Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Det Tyske Hjerteselskab (DGK Research Fellowship for GLS) og af den tyske forskningsfond (DFG gennem projektet IRTG 1816 for GLS og AD; DFG 417880571 og DFG TI 956/1-1 for MT; SFB 1002 TP C04 for MT og WHZ; SFB 1002 TP S01 for WHZ; og EXC 2067/1-390729940J for WHZ). WHZ støttes af det tyske forbundsministerium for videnskab og uddannelse (BMBF gennem projektet IndiHEART) og Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ og SL støttes af det tyske Center for Cardiovascular Research (DZHK).

Alle trin skal tages i en klasse II biosikkerhedshætter, der er installeret i laboratorier under indeslutningsniveau 1. Afhængigt af lokale regler og typen af manipulationer, der skal udføres, såsom viralt medieret genoverførsel, skal indeslutningsniveauet øges til biosikkerhedsniveau 2 eller 3. Alle kulturer opretholdes ved 37 °C i en cellekulturkuvøse med en befugtet atmosfære på 5 % CO2 i luften. Bemærk, at diskenhederne (trin 1 og 2) er beregnet til en T75-cellekulturkolbe. Juster mængderne til...

Den præsenterede protokol beskriver dannelsen af ECT fra primær human CF, som gør det muligt at studere disse cellers mekaniske indvirkning på deres ekstracellulære matrixmiljø og omvendt.
Fibroblastene skal udvides til at give tilstrækkelige celler til de planlagte ECT-eksperimenter (0,75 x 106 celler/ECT). For at opnå den bedste reproducerbarhed anbefales det at prækulturelle frosne eller vævsbaserede fibroblaster i 2D monolagskultur i en standardiseret varighed på op t...

En væsentlig hindring i studiet af fibrotiske sygdomme er manglen på repræsentative menneskelige 3D-vævsmodeller, der giver indsigt i fibroblasters adfærd og deres patologiske derivater. For at studere fibrotiske processer er standard 2D-kultursystemer suboptimale, da isolerede fibroblaster hurtigt transdifferentierer sig til α-smooth muscle actin (SMA)-udtrykke myokbroblaster, når de dyrkes på ikke-kompatible 2D-substrater1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen afspejler således ikke en regelmæssig "sund" vævsfænotype3,4,5,6. Kulturer på bøjelige substrater er blevet indført for at simulere ikke-fibrotiske (10 kPa) og fibrotiske (35 kPa) vævsmiljøer7, men disse mangler den tredje dimension, hvilket er meget vigtigt med hensyn til patofysiologi. Vævsteknik giver mulighed for at overvinde denne begrænsning ved at tillade fibroblastkultur i en defineret og eksperimentelt tunable ekstracellulær matrix (ECM)-kontekst, for eksempel ved ændringer i cellulæritet, ECM-sammensætning og ECM-koncentration, som alle kan bestemme vævsbiomekanikken.
Forskellige 3D-modeller er blevet genereret ved hjælp af fibroblaster. Flydende diske og mikrosfærer var blandt de første og viser, at kollagen er ombygget og komprimeret på en tidsafhængig måde. Fibroblaster udøver trækkraft på kollagen fibrils, en proces, der kan lettes ved tilsætning af pro-fibrotiske midler såsom omdanne vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Frit flydende kulturer giver dog ikke mulighed for kontrolleret ekstern belastning og udgør derfor kontinuerligt krympende eller komprimeringsmodeller. Arklignende manipuleret væv åbnede muligheden for at studere homøostatisk regulering af vævs biomekaniske egenskaber, nemlig gennem uni- bi-, multiaxial- eller cyklisk stammetest17,18,19,20. Disse modeller er blevet anvendt, f.eks. til at påvise cellenummerets indflydelse på vævsstivheden, som viste sig at korrelere positivt med cytoskeletonintegritet og actomyosin cytoskeleton contractility18,19. Det er dog vigtigt at bemærke, at kraft-til-stamme konverteringer kompliceres af den ikke-ensartede væv deformation omkring klemme punkter af kraft transducere og ankerpunkter. Denne iboende begrænsning kan omgås af hunde-knogle eller ring-formede væv, tilbyder nogle væv håndhævelse på anker-punkter21,22,23. Ringformede væv kan fremstilles ved at distribuere en celle-kollagen hydrogel i ringformede forme. Som hydrogel komprimerer, et