem hafif hem de güçlü TDP-43 suşları sadece vahşi tip N2'den değil, aynı zamanda bir birinden de önemli ölçüde farklıydı. ALS mutant TDP-43 suşu Radyal Locomotion tarafından ciddi emekleme bozukluğuna sahiptir ve sıvıda çırpınmaz. Tau-ekspresyon suşunun Radyal Locomotion'da ciddi bozuklukları vardır, ancak Yüzme Testi'nde kırbaçlanabilir.Bu yöntemlerle göz önünde bulundurulacak en önemli husus, çoğaltmalar arasında tutarlı denetimler sağlamaktır. Bu, hareketlilikteki değişimlerin çevresel koşullardan değil fenotipik farklılıklardan kaynaklanmalarını sağlar. Bu yöntemler, iki büyük C.elegans hareketlilik paradigmasının kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.Takip yöntemleri ek davranışsal karakterizasyon, biyokimyasal analiz veya kas veya nöron fonksiyonunun araştırılması içerebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

ve Otomatik Analizi<em&gt; C. elegans</emCelest Yazılım Kullanma&gt; Deniz Davranışı

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Multipl skleroz bireyler için kapsamlı otopsi programı

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...