Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de German Cardiac Society (DGK Research Fellowship for GLS) en door de German Research Foundation (DFG via het project IRTG 1816 voor GLS en AD; DFG 417880571 en DFG TI 956/1-1 voor MT; SFB 1002 TP C04 voor MT en WHZ; SFB 1002 TP S01 voor WHZ; en EXC 2067/1-390729940J voor WHZ). WHZ wordt ondersteund door het Duitse federale ministerie van Wetenschap en Onderwijs (BMBF via het project IndiHEART) en de Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ en SL worden ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK).

Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskappen van klasse II die zijn geïnstalleerd in laboratoria onder inperkingsniveau 1. Afhankelijk van de lokale regelgeving en het type manipulaties dat moet worden uitgevoerd, zoals virale gemedieerde genoverdracht, moet het inperkingsniveau worden verhoogd tot het bioveiligheidsniveau 2 of 3. Alle culturen worden op 37 °C gehouden in een celkweekincubator met een bevochtigde atmosfeer van 5 % CO2 in de lucht. Merk op dat de volumes (stap 1 en 2) zij...

Het gepresenteerde protocol beschrijft de generatie van ECT uit primaire menselijke CF, die het mogelijk maakt om de mechanische impact van deze cellen op hun extracellulaire matrixomgeving te bestuderen en vice versa.
De fibroblasten moeten worden uitgebreid om voldoende cellen op te leveren voor de geplande ECT-experimenten (0,75 x 106 cellen/ECT). Voor de beste reproduceerbaarheid wordt geadviseerd om bevroren of weefsel-afgeleide fibroblasten voor te kweken in 2D monolaagcultuur...

Een groot obstakel in de studie van fibrotische ziekten is het ontbreken van representatieve menselijke 3D-weefselmodellen die inzicht geven in het gedrag van fibroblasten en hun pathologische derivaten. Om fibrotische processen te bestuderen, zijn standaard 2D-kweeksystemen suboptimaal, omdat geïsoleerde fibroblasten snel transdifferentiëren in α-gladde spier actine (SMA) -tot expressie brengende myofibroblasten wanneer gekweekt op niet-conforme 2D-substraten1,2,3. Fibroblasten in de standaard 2D-cultuur weerspiegelen dus geen regulier "gezond" weefselfenotype3,4,5,6. Culturen op buigzame substraten zijn geïntroduceerd om niet-fibrotische (10 kPa) en fibrotische (35 kPa) weefselomgevingen7 te simuleren, maar deze missen de derde dimensie, die erg belangrijk is met betrekking tot pathofysiologie. Tissue engineering biedt de mogelijkheid om deze beperking te overwinnen door fibroblastcultuur toe te staan in een gedefinieerde en experimenteel instelbare extracellulaire matrix (ECM)-context, bijvoorbeeld door veranderingen in de cellulariteit, ECM-samenstelling en ECM-concentratie, die allemaal de weefselbiomechanica kunnen bepalen.
Verschillende 3D-modellen zijn gegenereerd met behulp van fibroblasten. Zwevende schijven en microsferen behoorden tot de eerste en tonen aan dat collageen op een tijdsafhankelijke manier wordt geremodelleerd en verdicht. Fibroblasten oefenen tractiekrachten uit op collageenfibrillen, een proces dat kan worden vergemakkelijkt door de toevoeging van pro-fibrotische middelen zoals transformerende groeifactor-bèta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Vrij zwevende culturen laten echter geen gecontroleerde externe belasting toe en vormen daarom continu krimpende of verdichtende modellen. Sheet-like engineered tissues openden de mogelijkheid om homeostatische regulatie van biomechanische eigenschappen van weefsels te bestuderen, namelijk door middel van uni-, bi-, multiaxiale of cyclische stamtests17,18,19,20. Deze modellen zijn bijvoorbeeld gebruikt om de invloed van het celgetal op de weefselstijfheid aan te tonen, die positief bleek te correleren met cytoskeletintegriteit en actomyosine cytoskeletcontractiliteit18,19. Het is echter belangrijk op te merken dat kracht-naar-spanning conversies worden gecompliceerd door de niet-uniforme weefselvervorming rond klempunten van krachtopnemers en ankerpunten. Deze inherente beperking kan worden omzeild door hondenbot of ringvormige weefsels, waardoor enige weefselhandhaving op ankerpunten wordt geboden21,22,23. Ringvormige weefsels