Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie (DGK-Forschungsstipendium für GLS) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG durch das Projekt IGK 1816 für GLS und AD; DFG 417880571 und DFG TI 956/1-1 für MT; SFB 1002 TP C04 für MT und WHZ; SFB 1002 TP S01 für WHZ; und EXC 2067/1-390729940J für WHZ). WHZ wird gefördert durch das Bundesministerium für Wissenschaft und Bildung (BMBF durch das Projekt IndiHEART) und die Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ und SL werden vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK) gefördert.

Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitshaube der Klasse II durchgeführt werden, die in Laboratorien der Sicherheitsstufe 1 installiert ist. Abhängig von den lokalen Vorschriften und der Art der durchzuführenden Manipulationen, wie z. B. der viral vermittelte Gentransfer, muss der Containment-Level auf die Biosicherheitsstufe 2 oder 3 erhöht werden. Alle Kulturen werden bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 in der Luft gehalten. Beachten Sie, dass die V...

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Erzeugung von ECT aus primärer menschlicher CF, die es ermöglicht, die mechanischen Auswirkungen dieser Zellen auf ihre extrazelluläre Matrixumgebung und umgekehrt zu untersuchen.
Die Fibroblasten müssen erweitert werden, um genügend Zellen für die geplanten ECT-Experimente (0,75 x 106 Zellen/ECT) zu erhalten. Für die beste Reproduzierbarkeit wird empfohlen, gefrorene oder aus Gewebe gewonnene Fibroblasten in 2D-Monolayer-Kultur für ...

