Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Alemana de Cardiología (DGK Research Fellowship for GLS) y por la Fundación Alemana de Investigación (DFG a través del proyecto IRTG 1816 para GLS y AD; DFG 417880571 y DFG TI 956/1-1 para MT; SFB 1002 TP C04 para MT y WHZ; SFB 1002 TP S01 para WHZ; y EXC 2067/1-390729940J para WHZ). WHZ cuenta con el apoyo del Ministerio Federal Alemán de Ciencia y Educación (BMBF a través del proyecto IndiHEART) y la Fundación Leducq (20CVD04). MT, WHZ y SL cuentan con el apoyo del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK).

Todos los pasos deben realizarse en campanas de bioseguridad de Clase II instaladas en laboratorios bajo nivel de contención 1. Dependiendo de las regulaciones locales y el tipo de manipulaciones que se realizarán, como la transferencia de genes mediada por virus, el nivel de contención debe aumentarse al nivel de bioseguridad 2 o 3. Todos los cultivos se mantienen a 37 °C en una incubadora de cultivo celular con una atmósfera humidificada de 5 % de CO2 en el aire. Tenga en cuenta que los volúmenes (paso...

El protocolo presentado describe la generación de TEC a partir de la FQ humana primaria, lo que permite estudiar el impacto mecánico de estas células en su entorno de matriz extracelular y viceversa.
Los fibroblastos deben expandirse para producir suficientes células para los experimentos de TEC planificados (0,75 x 106 células / TEC). Para la mejor reproducibilidad, se aconseja precultivar fibroblastos congelados o derivados de tejidos en cultivo monocapa 2D durante una duraci...

Un obstáculo importante en el estudio de las enfermedades fibróticas es la falta de modelos representativos de tejidos humanos en 3D que proporcionen información sobre el comportamiento de los fibroblastos y sus derivados patológicos. Para estudiar los procesos fibróticos, los sistemas de cultivo 2D estándar son subóptimos, ya que los fibroblastos aislados se transdiferencian rápidamente en miofibroblastos que expresan actina del músculo α liso (AME) cuando se cultivan en sustratos 2D no conformes1,2,3. Por lo tanto, los fibroblastos en el cultivo 2D estándar no reflejan un fenotipo tisular "sano" regular3,4,5,6. Se han introducido cultivos sobre sustratos flexibles para simular ambientes tisulares no fibróticos (10 kPa) y fibróticos (35 kPa)7, pero estos carecen de la tercera dimensión, que es muy importante con respecto a la fisiopatología. La ingeniería de tejidos brinda la oportunidad de superar esta limitación al permitir el cultivo de fibroblastos en un contexto de matriz extracelular (ECM) definido y experimentalmente sintonizable, por ejemplo, por alteraciones en la celularidad, la composición de ECM y la concentración de ECM, todo lo cual puede determinar la biomecánica del tejido.
