Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla German Cardiac Society (DGK Research Fellowship for GLS) e dalla German Research Foundation (DFG attraverso il progetto IRTG 1816 per GLS e AD; DFG 417880571 e DFG TI 956/1-1 per MT; SFB 1002 TP C04 per MT e WHZ; SFB 1002 TP S01 per WHZ; e EXC 2067/1-390729940J per WHZ). WHZ è sostenuto dal Ministero federale tedesco per la scienza e l'istruzione (BMBF attraverso il progetto IndiHEART) e dalla Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ e SL sono supportati dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK).

Tutte le fasi devono essere intraprese in cappe di biosicurezza di classe II installate in laboratori di livello di contenimento 1. A seconda delle normative locali e del tipo di manipolazioni da eseguire, come il trasferimento genico mediato da virus, il livello di contenimento deve essere aumentato al livello di biosicurezza 2 o 3. Tutte le colture sono mantenute a 37 °C in un incubatore di colture cellulari con un'atmosfera umidificata del 5 % di CO2 nell'aria. Si noti che i volumi (passaggi 1 e 2) sono fo...

Il protocollo presentato descrive la generazione di ECT da CF umano primario, che consente di studiare l'impatto meccanico di queste cellule sul loro ambiente di matrice extracellulare e viceversa.
I fibroblasti devono essere espansi per produrre cellule sufficienti per gli esperimenti ECT pianificati (0,75 x 106 cellule / ECT). Per la migliore riproducibilità, si consiglia di pre-coltivare fibroblasti congelati o derivati da tessuti in coltura monostrato 2D per una durata standard...

Uno dei principali ostacoli nello studio delle malattie fibrotiche è la mancanza di modelli di tessuto 3D umano rappresentativi che forniscano informazioni sul comportamento dei fibroblasti e dei loro derivati patologici. Per studiare i processi fibrotici, i sistemi di coltura 2D standard sono sub-ottimali poiché i fibroblasti isolati si transdifferenziano rapidamente in miofibroblasti che esprimono α-liscia di actina muscolare (SMA) quando coltivati su substrati 2D non conformi1,2,3. Pertanto, i fibroblasti nella coltura 2D standard non riflettono un fenotipo tissutale "sano" regolare3,4,5,6. Sono state introdotte colture su substrati flessibili per simulare ambienti tissutali non fibrotici (10 kPa) e fibrotici (35 kPa)7, ma questi mancano della terza dimensione, che è molto importante per quanto riguarda la fisiopatologia. L'ingegneria tissutale offre l'opportunità di superare questa limitazione consentendo la coltura di fibroblasti in un contesto di matrice extracellulare (ECM) definito e sperimentalmente sintonizzabile, ad esempio mediante alterazioni della cellularità, della composizione ECM e della concentrazione di ECM, che possono determinare la biomeccanica tissutale.
Vari modelli 3D sono stati generati utilizzando fibroblasti. I dischi galleggianti e le microsfere sono stati tra i primi e dimostrano che il collagene viene rimodellato e compattato in modo dipendente dal tempo. I fibroblasti esercitano forze di trazione sulle fibrille di collagene, un processo che può essere facilitato dall'aggiunta di agenti pro-fibrotici come il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Tuttavia, le colture liberamente fluttuanti non consentono il carico esterno controllato e, pertanto, costituiscono modelli in continua contrazione o compattazione. I tessuti ingegnerizzati simili a fogli hanno aperto la possibilità di studiare la regolazione omeostatica delle proprietà biomeccaniche dei tessuti, in particolare attraverso test di deformazione uni, bi, multiassiale o ciclica17,18,19,20. Questi modelli sono stati utilizzati, ad esempio, per dimostrare l'influenza del numero di cellule sulla rigidità del tessuto, che è risultata correlata positivamente con l'integrità del citoscheletro e la contrattilità del citoscheletro dell'actomiosina.18,19. Tuttavia, è importante notare che le conversioni forza-deformazione sono complicate dalla deformazione tissutale non uniforme attorno ai punti di serraggio dei trasduttori di forza e dei punti di ancoraggio. Questa limitazione intrinseca può essere aggirata da ossa di cane o tessuti a forma di anello, offrendo