Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת הלב הגרמנית (מלגת המחקר DGK ל- GLS) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG באמצעות פרויקט IRTG 1816 עבור GLS ו- AD; DFG 417880571 ו DFG TI 956/1-1 עבור MT; SFB 1002 TP C04 עבור הר ו- WHZ; SFB 1002 TP S01 עבור WHZ; ו EXC 2067/1-390729940J עבור WHZ). WHZ נתמך על ידי המשרד הפדרלי הגרמני למדע וחינוך (BMBF באמצעות הפרויקט IndiHEART), ואת פונדציה Leducq (20CVD04). MT, WHZ ו- SL נתמכים על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK).

כל הצעדים חייבים להתבצע בברדסים בטיחות ביולוגית Class II המותקנים במעבדות תחת רמת בלימה 1. בהתאם לתקנות המקומיות וסוג המניפולציות שיש לבצע, כגון העברת גנים בתיווך ויראלי, יש להגדיל את רמת הבלימה לרמת הבטיחות הביולוגית 2 או 3. כל התרבויות נשמרות ב 37 °C (5 °F) באינקובטור תרבית התא עם אווירה לחה של 5 % ...

הפרוטוקול המוצג מתאר את הדור של ECT מ- CF האנושי העיקרי, המאפשר לחקור את ההשפעה המכנית של תאים אלה על סביבת המטריצה החוץ-תאית שלהם ולהיפך.
הפיברובלסטים צריכים להיות מורחבים כדי להניב תאים מספיקים לניסויי ECT המתוכננים (0.75 x 106 תאים / ECT). עבור הרבייה הטובה ביותר, מומלץ מראש תר?...

מכשול מרכזי בחקר מחלות פיברוטיות הוא היעדר מודלים ייצוגיים של רקמת תלת-ממד אנושית המספקים תובנה על התנהגותם של פיברובלסטים ונגזרותיהם הפתולוגיות. כדי לחקור תהליכים פיברוטיים, מערכות תרבות 2D סטנדרטיות הן תת-אופטימליות מאז פיברובלסטים מבודדים transdifferentiate במהירות לתוך אקטין שריר חלק α (SMA) - ביטוי myofibroblasts כאשר מתורבת על מצעים 2D שאינם תואמים1,2,3. לכן, פיברובלסטים בתרבות הדו-ממדית הסטנדרטית אינם משקפים פנוטיפ רגיל של רקמות "בריאות"3,4,5,6. תרבויות על מצעים גמישים הוצגו כדי לדמות סביבות רקמות לא סיביות (10 kPa) ופיברוטיות (35 kPa)7, אך אלה חסרות את הממד השלישי, וזה חשוב מאוד ביחס לפתופיזיולוגיה. הנדסת רקמות מספקת את ההזדמנות להתגבר על מגבלה זו על ידי מתן אפשרות לתרבות פיברובלסט בהקשר של מטריצה חוץ-תאית מוגדרת וניסוי טונה (ECM), למשל, על ידי שינויים בתאיות, הרכב ECM וריכוז ECM, שכולם יכולים לקבוע את הביומכניקה של הרקמה.
דגמי תלת-ממד שונים נוצרו באמצעות פיברובלסטים. דיסקים ומיקרוספרות צפים היו בין הראשונים והוכיחו כי קולגן שופץ ונדחס באופן תלוי זמן. פיברובלסטים מפעילים כוחות אחיזה על סיבי קולגן, תהליך אשר ניתן להקל על ידי תוספת של סוכנים פרו-פיברוטיים כגון שינוי גורם גדילה-בטא 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. עם זאת, תרבויות צפות בחופשיות אינן מאפשרות טעינה חיצונית מבוקרת, ולכן מהוות דגמים מתכווצים או דוחסים ללא הרף. רקמות מהונדסות דמויות גיליון פתחו את האפשרות לחקור רגולציה הומאוסטטית של תכונות ביומכניות של רקמות, כלומר באמצעות בדיקות זנים חד, דו-מיניות, רב-זמניות או מחזוריות17,18,19,20. מודלים אלה שימשו, למשל, כדי להדגים את ההשפעה של מספר התא על נוקשות הרקמה, אשר נמצאה בקורלציה חיובית עם שלמות cytoskeleton ו צמצום ציטוסקילטון18,19. עם זאת, חשוב לציין כי המרות כוח למתח מסובכות על ידי עיוות רקמות לא אחיד סביב נקודות מהדק של מתמרים כוח ונקודות עיגון. מגבלה אינהרנטית זו יכולה לעקוף על ידי עצם כלב או רקמות בצורת טבעת, המציעות