væv former omkring dekomprimerbare indre stang af formen, som giver resistens for yderligere væv sammentrækning24,25,26,27. Efter indledende og typisk maksimal komprimering kan væv også overføres til justerbare afstandslænde til yderligere at begrænse cirkulære ECT på en defineret vævslængde3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiske egenskaber kan vurderes i standard horisontale eller lodrette belastningsspændingsenheder med passende belastningsceller under ensrettet eller dynamisk stamme3. Da vævene har en stort set ensartet cirkulær struktur og kan holdes på stænger / kroge (forankringspunkter og / eller krafttransducere), selvom disse stadig kan omslutte kompressionsområder omkring læssestængerne, giver dette format en mere ensartet stammevariation sammenlignet med fastspænding3. Desuden fremkalder forankret væv en bipolar celleform, og cellerne tilpasser sig vævskræfterne ved forlængelse langs kraftlinjer, der fremmer anisotropisk trækkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidligere anvendt ringformet ECT fra rotte- og humane hjertefibroblaster (CF) omkring en enkelt stiv stang i funktionelle stress-stammeforsøg og udført gain og tab af funktionsundersøgelser ved hjælp af viralt transduced fibroblaster24,25,26 og farmakologiske undersøgelser37. Desuden kunne vi identificere kønsforskelle i CF-medieret fibrose i ECT-modellen27.
Følgende protokol for generering af human ECT, eksemplificeret med primær human CF opnået som cryopreserved CF fra kommercielle leverandører (se Tabel over materialer), kombinerer fordelene ved ringformede væv med en nem og hurtig måde at producere makroskopisk væv til en 48-brønd platform designet til parallel højindhold test.
Det er vigtigt, at ECT-modellen ikke er begrænset til en bestemt fibroblasttype med dokumenteret anvendelse i forbindelse med undersøgelse af andre fibroblaster, f.eks. Desuden fungerer fibroblaster fra patientens biopsier lige så godt, og valget af fibroblaster afhænger i sidste ende af det videnskabelige spørgsmål, der skal løses.
Den platform, der anvendes til generering af ECT, der er beskrevet i denne protokol, er en kommercielt tilgængelig 48-brønd 3D-celle/vævskulturplade (figur 1A). Metoderne til forberedelse, dyrkning og overvågning af ECT-dannelse og -funktion under en defineret geometri og mekanisk belastning ved hjælp af 48-brøndpladen er beskrevet. Den dannede ECT holdes af integrerede fleksible poler, og den mekaniske belastning kan finjusteres i henhold til det endelige formål ved at bruge poler med forskellig hårdhed (Shore A-værdi 36-89), hvilket påvirker deres bøjningsstivheder. Polakker med en kyst En værdi på 46 anbefales. Protokollen er desuden kompatibel med en tidligere beskrevet brugerdefineret cirkulær form, hvor ECT holdes omkring en enkelt stiv stang37. Dimensionerne af denne form er angivet i figur 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af støbning forme. A) Teknisk tegning og dimensioner af en støbeform med to fleksible poler. Formen består af en indre omkreds afgrænset af en kort væg, der holder dobbelt fastholde poler på formens hovedkrop. De fleksible poler har en fri vandret afstand til hinanden og er forbundet ved bunden. Formen giver mulighed for 180 μL støbning volumen. Brønden af hver form giver en volumen kapacitet på mindst 600 μL af kultur medier. Forskellige materialesammensætninger kan bruges til at producere poler med specifikke stivheder (f.eks. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk tegning og dimensioner af en ringformet form med en enkelt stiv stang. Dette er en alternativ form med tydelig geometri og mekanisk miljø, som kan bruges med ECT støbning protokol37. Den ringformede skimmelsamlingsmetode blev tilpasset fra offentliggjorte større formater28,41. Kort sagt omfatter metoden (1) prægning af polytetrafluoroethylen (PTFE) støbningsrumsstykker (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikone), hældt i glasskåle (diameter 60 mm) og (2) fastgørelse af en PDMS-stangholder (1,5 mm diameter) koncentrisk inde i det dannede hulrum, som tjener til (3) at holde en aftagelig stang (4 mm diameter silikonerør). Den hule rum resulterende giver mulighed for 180 μL af støbning volumen. Hver glasskål kan comport flere påtrykte forme (eksemplarisk vist med 5 forme) og har kapacitet til op til 5 mL kulturmedium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Fibroblaster er fænotypisk meget dynamiske celler, som hurtigt transdifferentierer sig til myokbroblaster som reaktion på biokemiske og biomekaniske stimuli. Den nuværende forståelse af fibrotiske processer, herunder hjertefibrose, er fortsat dårlig, hvilket hæmmer udviklingen af nye anti-fibrotiske behandlinger. Kontrollerbare og pålidelige menneskelige modelsystemer er afgørende for en bedre forståelse af fibrosepatologi. Dette er en meget reproducerbar og skalerbar protokol til at generere manipuleret bindevæv (ECT) i en 48-brønd støbning plade til at lette undersøgelser af fibroblaster og patofysiologi af fibrotisk væv i en 3-dimensionel (3D) miljø. ECT genereres omkring polerne med tunable stivhed, giver mulighed for undersøgelser under en defineret biomekanisk belastning. Under de definerede belastningsforhold kan fænotypiske tilpasninger, der kontrolleres af cellematrixinteraktioner, studeres. Parallel testning er mulig i 48-brønd-format med mulighed for time-course analyse af flere parametre, såsom væv komprimering og sammentrækning mod belastningen. Fra disse parametre kan biomekaniske egenskaber som vævsstivhed og elasticitet studeres.

ECT når op på ca. 95 % komprimering sammenlignet med det oprindelige cellekollagenhydridvolumen inden for de første 24 timer. Vævskomprimering og sammentrækning under kontrolbetingelser og i nærværelse af FCS følger et par timer efter støbning og øges især op til dag 5 (figur 5A). Pole afbøjning kan yderligere stige i løbet af de følgende 15 dage (20 dage var den længste tid testet). Størrelsen af pole afbøjning afhænger af celletype, celle tilstand, og celle-og væv kultur...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Præsenteret her er en protokol til at generere manipuleret bindevæv til en parallel kultur på 48 væv i en multi-brønd plade med dobbelt poler, egnet til mekanistiske undersøgelser, sygdom modellering, og screening applikationer. Protokollen er kompatibel med fibroblaster fra forskellige organer og arter og er eksemplificeret her med humane primære hjertefibroblaster.

Fibroblast afledte humane manipuleret bindevæv til screeningsapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Denne protokol gør det muligt for fibroblast opbygge og organisere deres eget miljø under definerede mekaniske forhold. Disse resulterer i anisotropiske væv med stivhed og matrix kompositioner kan sammenlignes med cellens naturlige miljø. Denne metode gør det muligt at sammenligne op til 48 forhold parallelt.Det er fleksibelt med hensyn til de anvendte celletype og kulturforhold. Ved kun at bruge nogle få veldefinerede komponenter er det reproducerbart mellem laboratorier. Ved at anvende pro-fibrotiske faktorer eller antifibrotiske lægemidler, denne protokol kan bruges til at studere de underliggende processer og behandlinger af fibrotiske sygdomme af enhver art.Det vil være Alisa Degrave, en ph.d.-studerende fra vores laboratorium, og mig selv. Til at begynde med optø de kryokonserverede hjertefibroblaster i et vandbad ved 37 grader Celsius i cirka to minutter, indtil hætteglasset er tilbage med kun en lille mængde is. Overfør derefter celleaffjedringen dropwise ved hjælp af en to milliliter serologisk pipette til et passende sterilt centrifugerør, der indeholder 10 milliliter fibroblast vækstmedium.For optimal cellehentning skylles kryoglasset med en milliliter FGM og overføres til centrifugerøret. Forsigtigt genbruge cellerne og overføre til en celle kultur kolbe. Genopfyld FGM hver anden dag i fem dage, eller indtil cellerne har nået 80% sammenløb.Efter