kunnen worden bereid door een celcollageenhydrogel in ringvormige mallen te verdelen. Naarmate de hydrogel compact wordt, vormt zich een weefsel rond de niet-samendrukbare binnenstaaf van de mal, die weerstand biedt voor verdere weefselcontractie24,25,26,27. Na initiële en typisch maximale verdichting kunnen weefsels ook worden overgebracht naar verstelbare afstandhouders om cirkelvormige ECT verder te beperken op een gedefinieerde weefsellengte3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysische eigenschappen kunnen worden beoordeeld in standaard horizontale of verticale spannings-apparaten met geschikte loadcellen onder unidirectionele of dynamische spanning3. Omdat de weefsels een grotendeels uniforme cirkelvormige structuur hebben en op staven/haken (verankeringspunten en/of krachtopnemers) kunnen worden gehouden, hoewel deze nog steeds compressiegebieden rond de laadstangen kunnen omsluiten, maakt dit formaat een meer uniforme spanningsvariatie mogelijk in vergelijking met klemmen3. Bovendien wekken verankerde weefsels een bipolaire celvorm op en passen cellen zich aan de weefselkrachten aan door verlenging langs krachtlijnen die anisotrope tractie bevorderen31,32,33,34,35,36. We hebben eerder ringvormige ECT toegepast van rat en humaan cardiale fibroblasten (CF) rond een enkele stijve pool in functionele stress-stamexperimenten en winst- en functieverliesstudies uitgevoerd met behulp van viraal getransduceerde fibroblasten24,25,26 en farmacologische studies37. Verder konden we sekseverschillen in CF-gemedieerde fibrose identificeren in het ECT-model27.
Het volgende protocol voor het genereren van menselijke ECT, geïllustreerd met primaire menselijke CF verkregen als gecryopreserveerde CF van commerciële leveranciers (zie Tabel met materialen), combineert de voordelen van ringvormige weefsels met een eenvoudige en snelle manier om macroscopische weefsels te produceren voor een 48-well platform dat is ontworpen voor parallelle testen met een hoog gehalte.
Belangrijk is dat het ECT-model niet beperkt is tot een specifiek fibroblasttype, met het gedocumenteerde gebruik in het onderzoek van andere fibroblasten, bijvoorbeeld huidfibroblasten38,39. Bovendien werken fibroblasten uit biopten van de patiënt even goed en hangt de keuze van fibroblasten uiteindelijk af van de wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt.
Het platform dat wordt gebruikt voor het genereren van ECT zoals beschreven in dit protocol is een in de handel verkrijgbare 48-well 3D-cel/weefselkweekplaat (figuur 1A). De methoden voor het bereiden, kweken en bewaken van ECT-vorming en -functie onder een gedefinieerde geometrie en mechanische belasting met behulp van de 48-putplaat worden beschreven. De gevormde ECT worden vastgehouden door geïntegreerde flexibele palen en de mechanische belasting kan worden afgestemd op het uiteindelijke doel door palen met verschillende hardheid te gebruiken (Shore A-waarde 36-89), waardoor hun buigstijfheid wordt beïnvloed. Palen met een oever A-waarde van 46 worden aanbevolen. Het protocol is bovendien compatibel met een eerder beschreven aangepaste cirkelvormige mal, waarbij de ECT rond een enkele stijve staaf wordt gehouden37. De afmetingen van deze mal zijn weergegeven in figuur 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van gietmallen. (A) Technische tekening en afmetingen van een gietvorm met twee flexibele palen. De mal bestaat uit een binnenomtrek begrensd door een korte muur die dubbele keerpalen aan het hoofdlichaam van de mal vasthoudt. De flexibele palen hebben een vrije horizontale afstand tot elkaar en zijn aan de basis met elkaar verbonden. De mal zorgt voor een gietvolume van 180 μL. De put van elke mal maakt een volumecapaciteit van ten minste 600 μL kweekmedia mogelijk. Verschillende materiaalsamenstellingen kunnen worden gebruikt om palen met specifieke stijfheid te produceren (bijv. TM5MED-TM9MED). (B) Technische tekening en afmetingen van een ringvormige mal met een enkele stijve staaf. Dit is een alternatieve mal met een duidelijke geometrie en mechanische omgeving, die kan worden gebruikt met het ECT-gietprotocol37. De