Se han generado varios modelos 3D utilizando fibroblastos. Los discos flotantes y las microesferas estuvieron entre los primeros y demuestran que el colágeno se remodela y compacta de una manera dependiente del tiempo. Los fibroblastos ejercen fuerzas de tracción sobre las fibrillas de colágeno, un proceso que puede facilitarse mediante la adición de agentes profibróticos como el factor de crecimiento transformador beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Sin embargo, los cultivos que flotan libremente no permiten la carga externa controlada y, por lo tanto, constituyen modelos que se encogen o compactan continuamente. Los tejidos diseñados en forma de lámina abrieron la posibilidad de estudiar la regulación homeostática de las propiedades biomecánicas de los tejidos, es decir, a través de pruebas de deformación uni, bi, multiaxial o cíclica.17,18,19,20. Estos modelos se han utilizado, por ejemplo, para demostrar la influencia del número de células en la rigidez del tejido, que se encontró que se correlaciona positivamente con la integridad del citoesqueleto y la contractilidad del citoesqueleto de actomiosina.18,19. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las conversiones de fuerza a deformación se complican por la deformación no uniforme del tejido alrededor de los puntos de sujeción de los transductores de fuerza y los puntos de anclaje. Esta limitación inherente puede ser evitada por tejidos de hueso de perro o en forma de anillo, ofreciendo cierta aplicación de tejidos en los puntos de anclaje.21,22,23. Los tejidos en forma de anillo se pueden preparar distribuyendo un hidrogel de colágeno celular en moldes en forma de anillo. A medida que el hidrogel se compacta, se forma un tejido alrededor de la varilla interna incompresible del molde, que ofrece resistencia para una mayor contracción del tejido.24,25,26,27. Después de la compactación inicial y típicamente máxima, los tejidos también pueden transferirse a espaciadores ajustables para restringir aún más la TEC circular a una longitud de tejido definida.3,24,25,26,27,28,29,30. Las propiedades biofísicas pueden evaluarse en dispositivos estándar de tensión por deformación horizontal o vertical con células de carga adecuadas bajo deformación unidireccional o dinámica3. Como los tejidos tienen una estructura circular en gran medida uniforme y se pueden sostener en barras / ganchos (puntos de anclaje y / o transductores de fuerza), aunque estos aún pueden encerrar áreas de compresión alrededor de las barras de carga, este formato permite una variación de deformación más uniforme en comparación con el sujeción.3. Además, los tejidos anclados provocan una forma de célula bipolar, y las células se adaptan a las fuerzas del tejido por elongación a lo largo de las líneas de fuerza que promueven la tracción anisotrópica.31,32,33,34,35,36. Anteriormente hemos aplicado TEC en forma de anillo de fibroblastos cardíacos (FQ) de rata y humanos alrededor de un solo polo rígido en experimentos funcionales de tensión y tensión y hemos realizado estudios de ganancia y pérdida de función mediante el uso de fibroblastos transducidos viralmente.24,25,26 y estudios farmacológicos37. Además, pudimos identificar diferencias de sexo en la fibrosis mediada por FQ en el modelo de TEC27.
El siguiente protocolo para la generación de TEC humana, ejemplificado con la FQ humana primaria obtenida como FQ criopreservada de proveedores comerciales (ver Tabla de Materiales), combina las ventajas de los tejidos en forma de anillo con una forma fácil y rápida de producir tejidos macroscópicos para una plataforma de 48 pocillos diseñada para pruebas paralelas de alto contenido.
Es importante destacar que el modelo TEC no se restringe a un tipo específico de fibroblastos, con el uso documentado en la investigación de otros fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos cutáneos38,39. Además, los fibroblastos de las biopsias del paciente funcionan igualmente bien, y la elección de los fibroblastos depende en última instancia de la cuestión científica que se debe abordar.
