Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
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这项工作得到了德国心脏学会（GLS的DGK研究奖学金）和德国研究基金会（DFG通过GLS和AD的IRTG 1816项目;DFG 417880571和DFG TI 956/1-1用于MT;SFB 1002 TP C04 用于 MT 和 WHZ;SFB 1002 TP S01 用于 WHZ;和 EXC 2067/1-390729940J 用于 WHZ）。WHZ得到了德国联邦科学与教育部（BMBF通过IndiHEART项目）和Leducq基金会（20CVD04）的支持。MT，WHZ和SL由德国心血管研究中心（DZHK）提供支持。

所有步骤都必须在安装在1级防护等级下的实验室的II类生物安全罩中进行。根据当地法规和要执行的操作类型，例如病毒介导的基因转移，必须将收容水平提高到生物安全级别2或3。所有培养物在37°C下保持在37°C的细胞培养箱中，空气中有5%CO 2 的加湿气氛。请注意，为T75细胞培养瓶提供体积（步骤1和2）。根据标准细胞培养建议，将体积调整为不同的培养形式。
1. 解?...

所提出的方案描述了从原发性人CF产生ECT，这允许研究这些细胞对其细胞外基质环境的机械影响，反之亦然。
成纤维细胞需要扩增以产生足够的细胞用于计划的ECT实验（0.75×106 细胞/ ECT）。为了获得最佳的可重复性，建议在2D单层培养物中预培养冷冻或组织衍生的成纤维细胞，标准化持续时间高达80%，每次传代内以及将其用于ECT生成之前（方案步骤3）。为了培养原代?...