at have aspireret mediet fra de kultiverede celler, vask celler med seks milliliter PBS og aspirere, tilsæt derefter seks milliliter af celleadskillelsesreagensen til cellerne og inkuberer, indtil cellederivationen er synlig. Neutralisere enzymatisk aktivitet ved at tilføje seks til 12 milliliter FGM til de forvredne celler i celleforeningen reagens. Forsigtigt pipette op og ned fire til otte gange ved hjælp af en 10 milliliter serologisk pipette for at sikre en enkeltcellet suspension og overføre cellerne til en frisk 50 milliliter indsamling rør.Kontroller udbyttet ved hjælp af en automatiseret celletæller i henhold til producentens anvisninger og pellet ned cellerne. Efter centrifugering, aspirere supernatanten, svirp røret for at løsne pellet og genbruge cellerne i FGM. Dernæst stamme celle suspension gennem en 40 mikrometer mesh celle si, derefter ved hjælp af en automatiseret celle tæller, vurdere cellenummer og levedygtighed ved elektrisk strøm udelukkelse for at sikre pålidelige cellenumre, før du fortsætter med manipuleret bindevæv eller ECT forberedelse.For at forberede ECT skal du justere celleaffjedringen til de 8,9 millioner celler pr. milliliter ved 20 til 25 grader Celsius ved at tilføje FGM og holde cellerne på is. Overfør alle de andre rør, der indeholder de enkelte komponenter i ECT hydrogelblandingen, til is og forkøl et tomt 50 millilitercentrifugerør for at forberede blandingen. Begynd at forberede ECT hydrogelblandingen ved at tilføje komponenter, der er beskrevet i teksten, til det forkølede 50 millilitercentrifugerør, så du undgår dannelse af luftboble.For det første pipette den syreopløselige kollagen type I hydrogel i en serologisk pipette med en bred borespids. Juster saltindholdet i kollagenopløsningen ved at tilsætte DMEM, mens røret forsigtigt hvirvler for korrekt blanding. For at neutralisere pH skal du tilføje 0,2 molar natriumhydroxid, mens du hvirvler røret og bekræfter neutraliseringen ved at observere den røde farve på den phenolrøde indikator.Tilsæt derefter celleaffjedringen dropwise, mens du forsigtigt hvirvler røret. Bland affjedringen ved forsigtigt at røre op og ned kun én gang ved hjælp af en serologisk pipette med en bred borespids for at undgå bobledannelse og minimere forskydningsstress. Hvirvl forsigtigt røret 10 gange for grundig blanding.Hold centrifugerøret, der indeholder ECT hydrogelblanding, på is under hele støbningsprocessen. Våd en en milliliter pipettespids i ECT hydrogelblanding, og fordel derefter 180 mikroliter hydrogelblanding jævnt i hver form af den 48-brønds støbningsplade, der undgår for store forskydningskræfter, der kan påvirke kollagenmatsamlingens integritet og sikre, at hele pladen slutter om 15 til 20 minutter. Sørg for, at en komplet løkke former inden for formen som diskontinuerlig fordeling af ECT blanding vil forhindre en komplet ECT ring dannelse.Undgå at s pipetter ind i den indre brønd og danne bobler under pipetter for at sikre en ensartet ECT hydrogelstøbning for homogen og funktionel vævsdannelse. Placer forsigtigt 48-brøndsstøbningspladen inde i cellekulturinkubatoren for at rekonstruere ECT hydrogelblandingen i 15 til 30 minutter. Efter inkubation ser det gellignende og uigennemsigtigt ud.Tilsæt 600 mikroliter på 37 grader Celsius varm FGM pr. brønd langs væggen forsigtigt for at undgå ECT-løsrivelse fra bunden. Udskift mediet hver dag med 500 mikroliter af FGM indtil analyse. På det ønskede tidspunkt skal du bruge et stereomikroskop til at optage mikroskopiske billeder af EKG'ens top- og sidevisninger.Brug et billedbehandlingsprogram til at udføre en linjescanningsanalyse. Indstil en skala, og brug værktøjet lige linje til at spore og måle ECT-diametre på mindst seks positioner pr. arm i hvert billedplan. Billede 48-brøndsstøbningspladen under en optageenhed med et integreret områdescanningskamera placeret i en fast afstand udstyret med en monokrom billedsensor i høj opløsning og en nær-UV-lyskilde.Udfør automatisk