ringvormige matrijsassemblagemethode is aangepast van gepubliceerde grotere formaten28,41. Kortom, de methode omvat (1) het inprenten van polytetrafluorethyleen (PTFE) vormafstandhouders (8 mm diameter) in polydimethylsiloxaan (PDMS, siliconen) gegoten in glazen schalen (diameter 60 mm), en (2) het concentrisch bevestigen van een PDMS-paalhouder (1,5 mm diameter) concentrisch in de gevormde holle holte, die dient om (3) een verwijderbare paal (siliconenbuis met een diameter van 4 mm) vast te houden. De holle ruimte die hieruit voortvloeit, zorgt voor 180 μL gietvolume. Elke glazen schaal kan meerdere bedrukte mallen bevatten (voorbeeldig weergegeven met 5 mallen) en heeft de capaciteit voor maximaal 5 ml kweekmedium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Fibroblasten zijn fenotypisch zeer dynamische cellen, die snel transdifferentiëren in myofibroblasten als reactie op biochemische en biomechanische stimuli. Het huidige begrip van fibrotische processen, waaronder hartfibrose, blijft slecht, wat de ontwikkeling van nieuwe anti-fibrotische therapieën belemmert. Controleerbare en betrouwbare menselijke modelsystemen zijn cruciaal voor een beter begrip van fibrosepathologie. Dit is een zeer reproduceerbaar en schaalbaar protocol om gemanipuleerde bindweefsels (ECT) te genereren in een 48-well gietplaat om studies van fibroblasten en de pathofysiologie van fibrotisch weefsel in een 3-dimensionale (3D) omgeving te vergemakkelijken. ECT worden gegenereerd rond de polen met instelbare stijfheid, waardoor studies onder een gedefinieerde biomechanische belasting mogelijk zijn. Onder de gedefinieerde belastingsomstandigheden kunnen fenotypische aanpassingen gecontroleerd door cel-matrixinteracties worden bestudeerd. Parallel testen is mogelijk in het 48-well formaat met de mogelijkheid voor de tijdsverloopanalyse van meerdere parameters, zoals weefselverdichting en contractie tegen de belasting. Op basis van deze parameters kunnen biomechanische eigenschappen zoals weefselstijfheid en elasticiteit worden bestudeerd.

ECT bereikt ongeveer 95% verdichting in vergelijking met het initiële celcollageen hydrogelvolume binnen de eerste 24 uur. Weefselverdichting en contractie onder controleomstandigheden en in aanwezigheid van FCS volgt enkele uren na het gieten en neemt met name toe tot dag 5 (figuur 5A). De poolafbuiging kan verder toenemen gedurende de volgende 15 dagen (20 dagen was de langste testtijd). De grootte van de poolafbuiging hangt af van het celtype, de celtoestand en de cel- en weefselkweekoms...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Met dit protocol kunnen de fibroblasten hun eigen omgeving bouwen en organiseren onder gedefinieerde mechanische omstandigheden. Dit resulteert in anisotrope weefsels met stijfheid en matrixsamenstellingen die vergelijkbaar zijn met de natuurlijke omgeving van de cel. Deze methode maakt het mogelijk om tot 48 omstandigheden parallel te vergelijken.Het is flexibel met betrekking tot het gebruikte celtype en de kweekomstandigheden. Door slechts enkele goed gedefinieerde componenten te gebruiken, is het reproduceerbaar tussen laboratoria. Door pro-fibrotische factoren of antifibrotica toe te passen, kan dit protocol worden gebruikt om de onderliggende processen en therapieën van fibrotische ziekten van welke aard dan ook te bestuderen.De procedure wordt gedemonstreerd door Alisa Degrave, een promovendus uit ons laboratorium, en ikzelf. Ontdooi om te beginnen de cryo-geconserveerde cardiale fibroblasten in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer twee minuten totdat de injectieflacon slechts een kleine hoeveelheid ijs overhoudt. Breng vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs over met behulp van een serologische pipet van twee milliliter in een geschikte steriele centrifugebuis met 10 milliliter fibroblastgroeimedium.Voor een optimale celophaling spoelt u de cryoflacon met één milliliter VGV en brengt u deze over naar de centrifugebuis. Reuspend de cellen voorzichtig opnieuw op en breng over in een celkweekkolf. Vul VGV om de dag aan gedurende vijf dagen of totdat de cellen 80% confluentie