Ein großes Hindernis bei der Untersuchung fibrotischer Erkrankungen ist das Fehlen repräsentativer menschlicher 3D-Gewebemodelle, die Einen einblick in das Verhalten von Fibroblasten und ihren pathologischen Derivaten geben. Um fibrotische Prozesse zu untersuchen, sind Standard-2D-Kultursysteme suboptimal, da isolierte Fibroblasten schnell in α-Glattmuskel-Aktin (SMA)-exprimierende Myofibroblasten transdifferenzieren, wenn sie auf nicht konformen 2D-Substraten kultiviert werden1,2,3. Somit spiegeln Fibroblasten in der Standard-2D-Kultur keinen regulären "gesunden" Gewebephänotyp wider3,4,5,6. Kulturen auf biegsamen Substraten wurden eingeführt, um nicht-fibrotische (10 kPa) und fibrotische (35 kPa) Gewebeumgebungen zu simulieren7, aber diesen fehlt die dritte Dimension, die in Bezug auf die Pathophysiologie sehr wichtig ist. Tissue Engineering bietet die Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden, indem es die Fibroblastenkultur in einem definierten und experimentell abstimmbaren extrazellulären Matrix (ECM)-Kontext ermöglicht, beispielsweise durch Veränderungen der Zellularität, der ECM-Zusammensetzung und der ECM-Konzentration, die alle die Gewebebiomechanik bestimmen können.
Verschiedene 3D-Modelle wurden mit Fibroblasten erzeugt. Schwimmende Scheiben und Mikrosphären gehörten zu den ersten und zeigen, dass Kollagen zeitabhängig umgebaut und verdichtet wird. Fibroblasten üben Zugkräfte auf Kollagenfibrillen aus, ein Prozess, der durch die Zugabe von profibrotischen Wirkstoffen wie transformierendem Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-β1) erleichtert werden kann.8,9,10,11,12,13,14,15,16. Frei schwebende Kulturen erlauben jedoch nicht die kontrollierte äußere Belastung und stellen daher kontinuierlich schrumpfende oder verdichtende Modelle dar. Sheet-like engineered tissues eröffneten die Möglichkeit, die homöostatische Regulation der biomechanischen Eigenschaften von Geweben zu untersuchen, nämlich durch uni-, bi-, multiaxiale oder zyklische Dehnungstests17,18,19,20. Diese Modelle wurden z.B. verwendet, um den Einfluss der Zellzahl auf die Gewebesteifigkeit zu demonstrieren, die positiv mit der Integrität des Zytoskeletts und der Kontraktilität des Actomyosin-Zytoskeletts korreliert.18,19. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Kraft-zu-Dehnungs-Umwandlungen durch die ungleichmäßige Gewebeverformung um Klemmpunkte von Kraftaufnehmern und Ankerpunkten erschwert werden. Diese inhärente Einschränkung kann durch Hundeknochen- oder ringförmige Gewebe umgangen werden, was eine gewisse Gewebeverstärkung an Ankerpunkten bietet21,22,23. Ringförmige Gewebe können hergestellt werden, indem ein Zell-Kollagen-Hydrogel in ringförmige Formen verteilt wird. Wenn sich das Hydrogel verdichtet, bildet sich um den unkompressiblen inneren Stab der Form ein Gewebe, das Widerstand für eine weitere Gewebekontraktion bietet24,25,26,27. Nach anfänglicher und typischerweise maximaler Verdichtung können Gewebe auch auf verstellbare Abstandshalter übertragen werden, um die kreisförmige EKT bei einer definierten Gewebelänge weiter zurückzuhalten.3,24,25,26,27,28,29,30. Biophysikalische Eigenschaften können in horizontalen oder vertikalen Standard-Dehnungs-Vorrichtungen mit geeigneten Wägezellen unter unidirektionaler oder dynamischer Dehnung bewertet werden3. Da die Gewebe eine weitgehend gleichmäßige kreisförmige Struktur aufweisen und an Stangen/Haken (Verankerungspunkte und/oder Kraftaufnehmer) gehalten werden können, obwohl diese immer noch Kompressionsbereiche um die Ladestäbe herum einschließen können, ermöglicht dieses Format eine gleichmäßigere Dehnungsvariation im Vergleich zur Klemmung.3. Darüber hinaus lösen verankerte Gewebe eine bipolare Zellform aus, und Zellen passen sich den Gewebekräften an, indem sie entlang von Kraftlinien verlängert werden, um die anisotrope Traktion zu fördern.31,32,33,34,35,36. Wir haben zuvor ringförmige EKT von ratten- und humanen Herzfibroblasten (CF) um einen einzigen steifen Pol in funktionellen Stressstammexperimenten angewendet und Studien zum Gewinn und Verlust von Funktionen unter Verwendung viral transduzierter Fibroblasten durchgeführt24,25,26 und pharmakologische Studien37. Darüber hinaus konnten wir Geschlechtsunterschiede bei CF-vermittelter Fibrose im ECT-Modell identifizieren27.
Das folgende Protokoll für die Erzeugung menschlicher EKT, veranschaulicht durch primäre menschliche CF, die als kryokonservierte CF von kommerziellen Anbietern gewonnen wurde (siehe Materialtabelle), kombiniert die Vorteile ringförmiger Gewebe mit einer einfachen und schnellen Möglichkeit, makroskopisches Gewebe für eine 48-Well-Plattform herzustellen, die für parallele High-Content-Tests entwickelt wurde.