אכיפת רקמות מסוימת בנקודות עיגון21,22,23. ניתן להכין רקמות בצורת טבעת על ידי הפצת הידרוג'ל קולגן לתא לתבניות בצורת טבעת. כמו הידרוג'ל קומפקטי, רקמה נוצרת סביב המוט הפנימי הבלתי ניתן לריסון של התבנית, אשר מציע עמידות עבור התכווצות רקמות נוספת24,25,26,27. לאחר דחיסה ראשונית ובדרך כלל מקסימלית, רקמות עשויות להיות מועברות גם למרווחים מתכווננים כדי לרסן עוד יותר את ה- ECT המעגלי באורך רקמות מוגדר3,24,25,26,27,28,29,30. תכונות ביופיסיות ניתן להעריך התקנים סטנדרטיים אופקי או אנכי מתח מתח עם תאי עומס מתאימים תחת זן חד כיווני או דינמי3. מכיוון שלרקמות מבנה מעגלי אחיד ברובו וניתן להחזיק אותן על סורגים/ווים (נקודות עיגון ו/או מתמרי כוח), אם כי אלה עשויים עדיין לתחום אזורי דחיסה סביב מוטות הטעינה, פורמט זה מאפשר וריאציית מאמץ אחידה יותר בהשוואה להדק3. יתר על כן, רקמות מעוגנות מעוררות צורת תא דו קוטבי, ותאים מסתגלים לכוחות הרקמה על ידי התארכות לאורך קווי כוח המקדמים אחיזה אניזוטרופית31,32,33,34,35,36. יש לנו בעבר מיושם ECT בצורת טבעת מן חולדה ופיברובלסטים לב אנושיים (CF) סביב מוט נוקשה אחד בניסויים פונקציונליים מתח-זן וביצע רווח ואובדן של מחקרי פונקציה באמצעות פיברובלסטים transduced ויראלי24,25,26 ולימודים פרמקולוגיים37. יתר על כן, אנו יכולים לזהות הבדלי מין בפיברוזיס בתיווך CF במודל ECT27.
הפרוטוקול הבא ליצירת ECT אנושי, המודגם עם CF אנושי ראשוני המתקבל כ- CF cryopreserved מספקים מסחריים (ראה טבלה של חומרים), משלב את היתרונות של רקמות בצורת טבעת עם דרך קלה ומהירה לייצר רקמות מקרוסקופיות עבור פלטפורמה של 48 באר המיועדת לבדיקות מקבילות בעלות תוכן גבוה.
חשוב לציין, מודל ECT אינו מוגבל לסוג פיברובלסט מסוים, עם השימוש המתועד בחקירה של פיברובלסטים אחרים, למשל, פיברובלסטים בעור38,39. יתר על כן, פיברובלסטים מהביופסיות של המטופל פועלים באותה מידה, ובחירת הפיברובלסטים תלויה בסופו של דבר בשאלה המדעית שיש לטפל בה.
הפלטפורמה המשמשת לדור של ECT המתואר בפרוטוקול זה היא לוח תרבית תא/רקמה 48-well זמין מסחרית (איור 1A). השיטות להכנה, culturing, וניטור היווצרות ECT ותפקוד תחת גיאומטריה מוגדרת ועומס מכני בעזרת צלחת 48-well מתוארים. ECT שנוצר מוחזקים על ידי מוטות גמישים משולבים ואת העומס המכני ניתן לכוונן על פי המטרה הסופית באמצעות מוטות עם קשיות שונה (ערך חוף 36-89), המשפיעים על נוקשות הכיפוף שלהם. פולנים עם חוף ערך של 46 מומלצים. הפרוטוקול, בנוסף, תואם עובש עגול מותאם אישית שתואר בעבר, שבו ECT מוחזק סביב מוט נוקשה אחד37. הממדים של עובש זה ניתנים באיור 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של תבניות יציקה. (א) שרטוט טכני ומידות של תבנית יציקה עם שני קטבים גמישים. התבנית כוללת היקף פנימי המופרד על ידי קיר קצר המכיל מוטות תמך כפולים בגוף הראשי של התבנית. לקטבים הגמישים יש מרחק אופקי חופשי זה לזה והם מחוברים בבסיס. התבנית מאפשרת נפח יציקה של 180 μL. הבאר של כל עובש מאפשרת קיבולת נפח של לפחות 600 μL של מדיה תרבותית. קומפוזיציות חומר שונות ניתן להשתמש כדי לייצר קטבים עם נוקשות ספציפית (למשל, TM5MED-TM9MED). (ב) שרטוט טכני ומידות של תבנית בצורת טבעת עם מוט נוקשה יחיד. זוהי תבנית חלופית עם גיאומטריה ברורה וסביבה מכנית, אשר ניתן להשתמש עם פרוטוקול יציקת ECT37. שיטת