Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det tyska hjärtsällskapet (DGK Research Fellowship for GLS) och av den tyska forskningsstiftelsen (DFG genom projektet IRTG 1816 för GLS och AD; DFG 417880571 och DFG TI 956/1-1 för MT; SFB 1002 TP C04 för MT och WHZ; SFB 1002 TP S01 för WHZ; och EXC 2067/1-390729940J för WHZ). WHZ stöds av det tyska federala ministeriet för vetenskap och utbildning (BMBF genom projektet IndiHEART) och Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ och SL stöds av german center for cardiovascular research (DZHK).

Alla åtgärder skall vidtas i en klass II-kåpa som är installerad i laboratorier under inneslutningsnivå 1. Beroende på lokala föreskrifter och typ av manipuleringar som ska utföras, såsom virusmedierad genöverföring, måste inneslutningsnivån höjas till biosäkerhetsnivå 2 eller 3. Alla kulturer hålls vid 37 °C i en cellodlingsinkubator med en fuktad atmosfär på 5 % CO2 i luften. Observera att volymerna (steg 1 och 2) tillhandahålls för en T75-cellodlingskolv. Justera volymerna till olika k...

Det presenterade protokollet beskriver genereringen av ECT från primära mänskliga CF, vilket gör det möjligt att studera den mekaniska effekten av dessa celler på deras extracellulära matrismiljö och vice versa.
Fibroblaster måste utökas för att ge tillräckliga celler för de planerade ECT-experimenten (0,75 x 106 celler/ECT). För bästa reproducerbarhet rekommenderas att förkulturera frysta eller vävnadsbaserade fibroblaster i 2D-monoskiktskultur under en standardise...