Wichtig ist, dass das ECT-Modell nicht auf einen bestimmten Fibroblastentyp beschränkt ist, mit der dokumentierten Verwendung bei der Untersuchung anderer Fibroblasten, z. B. Hautfibroblasten38,39. Darüber hinaus funktionieren Fibroblasten aus Patientenbiopsien gleich gut, und die Wahl der Fibroblasten hängt letztendlich von der zu behandelnden wissenschaftlichen Fragestellung ab.
Die Plattform, die für die in diesem Protokoll beschriebene ECT-Generierung verwendet wird, ist eine kommerziell erhältliche 48-Well-3D-Zell-/Gewebekulturplatte (Abbildung 1A). Die Methoden zur Vorbereitung, Kultivierung und Überwachung der ECT-Bildung und -Funktion unter definierter Geometrie und mechanischer Belastung mit Hilfe der 48-Well-Platte werden beschrieben. Die geformten ECT werden von integrierten flexiblen Polen gehalten und die mechanische Belastung kann entsprechend dem endgültigen Zweck fein abgestimmt werden, indem Stangen mit unterschiedlicher Härte (Shore A-Wert 36-89) verwendet werden, die ihre Biegesteifigkeiten beeinflussen. Pfähle mit Ufer Ein Wert von 46 wird empfohlen. Das Protokoll ist außerdem kompatibel mit einer zuvor beschriebenen benutzerdefinierten kreisförmigen Form, bei der die EKT um eine einzige steife Stange gehalten wird37. Die Abmessungen dieser Form sind in Abbildung 1B dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung von Gussformen. (A) Technische Zeichnung und Abmessungen einer Gießform mit zwei flexiblen Stangen. Die Form besteht aus einem inneren Umfang, der durch eine kurze Wand begrenzt wird, die doppelte Haltestangen am Hauptkörper der Form hält. Die flexiblen Pole haben einen freien horizontalen Abstand zueinander und sind an der Basis miteinander verbunden. Die Form ermöglicht 180 μL Gießvolumen. Die Vertiefung jeder Form ermöglicht eine Volumenkapazität von mindestens 600 μL Nährmedien. Verschiedene Materialzusammensetzungen können verwendet werden, um Pole mit spezifischen Steifigkeiten herzustellen (z. B. TM5MED-TM9MED). (B) Technische Zeichnung und Abmessungen einer ringförmigen Form mit einer einzigen steifen Stange. Dies ist eine alternative Form mit unterschiedlicher Geometrie und mechanischer Umgebung, die mit dem ECT-Gießprotokoll37 verwendet werden kann. Das ringförmige Formmontageverfahren wurde aus veröffentlichten größeren Formaten angepasst28,41. Kurz gesagt, das Verfahren umfasst (1) das Bedrucken von Polytetrafluorethylen (PTFE) -Formabstandhaltern (8 mm Durchmesser) in Polydimethylsiloxan (PDMS, Silikon), das in Glasschalen (Durchmesser 60 mm) gegossen wird, und (2) die konzentrische Befestigung eines PDMS-Polhalters (1,5 mm Durchmesser) innerhalb des geformten Hohlraums, der dazu dient, (3) eine abnehmbare Stange (Silikonschlauch mit 4 mm Durchmesser) zu halten. Der resultierende Hohlraum ermöglicht 180 μL Gießvolumen. Jede Glasschale kann mehrere bedruckte Formen aufnehmen (exemplarisch dargestellt mit 5 Formen) und hat die Kapazität für bis zu 5 ml Kulturmedium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Fibroblasten sind phänotypisch hochdynamische Zellen, die als Reaktion auf biochemische und biomechanische Reize schnell in Myofibroblasten transdifferenzieren. Das derzeitige Verständnis der fibrotischen Prozesse, einschließlich der Herzfibrose, ist nach wie vor schlecht, was die Entwicklung neuer antifibrotischer Therapien behindert. Kontrollierbare und zuverlässige menschliche Modellsysteme sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Fibrosepathologie. Dies ist ein hochgradig reproduzierbares und skalierbares Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe (ECT) in einer 48-Well-Gießplatte, um Studien von Fibroblasten und die Pathophysiologie von fibrotischem Gewebe in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu erleichtern. ECT werden um die Pole mit abstimmbarer Steifigkeit erzeugt, was Studien unter einer definierten biomechanischen Belastung ermöglicht. Unter den definierten Belastungsbedingungen können phänotypische Anpassungen, die durch Zell-Matrix-Wechselwirkungen gesteuert werden, untersucht werden. Parallele Tests sind im 48-Well-Format mit der Möglichkeit der Zeitverlaufsanalyse mehrerer Parameter wie Gewebeverdichtung und -kontraktion gegen die Belastung möglich. Aus diesen Parametern können biomechanische Eigenschaften wie Gewebesteifigkeit und Elastizität untersucht werden.