una certa applicazione dei tessuti nei punti di ancoraggio21,22,23. I tessuti a forma di anello possono essere preparati distribuendo un idrogel di collagene cellulare in stampi a forma di anello. Mentre l'idrogel si compatta, un tessuto si forma attorno all'asta interna incomprimibile dello stampo, che offre resistenza per un'ulteriore contrazione del tessuto24,25,26,27. Dopo la compattazione iniziale e tipicamente massima, i tessuti possono anche essere trasferiti a distanziali regolabili per trattenere ulteriormente l'ECT circolare a una lunghezza di tessuto definita.3,24,25,26,27,28,29,30. Le proprietà biofisiche possono essere valutate in dispositivi standard orizzontali o verticali di deformazione-sollecitazione con celle di carico appropriate sotto deformazione unidirezionale o dinamica3. Poiché i tessuti hanno una struttura circolare ampiamente uniforme e possono essere tenuti su barre/ganci (punti di ancoraggio e/o trasduttori di forza), sebbene questi possano ancora racchiudere aree di compressione attorno alle barre di carico, questo formato consente una variazione di deformazione più uniforme rispetto al serraggio3. Inoltre, i tessuti ancorati suscitano una forma cellulare bipolare e le cellule si adattano alle forze tissutali per allungamento lungo le linee di forza promuovendo la trazione anisotropica.31,32,33,34,35,36. In precedenza abbiamo applicato ECT a forma di anello da fibroblasti cardiaci (CF) di ratto e umani attorno a un singolo polo rigido in esperimenti di stress funzionale e abbiamo eseguito studi di guadagno e perdita di funzione utilizzando fibroblasti trasdotti viralmente24,25,26 e studi farmacologici37. Inoltre, potremmo identificare le differenze sessuali nella fibrosi cf-mediata nel modello ECT27.
Il seguente protocollo per la generazione di ECT umano, esemplificato con CF umano primario ottenuto come CF crioconservato da fornitori commerciali (vedi Tabella dei materiali), combina i vantaggi dei tessuti a forma di anello con un modo semplice e veloce di produrre tessuti macroscopici per una piattaforma a 48 pozzi progettata per test paralleli ad alto contenuto.
È importante sottolineare che il modello ECT non è limitato a un tipo specifico di fibroblasti, con l'uso documentato nello studio di altri fibroblasti, ad esempio fibroblasti cutanei38,39. Inoltre, i fibroblasti delle biopsie del paziente funzionano altrettanto bene e la scelta dei fibroblasti dipende in ultima analisi dalla questione scientifica da affrontare.
La piattaforma utilizzata per la generazione di ECT descritta in questo protocollo è una piastra di coltura cellulare/tissutale 3D a 48 pozzetti disponibile in commercio (Figura 1A). Vengono descritti i metodi per la preparazione, la coltivazione e il monitoraggio della formazione e della funzione dell'ECT sotto una geometria definita e un carico meccanico con l'aiuto della piastra a 48 pozzetti. Gli ECT formati sono tenuti da pali flessibili integrati e il carico meccanico può essere messo a punto in base allo scopo finale utilizzando pali con diversa durezza (shore A valore 36-89), influenzandone le rigidità di flessione. Si raccomandano pali con una riva Un valore di 46. Il protocollo è, inoltre, compatibile con uno stampo circolare personalizzato precedentemente descritto, in cui l'ECT è tenuto attorno a una singola asta rigida37. Le dimensioni di questo stampo sono indicate nella Figura 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica degli stampi di fusione. (A) Disegno tecnico e dimensioni di uno stampo di colata con due poli flessibili. Lo stampo comprende una circonferenza interna delimitata da una parete corta che contiene doppi pali di ritenzione sul corpo principale dello stampo. I poli flessibili hanno una distanza orizzontale libera l'uno dall'altro e sono collegati alla base. Lo stampo consente un volume di fusione di 180 μL. Il pozzetto di ogni stampo consente una capacità volumetrica di almeno 600 μL di terreno di coltura. Diverse composizioni di materiali possono essere utilizzate per produrre pali con rigidità specifiche (ad esempio, TM5MED-TM9MED). (B) Disegno tecnico e dimensioni di uno stampo a forma di anello con una singola