Ett stort hinder i studien av fibrotiska sjukdomar är bristen på representativa mänskliga 3D-vävnadsmodeller som ger insikt i fibroblasters beteende och deras patologiska derivat. För att studera fibrotiska processer är standard 2D-odlingssystem suboptimala eftersom isolerade fibroblaster snabbt omvandlas till α-smooth muscle actin (SMA) -uttrycka myofibroblaster när de odlas på icke-kompatibla 2D-substrat1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen återspeglar således inte en regelbunden "hälsosam" vävnad fenotyp3,4,5,6. Kulturer på följsamma substrat har införts för att simulera icke-fibrotiska (10 kPa) och fibrotiska (35 kPa) vävnadsmiljöer7, men dessa saknar den tredje dimensionen, vilket är mycket viktigt med avseende på patofysiologi. Vävnadsteknik ger möjlighet att övervinna denna begränsning genom att tillåta fibroblastkultur i en definierad och experimentellt tunable extracellulär matris (ECM) -sammanhang, till exempel genom förändringar i celluläritet, ECM-sammansättning och ECM-koncentration, som alla kan bestämma vävnadsbiomekaniken.
Olika 3D-modeller har genererats med fibroblaster. Flytande skivor och mikrosfärer var bland de första och visar att kollagen är ombyggt och komprimerat på ett tidsberoende sätt. Fibroblaster utövar dragkrafter på kollagenfibriller, en process som kan underlättas genom tillsats av pro-fibrotiska medel som omvandling av tillväxtfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Fritt flytande kulturer medger dock inte den kontrollerade externa belastningen och utgör därför kontinuerligt krympande eller komprimerande modeller. Arkliknande konstruerade vävnader öppnade möjligheten att studera homeostatisk reglering av biomekaniska egenskaper hos vävnader, nämligen genom uni-, bi-, multiaxial- eller cyklisk stamtestning17,18,19,20. Dessa modeller har använts t.ex. för att visa cellnumrets inverkan på vävnadsstelheten, som visade sig korrelera positivt med cytoskelettintegritet och aktomyosin cytoskeletonkontraktilitet18,19. Det är dock viktigt att notera att omvandlingar från kraft till stam kompliceras av den ojämna vävnadsdeformationen runt klämpunkter för kraftgivare och ankarpunkter. Denna inneboende begränsning kan kringgås av hundben eller ringformade vävnader, vilket ger viss vävnadsövervakning vid ankarpunkter21,22,23. Ringformade vävnader kan beredas genom att distribuera en cell-kollagen hydrogel till ringformade formar. När hydrogelen komprimeras bildas en vävnad runt den okomprimerbara inre stången i formen, vilket ger motstånd för ytterligare vävnadskontraktion24,25,26,27. Efter inledande och typiskt maximal komprimering kan vävnader också överföras till justerbara distanser för att ytterligare begränsa cirkulär ECT vid en definierad vävnadslängd3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiska egenskaper kan bedömas i horisontella eller vertikala belastningsanordningar med lämpliga belastningsceller under enkelriktad eller dynamisk belastning3. Eftersom vävnaderna har en i stort sett enhetlig cirkulär struktur och kan hållas på stänger/krokar (förankringspunkter och/eller kraftgivare), även om dessa fortfarande kan omsluta kompressionsområden runt laststängerna, möjliggör detta format en mer enhetlig belastningsvariation jämfört med fastspänning3. Dessutom framkallar förankrade vävnader en bipolär cellform, och celler anpassar sig till vävnadskrafterna genom förlängning längs kraftlinjer som främjar anisotrop dragkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidigare applicerat ringformad ECT från råtta och mänskliga hjärtfibblaster (CF) runt en enda styv pol i funktionella stress-stamexperiment och utfört vinst och förlust av funktionsstudier med hjälp av viralt transduced fibroblaster24,25,26 och farmakologiska studier37. Vidare skulle vi kunna identifiera könsskillnader i CF-medierad fibros i ECT-modellen27.