ECT erreichen innerhalb der ersten 24 h eine Verdichtung von rund 95 % im Vergleich zum anfänglichen Zell-Kollagen-Hydrogel-Volumen. Gewebeverdichtung und -kontraktion unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von FCS erfolgt einige Stunden nach dem Gießen und nimmt bis Tag 5 deutlich zu (Abbildung 5A). Die Polauslenkung kann in den folgenden 15 Tagen weiter zunehmen (20 Tage waren die längste getestete Zeit). Das Ausmaß der Polablenkung hängt vom Zelltyp, dem Zellzustand sowie den Zel...

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Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Dieses Protokoll ermöglicht es den Fibroblasten, ihre eigene Umgebung unter definierten mechanischen Bedingungen aufzubauen und zu organisieren. Dies führt zu anisotropen Geweben mit Steifigkeit und Matrixzusammensetzungen, die mit der natürlichen Umgebung der Zelle vergleichbar sind. Diese Methode ermöglicht es, bis zu 48 Bedingungen parallel zu vergleichen.Es ist flexibel in Bezug auf den verwendeten Zelltyp und die Kulturbedingungen. Durch die Verwendung von nur wenigen klar definierten Komponenten ist es zwischen den Laboren reproduzierbar. Durch die Anwendung profibrotischer Faktoren oder antifibrotischer Medikamente kann dieses Protokoll verwendet werden, um die zugrunde liegenden Prozesse und Therapien von fibrotischen Erkrankungen jeglicher Art zu untersuchen.Alisa Degrave, eine Doktorandin aus unserem Labor, und ich werden das Verfahren demonstrieren. Zunächst die kryokonservierten Herzfibroblasten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für etwa zwei Minuten auftauen, bis das Fläschchen nur noch wenig Eis enthält. Als nächstes wird die Zellsuspension tropfenweise mit einer serologischen Pipette mit zwei Millilitern in ein geeignetes steriles Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern Fibroblastenwachstumsmedium überführt.Für eine optimale Zellentnahme spülen Sie die Kryo-Durchstechflasche mit einem Milliliter FGM ab und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen. Die Zellen vorsichtig resuspendieren und in einen Zellkulturkolben überführen. Füllen Sie FGM jeden zweiten Tag für fünf Tage auf oder bis die Zellen 80% Konfluenz erreicht haben.Nachdem Sie das Medium aus den kultivierten Zellen abgesaugt haben, waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern PBS und Aspirat, geben Sie dann sechs Milliliter des Zelldissoziationsreagenzes zu den Zellen und inkubieren Sie, bis die Zellablösung sichtbar ist. Neutralisieren Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie sechs bis 12 Milliliter FGM zu den verdrängten Zellen im Zellassozienreagenz hinzufügen. Pipettieren Sie vorsichtig vier- bis achtmal mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten, und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 50-Milliliter-Sammelröhrchen.Überprüfen Sie die Ausbeute mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers und pelletieren Sie die Zellen ab. Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen, das Rohr streichen, um das Pellet zu entfernen, und die Zellen in FGM resuspendieren. Als nächstes belasten Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Mesh-Zellsieb, dann mit einem automatisierten Zellzähler, bewerten Sie die Zellzahl und -lebensfähigkeit durch Ausschluss des elektrischen Stroms, um zuverlässige Zellzahlen zu gewährleisten, bevor Sie mit dem künstlichen Bindegewebe oder der ECT-Vorbereitung fortfahren.Um sich auf die EKT vorzubereiten, stellen Sie die Zellsuspension auf die 8,9 Millionen Zellen pro Milliliter bei 20 bis 25 Grad Celsius durch Zugabe von FGM ein und halten Sie die Zellen auf Eis. Alle anderen Röhrchen, die die einzelnen Komponenten der ECT-Hydrogelmischung enthalten, auf