hebben bereikt.Na het opzuigen van het medium uit de gekweekte cellen, wast u cellen met zes milliliter PBS en aspiraat, voegt u vervolgens zes milliliter van het celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeert u totdat de celloslating zichtbaar is. Neutraliseer enzymatische activiteit door zes tot 12 milliliter VGV toe te voegen aan de losgeraakte cellen in het celassociatiereagens. Pipetteer vier tot acht keer voorzichtig op en neer met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter om een eencellige suspensie te garanderen en breng de cellen over in een verse opvangbuis van 50 milliliter.Controleer de opbrengst met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de instructies van de fabrikant en pellet de cellen. Na het centrifugeren, zuig het supernatant op, veeg de buis om de pellet los te maken en resuspend de cellen in VGV. Druk vervolgens de celsuspensie door een 40 micrometer mesh-celzeef, gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller, beoordeel het celnummer en de levensvatbaarheid door uitsluiting van elektrische stroom om betrouwbare celnummers te garanderen voordat u doorgaat met gemanipuleerde bindweefsels of ECT-voorbereiding.Om je voor te bereiden op ECT, pas je de celsuspensie aan op de 8,9 miljoen cellen per milliliter bij 20 tot 25 graden Celsius door VGV toe te voegen en de cellen op ijs te houden. Breng alle andere buizen die de afzonderlijke componenten van het ECT-hydrogelmengsel bevatten over op ijs en koel een lege centrifugebuis van 50 milliliter voor om het mengsel te bereiden. Begin met het bereiden van het ECT-hydrogelmengsel door componenten die in de tekst worden beschreven toe te voegen aan de voorgekoelde centrifugebuis van 50 milliliter, waardoor de vorming van luchtbellen wordt voorkomen.Pipetteer eerst de zuur oplosbare collageen type I hydrogel in een serologische pipet met een brede boorpunt. Pas het zoutgehalte van de collageenoplossing aan door de DMEM toe te voegen terwijl u de buis voorzichtig ronddraait voor een goede menging. Om de pH te neutraliseren, voegt u 0,2 molair natriumhydroxide toe terwijl u de buis draait en bevestigt u de neutralisatie door de rode kleur van de fenolrode indicator te observeren.Voeg vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs toe terwijl u de buis voorzichtig ronddraait. Meng de suspensie door slechts één keer voorzichtig op en neer te spuiten met behulp van een serologische pipet met een brede boorpunt om bubbelvorming te voorkomen en de schuifspanning te minimaliseren. Draai de buis 10 keer voorzichtig rond voor een grondige menging.Houd de centrifugebuis met ECT-hydrogelmengsel gedurende het gietproces op ijs. Maak een pipetpunt van één milliliter nat in het ECT-hydrogelmengsel en verdeel vervolgens 180 microliter hydrogelmengsel gelijkmatig in elke mal van de 48-well gietplaat om overmatige schuifkrachten te vermijden die de integriteit van de collageenmatrixassemblage kunnen beïnvloeden en ervoor te zorgen dat de hele plaat binnen 15 tot 20 minuten klaar is. Zorg ervoor dat zich een volledige lus vormt in de mal, omdat discontinue verdeling van ECT-mengsel een volledige ECT-ringvorming voorkomt.Vermijd pipetteren in de binnenput en het vormen van bellen tijdens het pipetteren om een uniforme ECT-hydrogelgieting te garanderen voor homogene en functionele weefselvorming. Plaats de 48-well gietplaat voorzichtig in de celkweekincubator om het ECT-hydrogelmengsel gedurende 15 tot 30 minuten te reconstitueren. Na incubatie lijkt het gelachtig en ondoorzichtig.Voeg 600 microliter van 37 graden Celsius warme VGV per put voorzichtig langs de muur toe om ECT-loslating van de bodem te voorkomen. Vervang het medium elke dag door 500 microliter VGV tot de analyse. Gebruik op de gewenste tijdstippen een stereomicroscoop om microscopische beelden van de boven- en zijaanzichten van de ECT op te nemen.Gebruik een beeldverwerkingsprogramma om een lijnscananalyse uit te voeren. Stel een schaal in en gebruik het rechtlijnige gereedschap om de ECT-diameters te traceren en te meten op minimaal zes posities per arm in elk beeldvlak. Beeld de 48-well gietplaat onder