Följande protokoll för generering av mänsklig ECT, exemplifierat med primär mänsklig CF som erhållits som kryopreserverad CF från kommersiella leverantörer (se Tabell över material), kombinerar fördelarna med ringformade vävnader med ett enkelt och snabbt sätt att producera makroskopiska vävnader för en 48-väl plattform utformad för parallell testning med högt innehåll.
Viktigt är att ECT-modellen inte är begränsad till en specifik fibroblasttyp, med dokumenterad användning vid undersökning av andra fibroblaster, t.ex. hudfibblaster38,39. Dessutom fungerar fibroblaster från patientens tarmbiopsier lika bra, och valet av fibroblaster beror i slutändan på den vetenskapliga fråga som ska tas upp.
Plattformen som används för generering av ECT som beskrivs i detta protokoll är en kommersiellt tillgänglig 48-brunns 3D-cell/ vävnadsodlingsplatta (figur 1A). Metoderna för beredning, odling och övervakning av ECT-bildning och funktion under en definierad geometri och mekanisk belastning med hjälp av 48-brunnsplattan beskrivs. Den formade ECT hålls av integrerade flexibla poler och den mekaniska belastningen kan finjusteras enligt det slutliga syftet genom att använda poler med olika hårdhet (Shore A-värde 36-89), vilket påverkar deras böjstyvhet. Stolpar med en strand A-värde på 46 rekommenderas. Protokollet är dessutom kompatibelt med en tidigare beskriven anpassad cirkulär form, där ECT hålls runt en enda styv stång37. Dimensionerna på denna form anges i figur 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk representation av gjutformar. A) Teknisk ritning och mått på en gjutform med två flexibla poler. Formen består av en inre omkrets avgränsad av en kort vägg som håller dubbla fäststolpar vid formens huvudkropp. De flexibla polerna har ett fritt horisontellt avstånd till varandra och är anslutna vid basen. Formen möjliggör 180 μL gjutvolym. Brunnen för varje form möjliggör en volymkapacitet på minst 600 μL kulturmedia. Olika materialkompositioner kan användas för att tillverka stolpar med specifika styvheter (t.ex. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk ritning och dimensioner av en ringformad form med en enda styv stång. Detta är en alternativ form med distinkt geometri och mekanisk miljö, som kan användas med ECT-gjutprotokollet37. Den ringformade mögelmonteringsmetoden anpassades från publicerade större format28,41. I korthet omfattar metoden (1) prägling av polytetrafluoretylen (PTFE) gjuter distanser (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikon) hälls i glasfat (diameter 60 mm) och (2) fixering av en PDMS-polhållare (1,5 mm diameter) koncentriskt inuti den formade ihåliga håligheten, som tjänar till (3) hålla en avtagbar pol (4 mm diameter). Det ihåliga rymdresultatet möjliggör 180 μL gjutvolym. Varje glasfat kan comport flera präglade formar (exemplariskt visas med 5 formar) och har kapacitet för upp till 5 ml kulturmedium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Fibroblaster är fenotypiskt mycket dynamiska celler, som snabbt transdifferentierar till myofibroblaster som svar på biokemiska och biomekaniska stimuli. Den nuvarande förståelsen av fibrotiska processer, inklusive hjärtfibros, är fortfarande dålig, vilket hämmar utvecklingen av nya antifibrosbehandlingar. Kontrollerbara och tillförlitliga mänskliga modellsystem är avgörande för en bättre förståelse av fibrospatologi. Detta är ett mycket reproducerbart och skalbart protokoll för att generera konstruerade bindväv (ECT) i en 48-väl gjutningsplatta för att underlätta studier av fibroblaster och patofysiologi av fibrotisk vävnad i en 3-dimensionell (3D) miljö. ECT genereras runt polerna med tunable styvhet, vilket möjliggör studier under en definierad biomekanisk belastning. Under de definierade belastningsförhållandena kan fenotypiska anpassningar som styrs av cellmatrisinteraktioner studeras. Parallell testning är möjlig i 48-brunnsformatet med möjlighet till tidsvägsanalys av flera parametrar, såsom vävnadskomprimering och sammandragning mot belastningen. Från dessa parametrar kan biomekaniska egenskaper som vävnadsstelhet och elasticitet studeras.