纤维化疾病研究的一个主要障碍是缺乏具有代表性的人类3D组织模型，这些模型可以深入了解成纤维细胞及其病理衍生物的行为。为了研究纤维化过程，标准2D培养系统不是最佳的，因为分离的成纤维细胞在不合规的2D底物上培养时迅速转入α平滑肌肌动蛋白（SMA）表达肌成纤维细胞1，2，3。因此，标准2D培养物中的成纤维细胞不反映规则的"健康"组织表型3，4，5，6。在柔韧的底物上引入培养物以模拟非纤维化（10 kPa）和纤维化（35 kPa）组织环境7，但这些缺乏第三维度，这在病理生理学方面非常重要。组织工程提供了克服这一限制的机会，允许在定义且实验上可调的细胞外基质（ECM）环境中进行成纤维细胞培养，例如，通过细胞性，ECM组成和ECM浓度的改变，所有这些都可以确定组织生物力学。
使用成纤维细胞生成了各种3D模型。漂浮的圆盘和微球是最早的，并证明胶原蛋白以时间依赖的方式重塑和压实。成纤维细胞对胶原原纤维施加牵引力，这一过程可以通过添加促纤维化剂（例如转化生长因子-β1（TGF-β1））来促进。8,9,10,11,12,13,14,15,16.然而，自由漂浮的培养物不允许受控的外部载荷，因此构成连续收缩或压实模型。片状工程组织开辟了研究组织生物力学性质的稳态调节的可能性，即通过单，双轴，多轴或循环应变测试17,18,19,20.例如，这些模型已被用于证明细胞数量对组织刚度的影响，发现其与细胞骨架完整性和肌球蛋白细胞骨架收缩力呈正相关。18,19.然而，重要的是要注意，力到应变的转换由于力传感器和锚点的夹紧点周围的组织变形不均匀而变得复杂。这种固有的限制可以通过狗骨或环形组织绕过，在锚点提供一些组织执法21,22,23.环形组织可以通过将细胞胶原水凝胶分配到环形模具中来制备。当水凝胶致密时，在模具的不可压缩内棒周围形成组织，这为进一步的组织收缩提供了阻力24,25,26,27.在初始和通常最大压实后，组织也可以转移到可调节的垫片上，以进一步限制在定义的组织长度处的圆形ECT3,24,25,26,27,28,29,30.生物物理特性可以在标准水平或垂直应变应力设备中使用适当的称重传感器在单向或动态应变下进行评估3.由于组织具有大致均匀的圆形结构，并且可以保持在杆/钩（锚固点和/或力传感器）上，尽管这些可能仍将压缩区域封闭在加载杆周围，但与夹紧相比，这种格式允许更均匀的应变变化3.此外，锚定的组织引发双极细胞形状，并且细胞通过沿着促进各向异性牵引的力线伸长来适应组织力。31,32,33,34,35,36.我们以前在功能应激应变实验中将来自大鼠和人心脏成纤维细胞（CF）的环形ECT应用于单个刚性极点，并使用病毒转导成纤维细胞进行功能的获得和丧失研究24,25,26 和药理学研究37.此外，我们可以在ECT模型中识别CF介导的纤维化的性别差异。27.
以下用于生成人ECT的协议，以从商业供应商处获得的作为冷冻保存CF的初级人CF为例（见 材料表），将环形组织的优势与为48孔平台生产宏观组织的简单快速方法相结合，该平台设计用于并行高内涵测试。
重要的是，ECT模型不限于特定的成纤维细胞类型，并记录了用于研究其他成纤维细胞，例如皮肤成纤维细胞38，39。此外，来自患者活检的成纤维细胞同样有效，成纤维细胞的选择最终取决于要解决的科学问题。
该方案中描述的用于生成ECT的平台是市售的48孔3D细胞/组织培养板（图1A）。描述了在48孔板的帮助下，在定义的几何形状和机械载荷下制备，培养和监测ECT形成和功能的方法。成型的ECT由集成的柔性杆固定，机械载荷可以根据最终用途通过使用具有不同硬度的极（邵氏A值36-89）进行微调，从而影响其弯曲刚度。建议使用岸边 A 值为 46 的杆子。此外，该协议还与前面描述的定制圆形模具兼容，其中ECT围绕单个刚性杆37保持。该模具的尺寸如图 1B所示。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> 图1：铸造模具的示意图。 （A）具有两个柔性杆的铸造模具的技术图纸和尺寸。模具包括一个由短壁分隔的内周，该短壁在模具主体上固定双固定杆。柔性杆彼此之间具有自由的水平距离，并在底座处连接。该模具允许180 μL的浇注体积。每个模具的孔允许至少600μL培养基的体积容量。可以使用不同的材料成分来生产具有特定刚度的杆（例如，TM5MED-TM9MED）。（B）带有单个刚性杆的环形模具的技术图纸和尺寸。这是一种具有独特几何形状和机械环境的替代模具，可与ECT铸造协议一起使用37。环形模具装配方法改编自已发表的较大格式28，41。简而言之，该方法包括（1）将聚四氟乙烯（PTFE）模塑垫片（直径8毫米）倒入玻璃盘（直径60毫米）中的聚二甲基硅氧烷（PDMS，硅胶）中，以及（2）将PDMS杆架（直径1.5毫米）同心固定在形成的空腔内，其用于（3）保持可拆卸的极（直径4毫米硅胶管）。空心空间生成物允许180 μL的浇注体积。每个玻璃培养皿可以装入多个压印模具（例如，用5个模具显示），并且具有高达5 mL培养基的容量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

成纤维细胞是表型高度动态的细胞，它们响应生化和生物力学刺激迅速转入肌成纤维细胞。目前对纤维化过程（包括心脏纤维化）的理解仍然很差，这阻碍了新的抗纤维化疗法的发展。可控和可靠的人体模型系统对于更好地了解纤维化病理学至关重要。这是一种高度可重复和可扩展的方案，可在48孔铸造板中生成工程结缔组织（ECT），以促进在3D（3D）环境中研究成纤维细胞和纤维化组织的病理生理学。ECT在极点周围产生，刚度可调，允许在定义的生物力学载荷下进行研究。在定义的负载条件下，可以研究由细胞 - 基质相互作用控制的表型适应性。并行测试在48孔格式中是可行的，并有机会对多个参数进行时程分析，例如组织压实和针对负载的收缩。从这些参数中，可以研究组织刚度和弹性等生物力学特性。