La plataforma utilizada para la generación de TEC descrita en este protocolo es una placa de cultivo de células/tejidos 3D de 48 pocillos disponible comercialmente (Figura 1A). Se describen los métodos para la preparación, el cultivo y el monitoreo de la formación y función de ECT bajo una geometría definida y carga mecánica con la ayuda de la placa de 48 pocillos. Los ECT formados se sujetan mediante postes flexibles integrados y la carga mecánica se puede ajustar de acuerdo con el propósito final mediante el uso de postes con diferente dureza (valor Shore A 36-89), influyendo en sus rigideces de flexión. Se recomiendan los polos con una orilla Un valor de 46. El protocolo es, además, compatible con un molde circular personalizado descrito anteriormente, donde el ECT se mantiene alrededor de una sola varilla rígida37. Las dimensiones de este molde se dan en la Figura 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de moldes de fundición. (A) Plano técnico y dimensiones de un molde de fundición con dos postes flexibles. El molde comprende una circunferencia interior delimitada por una pared corta que sostiene postes de retención dobles en el cuerpo principal del molde. Los polos flexibles tienen una distancia horizontal libre entre sí y están conectados en la base. El molde permite un volumen de fundición de 180 μL. El pozo de cada molde permite una capacidad de volumen de al menos 600 μL de medios de cultivo. Se pueden utilizar diferentes composiciones de materiales para producir postes con rigideces específicas (por ejemplo, TM5MED-TM9MED). (B) Dibujo técnico y dimensiones de un molde en forma de anillo con una sola varilla rígida. Se trata de un molde alternativo con geometría y entorno mecánico distintos, que se puede utilizar con el protocolo de fundición ECT37. El método de ensamblaje de moldes en forma de anillo se adaptó de formatos más grandes publicados28,41. En resumen, el método incluye (1) la impresión de espaciadores de moldeo de politetrafluoroetileno (PTFE) (8 mm de diámetro) en polidimetilsiloxano (PDMS, silicona) vertidos en platos de vidrio (diámetro 60 mm), y (2) la fijación de un soporte de poste PDMS (1,5 mm de diámetro) concéntricamente dentro de la cavidad hueca formada, que sirve para (3) sostener un poste extraíble (tubo de silicona de 4 mm de diámetro). El espacio hueco resultante permite 180 μL de volumen de fundición. Cada plato de vidrio puede contener múltiples moldes impresos (se muestra ejemplarmente con 5 moldes) y tiene la capacidad de hasta 5 ml de medio de cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Los fibroblastos son células fenotípicamente altamente dinámicas, que se transdiferencian rápidamente en miofibroblastos en respuesta a estímulos bioquímicos y biomecánicos. La comprensión actual de los procesos fibróticos, incluida la fibrosis cardíaca, sigue siendo deficiente, lo que dificulta el desarrollo de nuevas terapias antifibróticas. Los sistemas de modelos humanos controlables y confiables son cruciales para una mejor comprensión de la patología de la fibrosis. Este es un protocolo altamente reproducible y escalable para generar tejidos conectivos (TEC) diseñados en una placa de fundición de 48 pocillos para facilitar los estudios de fibroblastos y la fisiopatología del tejido fibrótico en un entorno tridimensional (3D). Los ECT se generan alrededor de los polos con rigidez sintonizable, lo que permite estudios bajo una carga biomecánica definida. Bajo las condiciones de carga definidas, se pueden estudiar adaptaciones fenotípicas controladas por interacciones célula-matriz. Las pruebas paralelas son factibles en el formato de 48 pocillos con la oportunidad de analizar el curso de tiempo de múltiples parámetros, como la compactación y contracción del tejido contra la carga. A partir de estos parámetros, se pueden estudiar propiedades biomecánicas como la rigidez y elasticidad de los tejidos.

La TEC alcanza alrededor del 95 % de compactación en comparación con el volumen inicial de hidrogel de colágeno celular dentro de las primeras 24 h. La compactación y contracción del tejido en condiciones de control y en presencia de FCS se produce unas horas después de la fundición y aumenta notablemente hasta el día 5 (Figura 5A). La deflexión del polo puede aumentar aún más durante los siguientes 15 días (20 días fue el tiempo más largo de prueba). La magnitud de la deflexi?...

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Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Aquí se presenta un protocolo para generar tejidos conectivos diseñados para un cultivo paralelo de 48 tejidos en una placa de múltiples pocillos con polos dobles, adecuado para estudios mecanicistas, modelado de enfermedades y aplicaciones de detección. El protocolo es compatible con fibroblastos de diferentes órganos y especies y se ejemplifica aquí con fibroblastos cardíacos primarios humanos.