ECT når cirka 95 % komprimering jämfört med den ursprungliga cell-kollagenhydrogelvolymen inom de första 24 h. Vävnadskomprimering och sammandragning under kontrollförhållanden och i närvaro av FCS följer några timmar efter gjutning och ökar särskilt fram till dag 5 (figur 5A). Pole avböjning kan öka ytterligare under de följande 15 dagarna (20 dagar var den längsta testade tiden). Storleken på polavböjningen beror på celltyp, celltillstånd och cell- och vävnadsodlingsf?...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Presenteras här är ett protokoll för att generera konstruerade bindväv för en parallell kultur av 48 vävnader i en multi-well plate med dubbla poler, lämplig för mekanistiska studier, sjukdom modellering och screening applikationer. Protokollet är kompatibelt med fibroblaster från olika organ och arter och exemplifieras här med mänskliga primära hjärtfibblaster.

Fibroblast härledd mänsklig konstruerad bindväv för screeningapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Detta protokoll tillåter fibroblast bygga och organisera sin egen miljö under definierade mekaniska förhållanden. Dessa resulterar i anisotropa vävnader med styvhet och matris kompositioner jämförbara med cellens naturliga miljö. Denna metod gör det möjligt att jämföra upp till 48 villkor parallellt.Det är flexibelt med avseende på den använda celltypen och odlingsförhållandena. Genom att endast använda ett fåtal väldefinierade komponenter är det reproducerbart mellan laboratorier. Genom att tillämpa pro-fibrotiska faktorer eller antifibrotiska läkemedel kan detta protokoll användas för att studera de underliggande processerna och terapierna av fibrotiska sjukdomar av något slag.Alisa Degrave, doktorand från vårt laboratorium, och jag själv demonstrerar proceduren. Till att börja med tina de kryobevarade hjärtfibblasterna i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i ungefär två minuter tills injektionsflaskan bara är kvar med en liten mängd is. Överför sedan cellfjädringen droppvis med en serologisk pipett på två milliliter till ett lämpligt sterilt centrifugrör som innehåller 10 ml fibroblasttillväxtmedium.För optimal cellhämtning, skölj kryoflaskan med en milliliter kvinnlig könsstympning och överför den till centrifugröret. Återanvänd cellerna försiktigt och överför till en cellodlingskolv. Fyll på kvinnlig könsstympning varannan dag i fem dagar eller tills cellerna har nått 80% sammanflöde.Efter att ha aspirerat mediet från de odlade cellerna, tvätta celler med sex milliliter PBS och aspirera, tillsätt sedan sex milliliter av cellavskiljningsreagenset till cellerna och inkubera tills cellavlossningen är synlig. Neutralisera enzymatisk aktivitet genom att tillsätta sex till 12 milliliter kvinnlig könsstympning till de rubbade cellerna i cellassociationen reagens. Rör försiktigt upp och ner fyra till åtta gånger med en 10 ml serologisk pipett för att säkerställa en encellig suspension och överför cellerna till ett nytt uppsamlingsrör på 50 milliliter.Kontrollera utbytet med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt tillverkarens instruktioner och pellet ner cellerna. Efter centrifugering, aspirera supernatanten, snärta röret för att lossa pelleten och återanvända cellerna i kvinnlig könsstympning. Därefter spänner cellfjädringen genom en 40 mikrometer mesh cell sil, sedan med hjälp av en automatiserad cellräknare, bedöma cellnummer och livskraft genom elektrisk strömuteslutning för att säkerställa tillförlitliga cellnummer innan du fortsätter med konstruerade bindväv eller ECT-preparat.För att förbereda dig för ECT, justera cell suspensionen till de 8,9 miljoner cellerna per milliliter vid 20 till 25 grader Celsius genom att lägga till kvinnlig könsstympning och hålla cellerna på is. Överför alla andra rör som innehåller de enskilda komponenterna i ECT hydrogelblandningen till is och förkyla ett tomt 50 ml centrifugrör för att förbereda blandningen. Börja förbereda ECT-hydrogelblandningen genom att tillsätta komponenter som beskrivs i texten till det förkylda 50 ml centrifugröret och undvik luftbubblabildning.För det första, pipettera den syralösliga kollagen typ I hydrogel i en serologisk pipett med en bred borrspets. Justera salthalten i kollagenlösningen genom att tillsätta DMEM samtidigt som du försiktigt virvlar röret för korrekt blandning. För att neutralisera pH, tillsätt 0,2 molar natriumhydroxid medan du virvlar röret och bekräftar neutraliseringen genom att observera den röda färgen på fenolröd indikator.Tillsätt sedan cellfjädringen droppvis medan du försiktigt virvlar runt röret. Blanda suspensionen genom att försiktigt röra upp och ner endast en gång med en serologisk pipett med en bred borrspets för att undvika bubbelbildning och minimera skjuvningsstressen. Virvla försiktigt röret 10 gånger för noggrann blandning.Förvara centrifugröret som innehåller ECT hydrogelblandning på is under hela gjutprocessen. Blöt en en milliliter pipettspets i ECT hydrogelblandning, fördela sedan 180 mikroliter hydrogelblandning jämnt i varje form av 48-brunnsgjutningsplattan och undvik överdrivna skjuvkrafter som kan påverka kollagenmatrisenhetens integritet och se till att hela plattan slutar om 15 till 20 minuter. Se till att en komplett slinga bildas i formen eftersom icke-kontinuerlig fördelning av ECT-blandningen