הרכבת העובש בצורת טבעת הותאמה מתבניות גדולות יותר שפורסמו28,41. בקצרה, השיטה כוללת (1) חותם פוליטרפלואורואתילן (PTFE) דפוס מרווחים (קוטר 8 מ"מ) בפולידימתילסילוקסן (PDMS, סיליקון) שפכו לתוך כלים זכוכית (קוטר 60 מ"מ), ו (2) תיקון מחזיק מוט PDMS (קוטר 1.5 מ"מ) קונצנטרי בתוך החלל החלול שנוצר, אשר משמש (3) להחזיק מוט נשלף (צינור סיליקון קוטר 4 מ"מ). תוצאת החלל החלולה מאפשרת 180 μL של נפח הליהוק. כל צלחת זכוכית יכולה להכיל תבניות מוטבעות מרובות (מוצגות בצורה מופת עם 5 תבניות) ויש לה את היכולת של עד 5 מ"ל של מדיום תרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

פיברובלסטים הם תאים דינמיים מאוד פנוטיפיים, אשר במהירות transdifferentiate לתוך myofibroblasts בתגובה גירויים ביוכימיים וביומכניים. ההבנה הנוכחית של תהליכים פיברוטיים, כולל פיברוזיס לב, נותרה גרועה, מה שמעכב את התפתחותם של טיפולים אנטי-פיברוטיים חדשים. מערכות מודל אנושיות ניתנות לשליטה ואמינות חיוניות להבנה טובה יותר של פתולוגיה פיברוזיס. זהו פרוטוקול רב-רב-ממד ליצירת רקמות חיבור מהונדסות (ECT) בלוח יציקה של 48 בארות כדי להקל על מחקרים על פיברובלסטים ועל הפתופיזיולוגיה של רקמה פיברוטית בסביבה תלת-ממדית (תלת-ממדית). ECT נוצרים סביב הקטבים עם נוקשות טונה, המאפשר מחקרים תחת עומס ביומכני מוגדר. תחת תנאי הטעינה המוגדרים, ניתן ללמוד התאמות פנוטיפיות הנשלטות על ידי אינטראקציות מטריצת תאים. בדיקה מקבילה אפשרית בפורמט 48-well עם הזדמנות לניתוח מסלול זמן של פרמטרים מרובים, כגון דחיסת רקמות והתכווצות נגד העומס. מפרמטרים אלה, תכונות ביומכניות כגון נוקשות רקמות וגמישות ניתן ללמוד.

ECT להגיע סביב 95% דחיסה לעומת נפח הידרוג'ל קולגן התא הראשוני בתוך 24 שעות הראשונות. דחיסת רקמות והתכווצות בתנאי בקרה ובנוכחות FCS מתבצעת מספר שעות לאחר הליהוק, ובמיוחד עולה עד היום החמישי (איור 5A). הסטת הקוטב עשויה לגדול עוד יותר במהלך 15 הימים הבאים (20 יום היה הזמן הארוך ביותר שנב...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

פרוטוקול זה מאפשר לפיברובלסט לבנות ולארגן את הסביבה שלהם בתנאים מכניים מוגדרים. תוצאות אלה רקמות אניזוטרופיות עם נוקשות והרכבי מטריצה הדומים לסביבה הטבעית של התא. שיטה זו מאפשרת להשוות עד 48 תנאים במקביל.הוא גמיש ביחס לסוג התא ותנאי התרבות המשמשים. באמצעות רק כמה רכיבים מוגדרים היטב, הוא ניתן לשחזור בין מעבדות. על ידי החלת גורמים פרו-פיברוטיים או תרופות אנטיפיברוטיות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את התהליכים הבסיסיים ואת הטיפולים של מחלות פיברוטיות מכל סוג שהוא.מי שתדגים את ההליך תהיה אליסה דגריב, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו, ואני. ראשית, להפשיר את פיברובלסטים לב השתמרו הקפיאו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשתי דקות עד שהבישונאי נשאר עם כמות קטנה של קרח בלבד. לאחר מכן, להעביר את השעיית התא dropwise באמצעות פיפטה סרולוגית שני מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי מתאים המכיל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה פיברובלסט.לאחזור תאים אופטימלי, יש לשטוף את הקפו-ביון במיליליטר אחד של FGM ולהעביר אותו לצינור הצנטריפוגה. בעדינות respend התאים ולהעביר לתוך בקבוק תרבית התא. לחדש FGM כל יומיים במשך חמישה ימים או עד התאים הגיעו 80% conencency.