Eis geben und ein leeres 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vorkühlen, um die Mischung herzustellen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der ECT-Hydrogelmischung, indem Sie die im Text beschriebenen Komponenten in das vorgekühlte 50-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Zunächst wird das säurelösliche Kollagen-Typ-I-Hydrogel in eine serologische Pipette mit breiter Bohrungsspitze pipettiert. Stellen Sie den Salzgehalt der Kollagenlösung ein, indem Sie das DMEM hinzufügen, während Sie das Röhrchen für das richtige Mischen vorsichtig schwenken. Um den pH-Wert zu neutralisieren, fügen Sie 0,2 molares Natriumhydroxid hinzu, während Sie das Röhrchen schwenken, und bestätigen Sie die Neutralisation, indem Sie die rote Farbe des phenolroten Indikators beobachten.Dann fügen Sie die Zellsuspension tropfenweise hinzu, während Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Mischen Sie die Suspension, indem Sie nur einmal mit einer serologischen Pipette mit einer breiten Bohrungsspitze vorsichtig auf und ab spritzen, um Blasenbildung zu vermeiden und die Scherspannung zu minimieren. Schwenken Sie das Röhrchen 10 Mal für ein gründliches Mischen vorsichtig.Bewahren Sie das Zentrifugenröhrchen, das die ECT-Hydrogelmischung enthält, während des gesamten Gießprozesses auf Eis auf. Befeuchten Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze in einer ECT-Hydrogelmischung und verteilen Sie dann 180 Mikroliter Hydrogelmischung gleichmäßig in jede Form der 48-Well-Gießplatte, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden, die die Integrität der Kollagenmatrixanordnung beeinträchtigen können, und sicherzustellen, dass die gesamte Platte in 15 bis 20 Minuten fertig ist. Stellen Sie sicher, dass sich eine vollständige Schleife innerhalb der Form bildet, da eine diskontinuierliche Verteilung der ECT-Mischung eine vollständige ECT-Ringbildung verhindert.Vermeiden Sie das Pipettieren in den inneren Brunnen und das Bilden von Blasen während des Pipettierens, um einen gleichmäßigen ECT-Hydrogelguss für eine homogene und funktionelle Gewebebildung zu gewährleisten. Legen Sie die 48-Well-Gießplatte vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator, um die ECT-Hydrogelmischung für 15 bis 30 Minuten zu rekonstituieren. Nach der Inkubation erscheint es gelartig und undurchsichtig.Fügen Sie 600 Mikroliter mit 37 Grad Celsius warmem FGM pro Vertiefung entlang der Wand vorsichtig hinzu, um eine ECT-Ablösung von unten zu vermeiden. Ersetzen Sie das Medium jeden Tag durch 500 Mikroliter FGM bis zur Analyse. Verwenden Sie zu den gewünschten Zeitpunkten ein Stereomikroskop, um mikroskopische Bilder der Ober- und Seitenansicht des ECT aufzunehmen.Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, um eine Zeilenscananalyse durchzuführen. Legen Sie eine Skala fest und verwenden Sie das Geradelinienwerkzeug, um die ECT-Durchmesser an mindestens sechs Positionen pro Arm in jeder Bildgebungsebene zu verfolgen und zu messen. Stellen Sie die 48-Well-Gießplatte unter einem Aufnahmegerät mit einer integrierten Flächenkamera in festem Abstand vor, die mit einem hochauflösenden monochromen Bildsensor und einer UV-nahen Lichtquelle ausgestattet ist.Führen Sie eine automatisierte Erkennung der Polspitzen durch, die Fluoreszenzfarbstoff enthalten, um den Kontrast zu maximieren. Messen Sie den Abstand zwischen den Polen von den täglichen Aufzeichnungen mithilfe einer automatisierten Analyse, indem Sie die aufgezeichneten Bilder auf einer Software ausführen, um kontrastreiche helle Pixel auf einem dunklen Hintergrund oder einem Bildverarbeitungsprogramm zu erkennen. Entfernen Sie den ECT von den Haltestangen, und setzen Sie einen Übertragungshaken und eine ECT-Schlaufe ein.