förhindrar en fullständig ECT-ringbildning.Undvik pipettering i den inre brunnen och bilda bubblor under pipettering för att säkerställa en enhetlig ECT hydrogelgjutning för homogen och funktionell vävnadsbildning. Placera försiktigt 48-brunnsgjutningsplattan inuti cellodlingsinkubatorn för att rekonstruera ECT hydrogelblandningen i 15 till 30 minuter. Efter inkubation verkar det gelliknande och ogenomskinligt.Tillsätt 600 mikroliter på 37 grader Celsius varm kvinnlig könsstympning per brunn längs väggen försiktigt för att undvika ECT-lossning från botten. Byt ut mediet varje dag med 500 mikroliter kvinnlig könsstympning tills analys. Vid önskade tidpunkter använder du ett stereomikroskop för att spela in mikroskopiska bilder av ECT:s topp- och sidovyer.Använd ett bildbehandlingsprogram för att utföra en linjesökningsanalys. Ställ in en våg och använd det raka linjeverktyget för att spåra och mäta ECT-diametrar till minst sex positioner per arm i varje bildplan. Föreställ dig 48-brunnsgjutningsplattan under en inspelningsenhet med en integrerad områdesskanningskamera placerad på ett fast avstånd utrustat med en högupplöst monokrom bildsensor och en nära UV-ljuskälla.Utför automatisk detektering av polernas spetsar som innehåller fluorescerande färgämne för att maximera kontrasten. Mät avståndet mellan polerna från dagliga poster med hjälp av en automatiserad analys genom att köra de inspelade bilderna på programvara för att upptäcka ljusa pixlar med hög kontrast på en mörk bakgrund eller ett bildbehandlingsprogram. Ta bort ECT från att hålla stolparna och sätt in en överföringskrok och ECT-slinga.Överför sedan ECT till två krokar fastspända på den stationära armen och givarens arm på en förlängnings dynamisk mekanisk riometer utrustad med ett 37 grader Celsius härdat organbad fyllt med PBS. Applicera enaxlig spänning i en konstant linjär hastighet genom att ställa in riometern på cirka 1% av det ursprungliga avståndet mellan krokarna per sekund. En konstant sträckningshastighet på 0,03 millimeter per sekund kan användas med typiska ECT-dimensioner.Riv givarens kraft och initiera sträckan. Fortsätt registrera tills punkten för ECT-bristning efter att ha normaliserat den uppmätta kraften genom tvärsnittsområde och plotta stress-stamkurvan som bestämmer olika biomekaniska parametrar. Strax innan vävnaden börjar mikro spräcka motsvarar den övre gränsen för den elastiska regionen utbytespunkten och dess stam är ett mått på vävnadselasticitet.Plastregionen ligger mellan avkastningspunkten och felpunkten. Felpunkten motsvarar en plötslig minskning av stressen på grund av bristning av vävnaden, vilket definierar den ultimata stammen som är ett mått på vävnadsextensibility. Den tredje mätpunkten motsvarar den maximala styrka som definieras av den högsta stress som vävnaden kan bära utan att bryta under sträckan.Den motståndskraft och seghet som ges av området under kurvan motsvarar den energi som absorberas av vävnaden upp till avkastningspunkten respektive felpunkten. För varje erhållen kurva motsvarar lutningen på den linjära delen av den elastiska regionen Youngs modulus, även känd som elastisk modulus. Det är en mekanisk egenskap som mäter vävnadens styvhet.Med hjälp av detta protokoll följde ECT-komprimering och sammandragning under kontrollförhållanden och i närvaro av FCS några timmar efter gjutning och ökade särskilt upp till dag fem. När ECT behandlades med aktinpolymerisationshämmaren Latrunculin A minskade ECT-komprimeringen enligt det betydligt högre tvärsnittsområdet jämfört med kontroll. Sammandragningen av vävnaderna bedömdes under de fem dagarna av kultur.I avsaknad av Latrunculin A ökade minskningen gradvis upp till dag fem och nådde cirka 40%-kontraktion. Latrunculin En närvaro påverkade dock vävnadskontraktionen vilket resulterade i endast ca 20% maximal sammandragning. Aktinpolymeriseringshämning ledde till en signifikant minskning av vävnadsstelheten med cirka 50% över kontrollen.Dessa resultat visar att aktin cytoskeletal integritet är avgörande för ECT komprimering, sammandragning och förstyvning. Det är viktigt att välja en pålitlig, högkvalitativ kollagenlösning och se till att en encellig suspension med hög livskraft används för att rekonstruera konstruerade bindväv.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokoll för relativ Hydrodynamisk Bedömning av Tri-broschyr Polymer Ventiler

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching plattform för tillämpningar inom cell-och vävnads mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Utbyggnad av mänskliga Främre korsband-härledda celler för Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

tillämpningar av<em&gt; In Vivo</em&gt; Provning av Rat tibialis anterior för utvärdering vävnadstekniska skelettmuskulatur Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Specialkonstruerade vävnadsodling formar från lasergraverade Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Två metoder för Decellularization av växt vävnader för Tissue Engineering program

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer för öppen källkod Microplate-kompatibla belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Vävnadskonstruerad transplantat för circumferential esofagial rekonstruktion hos råttor

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...