een opnameapparaat met een geïntegreerde gebiedsscancamera die op een vaste afstand is geplaatst en is uitgerust met een monochrome beeldsensor met hoge resolutie en een bijna-UV-lichtbron.Voer geautomatiseerde detectie uit van de uiteinden van de polen die fluorescerende kleurstof bevatten voor het maximaliseren van het contrast. Meet de afstand tussen de polen van dagelijkse records met behulp van een geautomatiseerde analyse door de opgenomen beelden op software uit te voeren om contrastrijke heldere pixels op een donkere achtergrond of een beeldverwerkingsprogramma te detecteren. Verwijder de ECT van de bevestigingspalen en plaats een overdrachtskliak en ECT-lus.Breng vervolgens de ECT over op twee haken die op de stationaire arm zijn geklemd en de transducerarm van een extensieve dynamische mechanische riometer uitgerust met een 37 graden Celsius getemperd orgaanbad gevuld met PBS. Breng de uniaxiale spanning met een constante lineaire snelheid aan door de riometer in te stellen op ongeveer 1% van de initiële afstand tussen de haken per seconde. Een constante reksnelheid van 0,03 millimeter per seconde kan worden gebruikt met typische ECT-afmetingen.Scheur de kracht van de transducer en initieer de stretch. Blijf registreren tot het punt van ECT-breuk na het normaliseren van de gemeten kracht per dwarsdoorsnede en plot de spannings-rekcurve die verschillende biomechanische parameters bepaalt. Vlak voordat het weefsel begint met microfractureren, komt de bovengrens van het elastische gebied overeen met het vloeipunt en is de spanning een maat voor de elasticiteit van het weefsel.Het plastic gebied bevindt zich tussen het vloeipunt en het faalpunt. Het faalpunt komt overeen met een plotselinge daling van de spanning als gevolg van breuk van het weefsel, wat de ultieme stam definieert die een maat is voor de uitbreidbaarheid van het weefsel. Het derde meetpunt komt overeen met de maximale sterkte die wordt gedefinieerd door de hoogste spanning die het weefsel kan dragen zonder te breken tijdens het uitrekken.De veerkracht en taaiheid van het gebied onder de curve komt overeen met de energie die door het weefsel wordt geabsorbeerd tot respectievelijk het vloeipunt en het faalpunt. Voor elke verkregen kromme komt de helling van het lineaire deel van het elastische gebied overeen met de modulus van Young, ook wel elastische modulus genoemd. Het is een mechanische eigenschap die de stijfheid van het weefsel meet.Met behulp van dit protocol volgde ECT-verdichting en contractie onder controleomstandigheden en in aanwezigheid van FCS een paar uur na het gieten en nam met name toe tot dag vijf. Wanneer ECT werd behandeld met de actinepolymerisatieremmer Latrunculine A, werd de ECT-verdichting verminderd zoals aangegeven door het significant hogere doorsnedegebied in vergelijking met controle. De samentrekking van de weefsels werd beoordeeld tijdens de vijf dagen van de kweek.Bij afwezigheid van Latrunculine A nam de contractie geleidelijk toe tot dag vijf tot ongeveer 40% krimp. De aanwezigheid van Latrunculine A beïnvloedde echter de weefselcontractie, wat resulteerde in slechts ongeveer 20% maximale contractie. Actinepolymerisatieremming leidde tot een significante vermindering van ongeveer 50% in de weefselstijfheid ten opzichte van de controle.Deze resultaten tonen aan dat de actine cytoskeletale integriteit essentieel is voor ECT-verdichting, contractie en verstijving. Het is belangrijk om een betrouwbare, hoogwaardige collageenoplossing te selecteren en ervoor te zorgen dat een eencellige suspensie met hoge levensvatbaarheid wordt gebruikt om gemanipuleerde bindweefsels te reconstitueren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocol voor Relatieve Hydrodynamische Beoordeling van Tri-folder Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Chirurgische Retrieval, Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Uitbreiding van de Mens Voorste kruisband-afgeleide cellen voor Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Toepassingen voor open source Microplate-compatibele verlichtings panelen

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...