与最初的细胞胶原水凝胶体积相比，ECT在前24小时内达到约95%的压实率。在控制条件下和存在食品接触物质的情况下，组织压实和收缩在铸造后数小时发生，并且明显增加至第5天（图5A）。在接下来的 15 天内，极点偏转可能会进一步增加（测试时间最长的时间为 20 天）。极点偏转的大小取决于细胞类型、细胞状态以及细胞和组织培养条件。通常，在培养的第5天测量生物力?...

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Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

这里介绍的是一种方案，用于在具有双极的多孔板中为48个组织的平行培养生成工程结缔组织，适用于机制研究，疾病建模和筛选应用。该协议与来自不同器官和物种的成纤维细胞兼容，并且在这里以人类原发性心脏成纤维细胞为例。

成纤维细胞衍生的人类工程结缔组织用于筛查应用

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

该协议允许成纤维细胞在定义的机械条件下构建和组织自己的环境。这些导致各向异性组织具有与细胞自然环境相当的刚度和基质组成。这种方法允许并行比较多达48个条件。它在所用细胞类型和培养条件方面具有灵活性。通过仅使用几个明确定义的组件，它可以在实验室之间重复。通过应用促纤维化因子或抗纤维化药物，该协议可用于研究任何类型的纤维化疾病的潜在过程和治疗方法。演示该程序的将是我们实验室的博士生Alisa Degrave和我自己。首先，在37摄氏度的水浴中解冻保存的心脏成纤维细胞约两分钟，直到小瓶只剩下少量冰。接下来，使用两毫升血清学移液管将细胞悬浮液滴转移到含有10毫升成纤维细胞生长培养基的适当无菌离心管中。为了获得最佳的细胞检索，用一毫升FGM冲洗冷冻小瓶并将其转移到离心管中。轻轻重悬细胞并转移到细胞培养瓶中。每隔一天补充一次女性生殖器切割，持续五天或直到细胞达到80%汇合度。从培养的细胞中吸取培养基后，用六毫升PBS洗涤细胞并吸出，然后将六毫升细胞解离试剂加入细胞并孵育直到细胞分离可见。通过向细胞关联试剂中移出的细胞中添加6至12毫升FGM来中和酶活性。使用10毫升血清学移液器轻轻地上下移液四到八次，以确保单细胞悬浮液，并将细胞转移到新鲜的50毫升收集管中。根据制造商的说明，在自动细胞计数器的帮助下验证产量，并将细胞沉淀下来。离心后，吸出上清液，轻拂管以移走沉淀并在FGM中重悬细胞。接下来，通过40微米目细胞过滤器过滤细胞悬浮液，然后使用自动细胞计数器，通过电流排除评估细胞数量和活力，以确保可靠的细胞数量，然后再进行工程结缔组织或ECT制备。为了准备ECT，通过添加FGM将细胞悬浮液调整到20至25摄氏度的每毫升890万个细胞，并将细胞保持在冰上。将含有ECT水凝胶混合物单个组分的所有其他管转移到冰上，并预冷空的50毫升离心管以制备混合物。通过将文本中描述的组分添加到预冷的50毫升离心管中来开始制备ECT水凝胶混合物，以避免气泡形成。首先，将酸溶性I型胶原蛋白水凝胶移液到具有宽孔径尖端的血清学移液器中。通过添加DMEM来调整胶原蛋白溶液的盐含量，同时轻轻旋转管以进行适当混合。为了中和pH值，在旋转管时加入0.2摩尔氢氧化钠，并通过观察酚红指示剂的红色来确认中和。然后滴加细胞悬浮液，同时轻轻旋转管子。使用具有宽孔口的血清学移液器轻轻地上下管道一次，以混合悬浮液，以避免气泡形成并最大限度地减少剪切应力。