asta rigida. Si tratta di uno stampo alternativo con geometria e ambiente meccanico distinti, che può essere utilizzato con il protocollo di fusione ECT37. Il metodo di assemblaggio dello stampo a forma di anello è stato adattato dai formati più grandi pubblicati28,41. In breve, il metodo include (1) l'imprinting di distanziali di stampaggio in politetrafluoroetilene (PTFE) (diametro 8 mm) in polidimetilsilossano (PDMS, silicone) versato in piatti di vetro (diametro 60 mm) e (2) il fissaggio di un supporto per palo PDMS (diametro 1,5 mm) concentricamente all'interno della cavità cava formata, che serve a (3) tenere un palo rimovibile (tubo in silicone di 4 mm di diametro). Lo spazio vuoto risultante consente 180 μL di volume di colata. Ogni piatto di vetro può contenere più stampi impressi (mostrati in modo esemplare con 5 stampi) e ha la capacità di raggiungere fino a 5 ml di terreno di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

I fibroblasti sono cellule fenotipicamente altamente dinamiche, che si trasdifferentizzano rapidamente in miofibroblasti in risposta a stimoli biochimici e biomeccanici. L'attuale comprensione dei processi fibrotici, compresa la fibrosi cardiaca, rimane scarsa, il che ostacola lo sviluppo di nuove terapie anti-fibrotiche. Sistemi modello umano controllabili e affidabili sono fondamentali per una migliore comprensione della patologia fibrosa. Si tratta di un protocollo altamente riproducibile e scalabile per generare tessuti connettivi ingegnerizzati (ECT) in una piastra di colata a 48 pozzetti per facilitare gli studi sui fibroblasti e la fisiopatologia del tessuto fibrotico in un ambiente tridimensionale (3D). Gli ECT sono generati attorno ai poli con rigidità sintonizzabile, consentendo studi sotto un carico biomeccanico definito. Nelle condizioni di carico definite, possono essere studiati adattamenti fenotipici controllati dalle interazioni cellula-matrice. Il test parallelo è fattibile nel formato a 48 pozzetti con l'opportunità per l'analisi del percorso temporale di più parametri, come la compattazione e la contrazione dei tessuti contro il carico. Da questi parametri è possibile studiare le proprietà biomeccaniche come la rigidità e l'elasticità dei tessuti.

L'ECT raggiunge circa il 95% di compattazione rispetto al volume iniziale di idrogel di collagene cellulare entro le prime 24 ore. La compattazione e la contrazione tissutale in condizioni di controllo e in presenza di FCS si verificano poche ore dopo la colata e aumentano notevolmente fino al giorno 5 (Figura 5A). La deflessione del polo può aumentare ulteriormente durante i successivi 15 giorni (20 giorni è stato il tempo più lungo testato). L'entità della deflessione del polo dipende ...

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Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Questo protocollo consente ai fibroblasti di costruire e organizzare il proprio ambiente in condizioni meccaniche definite. Questi risultati in tessuti anisotropi con rigidità e composizioni matriciali paragonabili all'ambiente naturale della cellula. Questo metodo consente di confrontare fino a 48 condizioni in parallelo.È flessibile rispetto al tipo di cellula utilizzato e alle condizioni di coltura. Utilizzando solo pochi componenti ben definiti, è riproducibile tra i laboratori. Applicando fattori pro-fibrotici o farmaci antifibrotici, questo protocollo può essere utilizzato per studiare i processi e le terapie sottostanti delle malattie fibrotiche di qualsiasi tipo.A dimostrare la procedura saranno Alisa Degrave, dottoranda del nostro laboratorio, e io. Per cominciare, scongelare i fibroblasti cardiaci crio-conservati a bagnomaria a 37 gradi Celsius per circa due minuti fino a quando la fiala non rimane con solo una piccola quantità di ghiaccio. Quindi, trasferire la sospensione cellulare a goccia usando una pipetta sierologica da due millilitri in un tubo centrifugo sterile appropriato contenente 10 millilitri di terreno di crescita dei fibroblasti.Per un recupero ottimale delle cellule, sciacquare la crio-fiala con un millilitro di MGF e trasferirla nel tubo della centrifuga. Risospese delicatamente le cellule e