לאחר שאיפת המדיום מהתאים בתרבית, לשטוף תאים עם שישה מיליליטר של PBS ולשאף, ולאחר מכן להוסיף שישה מיליליטר של ריאגנט ניתוק התא לתאים ודגרה עד ניתוק התא גלוי. לנטרל פעילות אנזימטית על ידי הוספת שישה עד 12 מיליליטר של FGM לתאים שהושמטו בריאגנט שיוך התאים. פיפט בעדינות למעלה ולמטה ארבע עד שמונה פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להבטיח מתלה תא יחיד ולהעביר את התאים לתוך צינור איסוף 50 מיליליטר טרי.אמת את התפוקה בעזרת מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן והשלך את התאים. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant, להעיף את הצינור כדי לנטרל את הכדור ו resuspend התאים FGM. לאחר מכן, מסננים את ההשעיה של התא באמצעות מסננת תאי רשת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן באמצעות מונה תאים אוטומטי, מעריכים את מספר התא ואת הכדאיות על ידי אי-הכללה של זרם חשמלי כדי להבטיח מספרי תאים אמינים לפני שתמשיך עם רקמות חיבור מהונדסות או הכנת ECT.כדי להתכונן ל- ECT, התאם את ההשעיה של התא ל-8.9 מיליון תאים למיליליטר ב-20 עד 25 מעלות צלזיוס על ידי הוספת FGM ושמירה על התאים על קרח. מעבירים את כל הצינורות האחרים המכילים את הרכיבים הבודדים של תערובת הידרוג'ל ECT על קרח ומצננים מראש צינור צנטריפוגה ריק של 50 מיליליטר כדי להכין את התערובת. התחל להכין את תערובת הידרוג'ל ECT על ידי הוספת רכיבים המתוארים בטקסט לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר צונן מראש הימנעות היווצרות בועת אוויר.ראשית, פיפטה סוג קולגן מסיס בחומצה אני הידרוג'ל לתוך פיפטה סרולוגית עם קצה משעמם רחב. התאם את תכולת המלח של תמיסה קולגן על ידי הוספת DMEM תוך ערבוב עדין של הצינור לערבוב נכון. כדי לנטרל את ה- pH, הוסף 0.2 נתרן הידרוקסיד טוחן תוך ערבול הצינור ולאשר את הנטרול על ידי התבוננות בצבע האדום של המחוון האדום פנול.לאחר מכן הוסף את השעיית התא טיפה תוך מערבולת בעדינות את הצינור. מערבבים את המתלים על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה רק פעם אחת באמצעות פיפטה סרולוגית עם קצה משעמם רחב כדי למנוע היווצרות בועה ולמזער את הלחץ הגיזה. מערבבים בעדינות את הצינור 10 פעמים לערבוב יסודי.שמור את צינור הצנטריפוגה המכיל תערובת הידרוג'ל ECT על קרח לאורך כל תהליך הליהוק. הרטיבו טיפ פיפטה של מיליליטר אחד בתערובת הידרוג'ל ECT, ולאחר מכן הפיזרו 180 מיקרוליטרים של תערובת הידרוג'ל באופן שווה לכל תבנית של צלחת הליהוק 48-well הימנעות כוחות גיזה מופרזת שעלולים להשפיע על שלמות הרכבת מטריצת הקולגן ולהבטיח כי הצלחת כולה מסתיימת תוך 15 עד 20 דקות. ודא כי לולאה מלאה צורות בתוך התבנית כמו התפלגות רצינית של תערובת ECT ימנע היווצרות טבעת ECT מלאה.הימנעו מלהיכנס לבאר הפנימית וליצור בועות במהלך ההצינורות כדי להבטיח יציקת הידרוג'ל ECT אחידה להיווצרות רקמות הומוגניות ופונקציונליות. מניחים בזהירות את צלחת הליהוק 48-well בתוך החממה תרבית התא כדי ליישב מחדש את תערובת הידרוג'ל ECT במשך 15 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, זה נראה כמו ג'ל ואטום.