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Este protocolo permite a los fibroblastos construir y organizar su propio entorno bajo condiciones mecánicas definidas. Estos resultados en tejidos anisotrópicos con rigidez y composiciones matriciales comparables al entorno natural de la célula. Este método permite comparar hasta 48 condiciones en paralelo.Es flexible con respecto al tipo de célula utilizada y las condiciones de cultivo. Al utilizar solo unos pocos componentes bien definidos, es reproducible entre laboratorios. Mediante la aplicación de factores profibróticos o fármacos antifibróticos, este protocolo se puede utilizar para estudiar los procesos subyacentes y las terapias de las enfermedades fibróticas de cualquier tipo.Demostrando el procedimiento estaremos Alisa Degrave, una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, y yo. Para empezar, descongele los fibroblastos cardíacos crioconservados en un baño de agua a 37 grados centígrados durante aproximadamente dos minutos hasta que el vial se deje con solo una pequeña cantidad de hielo. A continuación, transfiera la suspensión celular gota a gota utilizando una pipeta serológica de dos mililitros a un tubo de centrífuga estéril apropiado que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento de fibroblastos.Para una recuperación celular óptima, enjuague el crio-vial con un mililitro de MGF y transfiéralo al tubo de la centrífuga. Resuspenda suavemente las células y transfiéralas a un matraz de cultivo celular. Reponga la MGF cada dos días durante cinco días o hasta que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia.Después de aspirar el medio de las células cultivadas, lave las células con seis mililitros de PBS y aspire, luego agregue seis mililitros del reactivo de disociación celular a las células e incube hasta que el desprendimiento celular sea visible. Neutralice la actividad enzimática agregando de seis a 12 mililitros de MGF a las células desalojadas en el reactivo de asociación celular. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo de cuatro a ocho veces usando una pipeta serológica de 10 mililitros para asegurar una suspensión de una sola célula y transfiera las células a un tubo de recolección fresco de 50 mililitros.Verifique el rendimiento con la ayuda de un contador de celdas automatizado según las instrucciones del fabricante y peletice las celdas. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante, mueva el tubo para desalojar el gránulo y resuspenda las células en la MGF. A continuación, cuele la suspensión celular a través de un colador celular de malla de 40 micrómetros, luego use un contador celular automatizado, evalúe el número de células y la viabilidad mediante la exclusión de corriente eléctrica para garantizar números de células confiables antes de continuar con los tejidos conectivos diseñados o la preparación ECT.Para prepararse para la TEC, ajuste la suspensión celular a los 8.9 millones de células por mililitro a 20 a 25 grados Celsius agregando MGF y mantenga las células en hielo. Transfiera todos los demás tubos que contienen los componentes individuales de la mezcla de hidrogel ECT al hielo y enfríe previamente un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros para preparar la mezcla. Comience a preparar la mezcla de hidrogel ECT agregando los componentes descritos en el texto al tubo de centrífuga de 50 mililitros preenfriado evitando la formación de burbujas de aire.En primer lugar, pipetear el hidrogel de colágeno soluble en ácido tipo I en una pipeta serológica con una punta de orificio ancha. Ajuste el contenido de sal de la solución de colágeno agregando el DMEM mientras gira suavemente el tubo para una mezcla adecuada. Para neutralizar el pH, agregue hidróxido de sodio molar 0.2 mientras gira el tubo y confirme la neutralización observando el color rojo del indicador rojo fenol.Luego agregue la suspensión de la celda hacia abajo mientras gira suavemente el tubo. Mezcle la suspensión subiendo y bajando suavemente solo una vez usando una pipeta serológica con una punta de orificio ancha para evitar la formación de burbujas y minimizar el esfuerzo de cizallamiento. Agite suavemente el tubo 10 veces para una mezcla completa.Mantenga el tubo de la centrífuga que contiene la mezcla de hidrogel ECT en hielo durante todo el proceso de fundición. Humedezca una punta de pipeta de un mililitro en la mezcla de hidrogel ECT, luego distribuya 180 microlitros de mezcla de hidrogel de manera uniforme en cada molde de la placa de fundición de 48 pocillos evitando fuerzas de cizallamiento excesivas que puedan afectar la integridad del ensamblaje de la matriz de colágeno y asegurando que toda la placa termine en 15 a 20 minutos. Asegúrese de que se forme un bucle completo dentro del molde, ya que la distribución discontinua de la mezcla ECT evitará la formación completa de un anillo ECT.Evite pipetear en el pozo interno y formar burbujas durante el pipeteo para garantizar una fundición uniforme de hidrogel ECT para la formación de