trasferirle in un pallone di coltura cellulare. Reintegrare le MGF a giorni alterni per cinque giorni o fino a quando le cellule non hanno raggiunto l'80% di confluenza.Dopo aver aspirato il mezzo dalle cellule coltivate, lavare le cellule con sei millilitri di PBS e aspirare, quindi aggiungere sei millilitri del reagente di dissociazione cellulare alle cellule e incubare fino a quando il distacco cellulare è visibile. Neutralizzare l'attività enzimatica aggiungendo da sei a 12 millilitri di MGF alle cellule spostate nel reagente di associazione cellulare. Pipettare delicatamente su e giù da quattro a otto volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri per garantire una sospensione a cella singola e trasferire le celle in un tubo di raccolta fresco da 50 millilitri.Verificare la resa con l'aiuto di un contatore di celle automatizzato secondo le istruzioni del produttore e pellet giù per le celle. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante, far scorrere il tubo per rimuovere il pellet e risospesso le cellule nelle MGF. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a maglie da 40 micrometri, quindi utilizzare un contatore cellulare automatizzato, valutare il numero di cellule e la vitalità mediante esclusione di corrente elettrica per garantire numeri di cellule affidabili prima di procedere con tessuti connettivi ingegnerizzati o preparazione ECT.Per prepararsi all'ECT, regolare la sospensione cellulare a 8,9 milioni di cellule per millilitro a 20-25 gradi Celsius aggiungendo MGF e mantenendo le cellule sul ghiaccio. Trasferire tutti gli altri tubi contenenti i singoli componenti della miscela di idrogel ECT sul ghiaccio e pre-raffreddare un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri per preparare la miscela. Iniziare a preparare la miscela di idrogel ECT aggiungendo i componenti descritti nel testo al tubo centrifugo pre-refrigerato da 50 millilitri evitando la formazione di bolle d'aria.In primo luogo, pipettare l'idrogel di collagene solubile acido di tipo I in una pipetta sierologica con una punta di foro largo. Regolare il contenuto di sale della soluzione di collagene aggiungendo il DMEM mentre ruota delicatamente il tubo per una corretta miscelazione. Per neutralizzare il pH, aggiungere 0,2 idrossido di sodio molare mentre si ruota il tubo e confermare la neutralizzazione osservando il colore rosso dell'indicatore rosso fenolo.Quindi aggiungere la sospensione cellulare a goccia mentre ruota delicatamente il tubo. Mescolare la sospensione convogliando delicatamente su e giù una sola volta utilizzando una pipetta sierologica con una punta a foro largo per evitare la formazione di bolle e ridurre al minimo lo sforzo di taglio. Ruotare delicatamente il tubo 10 volte per una miscelazione accurata.Mantenere il tubo della centrifuga contenente miscela di idrogel ECT su ghiaccio durante tutto il processo di fusione. Bagnare una punta di pipetta da un millilitro in miscela di idrogel ECT, quindi distribuire 180 microlitri di miscela di idrogel in modo uniforme in ogni stampo della piastra di colata a 48 pozzetti evitando eccessive forze di taglio che potrebbero influire sull'integrità dell'assemblaggio della matrice di collagene e assicurando che l'intera piastra finisca in 15-20 minuti. Assicurarsi che un anello completo si formi all'interno dello stampo poiché la distribuzione discontinua della miscela ECT impedirà la formazione di un anello ECT completo.Evitare il pipettaggio nel pozzo interno e la formazione di bolle durante il pipettaggio per garantire una colata uniforme di idrogel ECT per una formazione di tessuto omogenea e funzionale. Posizionare con attenzione la piastra di colata a 48 pozzetti all'interno dell'incubatore di colture cellulari per ricostituire la miscela di idrogel ECT per 15-30 minuti. Dopo l'incubazione, appare gelatinoso e opaco.Aggiungere 600 microlitri di 37 gradi Celsius di MGF caldo per pozzetto lungo la parete delicatamente per evitare il distacco dell'ECT dal fondo. Sostituire il mezzo ogni giorno con 500 microlitri di MGF fino all'analisi. Nei punti temporali desiderati, utilizzare uno stereomicroscopio per registrare immagini microscopiche delle viste superiori e laterali dell'ECT.Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per eseguire un'analisi di scansione della linea. Impostare una scala e utilizzare lo strumento linea retta per tracciare e misurare i diametri ECT in un minimo di sei posizioni per braccio in ciascun piano di imaging. Immagine della piastra di fusione a 48 pozzetti sotto un dispositivo di registrazione con una telecamera di scansione dell'area integrata posizionata a una distanza fissa dotata di un sensore di immagine monocromatico ad alta risoluzione e di una sorgente di luce quasi UV.Eseguire il rilevamento automatico delle punte dei poli contenenti colorante fluorescente per massimizzare il contrasto. Misura la distanza tra i poli dai record giornalieri utilizzando un'analisi automatizzata eseguendo le immagini registrate sul software per rilevare pixel luminosi ad alto contrasto su uno sfondo scuro o un programma di elaborazione delle immagini. Rimuovere l'ECT dai pali di ritenzione e inserire un gancio di trasferimento e un anello ECT.Quindi trasferire l'ECT su due ganci bloccati al braccio stazionario e al braccio trasduttore di un riometro meccanico dinamico estensivo dotato di un bagno d'organo temperato a 37 gradi Celsius riempito con PBS. Applicare la tensione uniassiale a una velocità lineare costante impostando il riometro a circa l'1% della distanza iniziale tra i ganci al secondo. Una velocità di allungamento costante di 0,03 millimetri al secondo può essere utilizzata con dimensioni ECT tipiche.Strappare la forza del trasduttore e avviare l'allungamento. Continuare a registrare fino al punto di rottura dell'ECT dopo aver normalizzato la forza misurata per area della sezione trasversale e tracciare la curva stress-deformazione determinando diversi parametri biomeccanici. Poco prima che il tessuto inizi la microfreturazione, il limite superiore della regione elastica corrisponde al punto di snervamento e la sua deformazione è una misura dell'elasticità del tessuto.La regione di plastica si trova tra il punto di snervamento e il punto di guasto. Il punto di guasto corrisponde ad un improvviso calo dello stress dovuto alla rottura del tessuto, definendo la deformazione finale che è una misura dell'estensibilità tissutale. Il terzo punto di misura corrisponde alla massima resistenza definita dalla massima sollecitazione che il tessuto può sopportare senza rompersi durante l'allungamento.La resilienza e la tenacità date dall'area sotto la curva corrisponde all'energia assorbita dal tessuto fino al punto di snervamento e al punto di guasto rispettivamente. Per ogni curva ottenuta, la pendenza della parte lineare della regione elastica corrisponde al modulo di Young, noto anche come modulo elastico. È una proprietà meccanica che misura la rigidità del tessuto.Utilizzando questo protocollo, la compattazione e la contrazione ECT in condizioni di controllo e in presenza di FCS sono seguite poche ore dopo la fusione e in particolare sono aumentate fino al quinto giorno. Quando l'ECT è stato trattato con l'inibitore della polimerizzazione dell'actina Latrunculin A, la compattazione dell'ECT è stata ridotta come indicato dall'area della sezione trasversale significativamente più alta rispetto al controllo. La contrazione dei tessuti è stata valutata durante i cinque giorni di coltura.In assenza di Latrunculin A, la contrazione è aumentata gradualmente fino al quinto giorno raggiungendo una contrazione di circa il 40%. Tuttavia, la presenza di Latrunculin A ha influenzato la contrazione tissutale con conseguente contrazione massima di circa il 20%. L'inibizione della polimerizzazione dell'actina ha portato a una significativa riduzione di circa il 50% della rigidità del tessuto rispetto al controllo.Questi risultati dimostrano che l'integrità citoscheletrica dell'actina è essenziale per la compattazione, la contrazione e l'irrigidimento dell'ECT. È importante selezionare una soluzione di collagene affidabile e di alta qualità e assicurarsi che una sospensione unicellulare ad alta vitalità venga utilizzata per ricostituire i tessuti connettivi ingegnerizzati.

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