הוסף 600 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס חם FGM לבאר לאורך הקיר בעדינות כדי למנוע ניתוק ECT מלמטה. החלף את המדיום כל יום עם 500 microliters של FGM עד ניתוח. בנקודות הזמן הרצויות, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי להקליט תמונות מיקרוסקופיות של התצוגות העליונות והצדיות של ה- ECT.השתמש בתוכנית לעיבוד תמונה כדי לבצע ניתוח סריקת שורות. הגדר קנה מידה והשתמש בכלי הקו הישר כדי לעקוב ולמדוד את קטרי ה- ECT במינימום שש עמדות לכל זרוע בכל מישור הדמיה. צלם את לוחית הליהוק בת 48 הטובות מתחת למכשיר הקלטה עם מצלמת סריקה אזורית משולבת הממוקמת במרחק קבוע המצויד בחיישן תמונה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה ובמקור אור כמעט UV.בצע זיהוי אוטומטי של הטיפים של הקטבים המכילים צבע פלואורסצנטי למיקסום הניגודיות. מדוד את המרחק בין הקטבים מרשומות יומיות באמצעות ניתוח אוטומטי על-ידי הפעלת התמונות המוקלטות בתוכנה כדי לזהות פיקסלים בהירים בעלי ניגודיות גבוהה על רקע כהה או תוכנית לעיבוד תמונה. הסר את ECT מעמודי שמירה ולהוסיף וו העברה לולאת ECT.לאחר מכן להעביר את ECT על שני ווים מהודקים לזרוע הנייחת וזרוע המתמר של ריומטר מכני דינמי מאריך מצויד באמבט איברים מחוסם 37 מעלות צלזיוס מלא PBS. החל מתח חד-מיני בקצב ליניארי קבוע על-ידי הגדרת הריומטר בכ-1% מהמרחק ההתחלתי בין הווים לשניה. ניתן להשתמש בקצב מתיחה קבוע של 0.03 מילימטר לשנייה עם ממדי ECT טיפוסיים.לקרוע את כוח המתמר וליזום את המתיחה. שמור להקליט עד לנקודה של ECT קרע לאחר נרמול הכוח הנמדד על ידי אזור חתך ולתוות את עקומת הלחץ-זן קביעת פרמטרים ביומכניים שונים. רגע לפני שהרקמה מתחילה בשבירה זעירה, הגבול העליון של האזור האלסטי מתאים לנקודת התשואה והמתח שלה הוא מדד של גמישות רקמות.אזור הפלסטיק נמצא בין נקודת התשואה לנקודת הכשל. נקודת הכישלון תואמת לירידה פתאומית בלחץ עקב קרע של הרקמה, הגדרת הזן האולטימטיבי שהוא מדד של הרחבת רקמות. נקודת המדידה השלישית תואמת את הכוח המרבי המוגדר על ידי הלחץ הגבוה ביותר שהרקמה יכולה לשאת מבלי לשבור במהלך המתיחה.החוסן והקשוחה הניתנים על ידי האזור שמתחת לעקומה תואמים את האנרגיה הנקלטת על ידי הרקמה עד לנקודת התשואה ונקודת הכישלון בהתאמה. עבור כל עקומה שהושגה, השיפוע של החלק הליניארי של האזור האלסטי מתאים מודולוס של יאנג, הידוע גם בשם מודולוס אלסטי. זהו מאפיין מכני המודד את נוקשות הרקמה.באמצעות פרוטוקול זה, דחיסת ECT והתכווצות בתנאי בקרה ובנוכחות FCS התפתחו כמה שעות לאחר הליהוק ובמיוחד גדל עד היום החמישי. כאשר ECT טופל עם מעכב פילמור אקטין Latrunculin A, דחיסת ECT צומצמה כפי שצוין על ידי אזור חתך גבוה משמעותית בהשוואה לשליטה. התכווצות הרקמות הוערכה במהלך חמשת ימי התרבות.בהיעדר לדרונקין A, ההתכווצות גדלה בהדרגה עד היום החמישי והגיעה לכ -40%. עם זאת, נוכחות Latrunculin A השפיעה על התכווצות הרקמה וכתוצאה מכך רק כ 20% התכווצות מקסימלית. עיכוב פילמור אקטין הוביל להפחתה משמעותית של כ -50% בנוקיות הרקמה על השליטה.תוצאות אלה מראות כי שלמות הציטוסד actin חיונית לדחיסת ECT, התכווצות, התקשות. חשוב לבחור פתרון קולגן אמין ואיכותי ולהבטיח כי מתלה תא אחד עם כדאיות גבוהה משמש לשיפוץ רקמות חיבור מהונדסות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

מותאם אישית מהונדסים תרביות רקמה בתבניות של מאסטרים נחרטו לייזר

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...