tejido homogéneo y funcional. Coloque cuidadosamente la placa de fundición de 48 pocillos dentro de la incubadora de cultivo celular para reconstituir la mezcla de hidrogel ECT durante 15 a 30 minutos. Después de la incubación, parece gelatinoso y opaco.Agregue 600 microlitros de 37 grados Celsius de MGF caliente por pozo a lo largo de la pared suavemente para evitar el desprendimiento de ECT desde el fondo. Reemplace el medio todos los días con 500 microlitros de MGF hasta el análisis. En los puntos de tiempo deseados, use un microscopio estereoscópico para grabar imágenes microscópicas de las vistas superior y lateral de la TEC.Utilice un programa de procesamiento de imágenes para realizar un análisis de escaneo de línea. Establezca una escala y utilice la herramienta de línea recta para trazar y medir los diámetros ECT a un mínimo de seis posiciones por brazo en cada plano de imagen. Imagine la placa de fundición de 48 pocillos bajo un dispositivo de grabación con una cámara de escaneo de área integrada colocada a una distancia fija equipada con un sensor de imagen monocromo de alta resolución y una fuente de luz casi UV.Realice la detección automatizada de las puntas de los polos que contienen tinte fluorescente para maximizar el contraste. Mida la distancia entre los polos de los registros diarios utilizando un análisis automatizado ejecutando las imágenes grabadas en un software para detectar píxeles brillantes de alto contraste en un fondo oscuro o un programa de procesamiento de imágenes. Retire el ECT de los postes de retención e inserte un gancho de transferencia y un bucle ECT.Luego transfiera el ECT a dos ganchos sujetos al brazo estacionario y al brazo transductor de un riómetro mecánico dinámico extensional equipado con un baño de órgano templado de 37 grados Celsius lleno de PBS. Aplique tensión uniaxial a una velocidad lineal constante ajustando el riómetro a aproximadamente el 1% de la distancia inicial entre los ganchos por segundo. Se puede utilizar una velocidad de estiramiento constante de 0,03 milímetros por segundo con dimensiones ECT típicas.Desgarra la fuerza del transductor e inicia el estiramiento. Mantenga el registro hasta el punto de ruptura de la TEC después de normalizar la fuerza medida por área de sección transversal y trace la curva de tensión-deformación determinando diferentes parámetros biomecánicos. Justo antes de que el tejido comience la microfracturación, el límite superior de la región elástica corresponde al punto de elasticidad y su tensión es una medida de la elasticidad del tejido.La región plástica está entre el punto de rendimiento y el punto de falla. El punto de falla corresponde a una caída repentina en el estrés debido a la ruptura del tejido, definiendo la tensión final que es una medida de la extensibilidad del tejido. El tercer punto de medición corresponde a la fuerza máxima definida por la mayor tensión que el tejido puede soportar sin romperse durante el estiramiento.La resistencia y tenacidad dadas por el área bajo la curva corresponde a la energía absorbida por el tejido hasta el punto de rendimiento y el punto de falla respectivamente. Para cada curva obtenida, la pendiente de la parte lineal de la región elástica corresponde al módulo de Young, también conocido como módulo elástico. Es una propiedad mecánica que mide la rigidez del tejido.Utilizando este protocolo, la compactación y contracción de la TEC en condiciones de control y en presencia de FCS se produjo unas horas después de la fundición y aumentó notablemente hasta el quinto día. Cuando la TEC se trató con el inhibidor de la polimerización de actina Latrunculina A, la compactación de la TEC se redujo según lo indicado por el área de sección transversal significativamente mayor en comparación con el control. La contracción de los tejidos se evaluó durante los cinco días de cultivo.En ausencia de Latrunculina A, la contracción aumentó gradualmente hasta el quinto día alcanzando alrededor del 40% de contracción. Sin embargo, la presencia de Latrunculin A afectó la contracción del tejido, lo que resultó en solo un 20% de contracción máxima. La inhibición de la polimerización de actina condujo a una reducción significativa de aproximadamente el 50% en la rigidez del tejido durante el control.Estos resultados demuestran que la integridad citoesquelética de la actina es esencial para la compactación, contracción y rigidez de la TEC. Es importante seleccionar una solución de colágeno confiable y de alta calidad y asegurarse de que se utilice una suspensión unicelular con alta viabilidad para reconstituir los tejidos conectivos diseñados.

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