Übertragen Sie dann die ECT auf zwei Haken, die an den stationären Arm und den Wandlerarm eines extensionalen dynamischen mechanischen Riometers geklemmt sind, das mit einem 37 Grad Celsius temperierten Organbad ausgestattet ist, das mit PBS gefüllt ist. Wenden Sie die einachsige Spannung mit einer konstanten linearen Rate an, indem Sie das Riometer auf etwa 1% des Anfangsabstands zwischen den Haken pro Sekunde einstellen. Eine konstante Dehnungsrate von 0,03 Millimetern pro Sekunde kann mit typischen ECT-Abmessungen verwendet werden.Reißen Sie die Kraft des Wandlers und leiten Sie die Dehnung ein. Halten Sie die Aufzeichnung bis zum Zeitpunkt des EKT-Bruchs nach Normalisierung der gemessenen Kraft nach Querschnittsfläche und zeichnen Sie die Spannungs-Dehnungs-Kurve unter Bestimmung verschiedener biomechanischer Parameter auf. Kurz bevor das Gewebe mit dem Mikrofrakturieren beginnt, entspricht die obere Grenze der elastischen Region der Streckgrenze und ihre Belastung ist ein Maß für die Gewebeelastizität.Der Kunststoffbereich liegt zwischen der Streckgrenze und der Versagensstelle. Der Versagenspunkt entspricht einem plötzlichen Abfall der Spannung aufgrund eines Bruchs des Gewebes und definiert die endgültige Belastung, die ein Maß für die Dehnbarkeit des Gewebes ist. Der dritte Messpunkt entspricht der maximalen Festigkeit, die durch die höchste Belastung definiert wird, die das Gewebe tragen kann, ohne während der Dehnung zu brechen.Die Belastbarkeit und Zähigkeit, die durch die Fläche unter der Kurve gegeben ist, entspricht der Energie, die das Gewebe bis zur Streckgrenze bzw. zum Versagenspunkt absorbiert. Für jede erhaltene Kurve entspricht die Steigung des linearen Teils des elastischen Bereichs dem Elastizitätsmodul von Young, auch Elastizitätsmodul genannt. Es ist eine mechanische Eigenschaft, die die Steifigkeit des Gewebes misst.Unter Verwendung dieses Protokolls erfolgte die ECT-Verdichtung und -Kontraktion unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von FCS einige Stunden nach dem Gießen und nahm bis zum fünften Tag deutlich zu. Wenn ECT mit dem Aktinpolymerisationsinhibitor Latrunculin A behandelt wurde, war die ECT-Verdichtung reduziert, wie durch die signifikant höhere Querschnittsfläche im Vergleich zur Kontrolle angezeigt. Die Kontraktion der Gewebe wurde während der fünf Tage der Kultur beurteilt.In Abwesenheit von Latrunculin A nahm die Kontraktion bis zum fünften Tag allmählich zu und erreichte eine Kontraktion von etwa 40%. Die Anwesenheit von Latrunculin A beeinflusste jedoch die Gewebekontraktion, was zu einer maximalen Kontraktion von nur etwa 20% führte. Die Hemmung der Aktinpolymerisation führte zu einer signifikanten Reduktion der Gewebesteifigkeit um etwa 50% über die Kontrolle.Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktin-Zytoskelettintegrität für die Verdichtung, Kontraktion und Versteifung der EKT unerlässlich ist. Es ist wichtig, eine zuverlässige, qualitativ hochwertige Kollagenlösung auszuwählen und sicherzustellen, dass eine Einzelzellsuspension mit hoher Lebensfähigkeit verwendet wird, um künstliches Bindegewebe zu rekonstituieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Forschung

Biotechnik

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

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Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

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Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

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Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

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Anwendungen für Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...