detektion af polernes spidser, der indeholder fluorescerende farvestof til maksimering af kontrasten. Mål afstanden mellem polerne fra daglige poster ved hjælp af en automatiseret analyse ved at køre de optagede billeder på software for at registrere lyse pixels med høj kontrast på en mørk baggrund eller et billedbehandlingsprogram. Fjern ECT fra fastholdelsesstængerne, og indsæt en overførselskrog og ECT-løkke.Overfør derefter ECT på to kroge fastspændt til den stationære arm og transducerarmen på et forlængende dynamisk mekanisk riometer udstyret med et 37 grader Celsius hærdet orgelbad fyldt med PBS. Påfør enhjulsspænding ved en konstant lineær hastighed ved at indstille riometeret til ca. 1% af den oprindelige afstand mellem krogene pr. Sekund. En konstant strækningshastighed på 0,03 millimeter i sekundet kan bruges med typiske ECT-dimensioner.Riv transducerens kraft og start strækningen. Hold registrering indtil det punkt af ECT brud efter normalisering af den målte kraft ved tværsnit område og plot stress-stamme kurve bestemme forskellige biomekaniske parametre. Lige før vævet begynder mikrofrakturering, svarer den øvre grænse for det elastiske område til udbyttepunktet, og dets stamme er et mål for vævselasticitet.Plastregionen ligger mellem udbyttepunktet og fejlpunktet. Fejlpunktet svarer til et pludseligt fald i stress på grund af brud på vævet, der definerer den ultimative stamme, som er et mål for vævsudtarmbarhed. Det tredje målepunkt svarer til den maksimale styrke, der er defineret af den højeste belastning, som vævet kan bære uden at bryde under strækningen.Den modstandsdygtighed og sejhed, som området under kurven giver, svarer til den energi, der absorberes af vævet op til henholdsvis udbyttepunktet og fejlpunktet. For hver opnået kurve svarer hældningen af den lineære del af den elastiske region til Youngs modulus, også kendt som elastisk modulus. Det er en mekanisk egenskab, der måler vævets stivhed.Ved hjælp af denne protokol, ECT komprimering og sammentrækning under kontrol betingelser og i overværelse af FCS fulgte et par timer efter støbning og især steget op til dag fem. Da ECT blev behandlet med actin polymeriseringshæmmeren Latrunculin A, blev ECT-komprimeringen reduceret som angivet med det betydeligt højere tværsnitsområde sammenlignet med kontrol. Sammentrækningen af vævene blev vurderet i løbet af de fem dage af kulturen.I mangel af Latrunculin A steg sammentrækningen gradvist op til dag fem og nåede omkring 40% sammentrækning. Latrunculin A-tilstedeværelsen påvirkede imidlertid vævssammentrækningen, hvilket kun resulterede i ca. 20% maksimal sammentrækning. Actin polymerisering hæmning førte til en betydelig reduktion på omkring 50% i væv stivhed over kontrollen.Disse resultater viser, at actin cytoskeletal integritet er afgørende for ECT komprimering, sammentrækning, og afstivning. Det er vigtigt at vælge en pålidelig kollagenopløsning af høj kvalitet og sikre, at en enkeltcellet suspension med høj levedygtighed bruges til at rekonstruere konstrueret bindevæv.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokol for Relativ Hydrodynamic Vurdering af Tri-brochure Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching Platform for Applications i cellebiologi og Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, Isolering og<em&gt; In vitro</em&gt; Udvidelse af menneskelige Forreste korsbånd-afledte celler til vævsdyrkningsapplikationer

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser af<em&gt; In vivo</em&gt; Funktionel Test af Rat tibialis anterior for Evaluering manipuleret væv Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Custom manipuleret vævskultur forme fra Laser-ætset Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer til Open Source-Mikroplade kompatible belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Væv-Manipuleret Graft for circumferential esophageal rekonstruktion hos rotter

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...