轻轻旋转管子10次，以便彻底混合。在整个铸造过程中，将含有ECT水凝胶混合物的离心管保持在冰上。在ECT水凝胶混合物中润湿一毫升移液器尖端，然后将180微升水凝胶混合物均匀地分配到48孔浇注板的每个模具中，避免可能影响胶原基质组件完整性的过度剪切力，并确保整个板在15至20分钟内完成。确保在模具内形成完整的环路，因为ECT混合物的不连续分布将防止完整的ECT环形成。避免在移液过程中移液到内孔并形成气泡，以确保均匀的ECT水凝胶浇注，从而形成均匀和功能性的组织。小心地将48孔浇注板放入细胞培养箱内，以重建ECT水凝胶混合物15至30分钟。孵育后，它看起来像凝胶状和不透明。沿着墙壁每孔轻轻添加600微升37摄氏度的温热FGM，以避免ECT从底部脱落。每天用500微升女性生殖器切割代替培养基，直到分析。在所需的时间点，使用体视显微镜记录ECT的顶部和侧面视图的显微图像。使用图像处理程序执行线阵扫描分析。设置刻度并使用直线工具在每个成像平面中每个臂至少六个位置跟踪和测量ECT直径。在记录设备下对48孔铸造板进行成像，该记录设备具有放置在固定距离的集成面阵扫描相机，并配有高分辨率单色图像传感器和近紫外光源。自动检测含有荧光染料的两极尖端，以最大限度地提高对比度。通过在软件上运行记录的图像来自动分析，以检测黑暗背景或图像处理程序上的高对比度明亮像素，从而使用自动分析来测量每日记录中的极点之间的距离。从固定杆上取下 ECT，然后插入转接钩和 ECT 环。然后将ECT转移到两个钩子上，夹在固定臂和扩展动态机械仪器的传感器臂上，该机械臂配备了充满PBS的37摄氏度回火风琴浴。通过将 Riometer 设置为每秒钩子之间初始距离的大约 1%，以恒定的线性速率施加单轴张力。0.03毫米/秒的恒定拉伸速率可用于典型的ECT尺寸。撕裂换能器的力并启动拉伸。通过横截面积归一化测得的力并绘制确定不同生物力学参数的应力 - 应变曲线后，继续记录直到ECT断裂点。就在组织开始微断裂之前，弹性区域的上限对应于屈服点，其应变是组织弹性的量度。塑性区域位于屈服点和失效点之间。失效点对应于由于组织破裂而导致的应力突然下降，定义了最终应变，这是组织延伸性的量度。第三个测量点对应于由组织在拉伸过程中可以承受而不会断裂的最高应力定义的最大强度。曲线下面积给出的弹性和韧性分别对应于组织吸收的能量，直至屈服点和失效点。对于每条得到的曲线，弹性区域线性部分的斜率对应于杨氏模量，也称为弹性模量。它是一种测量组织刚度的机械性能。使用该协议，在控制条件下和存在FCS的情况下，ECT压实和收缩在铸造后几个小时内进行，并且明显增加至第五天。当用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A处理ECT时，ECT压实度降低，如与对照组相比，横截面积显着增加。在五天的培养过程中评估组织的收缩。在没有Latrunculin A的情况下，收缩逐渐增加，直到第五天达到约40%的收缩。然而，Latrunculin A的存在影响了组织的收缩，导致只有约20%的最大收缩。肌动蛋白聚合抑制导致对照组织僵硬度显著降低约50%。这些结果表明，肌动蛋白细胞骨架完整性对于ECT压实，收缩和变硬至关重要。重要的是要选择可靠，高质量的胶原蛋白溶液，并确保使用具有高活力的单细胞悬浮液来重建工程结缔组织。

Research

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