Name: fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Bu çalışma Alman Kardiyak Derneği (GLS için DGK Araştırma Bursu) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG tarafından GLS ve AD için IRTG 1816 projesi aracılığıyla desteklenmiştir; MT için DFG 417880571 ve DFG TI 956/1-1; MT ve WHZ için SFB 1002 TP C04; WHZ için SFB 1002 TP S01; ve WHZ için EXC 2067/1-390729940J). WHZ, IndiHEART projesi aracılığıyla Alman Federal Bilim ve Eğitim Bakanlığı (BMBF) ve Fondation Leducq (20CVD04) tarafından desteklenmektedir. MT, WHZ ve SL, Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi (DZHK) tarafından desteklenmektedir.

Tüm adımlar, muhafaza seviyesi 1 altındaki laboratuvarlara monte edilen Sınıf II biyogüvenlik davlumbazlarında yapılmalıdır. Viral aracılı gen transferi gibi yerel düzenlemelere ve yapılacak manipülasyonların türüne bağlı olarak, muhafaza seviyesi biyogüvenlik seviyesi 2 veya 3'e yükseltilmelidir. Tüm kültürler 37 °C'de havada % 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfere sahip bir hücre kültürü inkübatörde tutulur. Birimlerin (Adım 1 ve 2) bir T75 hücre kültürü şişesi için sağland...

Sunulan protokol, bu hücrelerin hücre dışı matris ortamları üzerindeki mekanik etkisinin incelenmesine izin veren birincil insan CF'sinden EKT'nin üretilmesini açıklar.
Planlanan EKT deneyleri (0,75 x 106 hücre/EKT) için yeterli hücre elde etmek için fibroblastların genişletilmesi gerekir. En iyi tekrarlanabilirlik için, 2D monolayer kültüründe kültür öncesi dondurulmuş veya dokudan türetilmiş fibroblastların, her pasajda % 80'e kadar standartlaştırılm?...

Fibrotik hastalıkların incelenmesinde önemli bir engel, fibroblastların davranışları ve patolojik türevleri hakkında fikir veren temsili insan 3D doku modellerinin olmamasıdır. Fibrotik süreçleri incelemek için, standart 2D kültür sistemleri alt optimaldir, çünkü izole fibroblastlar, uyumlu olmayan 2D substratlarda kültürlendiğinde α düz kas aktinine (SMA) hızla transdifferentiate olurlar1,2,3. Bu nedenle, standart 2D kültüründeki fibroblastlar düzenli bir "sağlıklı" doku fenotipini yansıtmaz3,4,5,6. Fibrotik olmayan (10 kPa) ve fibrotik (35 kPa) doku ortamlarını simüle etmek için esnek substratlardaki kültürler tanıtılmıştır7, ancak bunlar patofizyoloji açısından çok önemli olan üçüncü boyuttan yoksundur. Doku mühendisliği, fibroblast kültürüne tanımlanmış ve deneysel olarak tonlanabilir hücre dışı matris (ECM) bağlamında, örneğin hücresellik, ECM bileşimi ve ECM konsantrasyonundaki değişikliklerle izin vererek bu sınırlamanın üstesinden gelme fırsatı sağlar, bunların hepsi doku biyomekaniğini belirleyebilir.
Fibroblastlar kullanılarak çeşitli 3D modeller üretilmiştir. Yüzen diskler ve mikroküreler ilkler arasındaydı ve kolajenin zamana bağlı bir şekilde yeniden şekillendirildiğini ve sıkıştırıldığını gösteriyor. Fibroblastlar kollajen fibriller üzerinde çekiş kuvvetleri uygular, büyüme faktörü-beta 1 (TGF-β1) gibi pro-fibrotik ajanların eklenmesiyle kolaylaştırılabilir bir süreçtir.8,9,10,11,12,13,14,15,16. Bununla birlikte, serbestçe yüzen kültürler kontrollü dış yüklemeye izin vermez ve bu nedenle sürekli küçülen veya sıkıştırıcı modeller oluşturur. Levha benzeri mühendislik dokuları, dokuların biyomekanik özelliklerinin homeostatik düzenlemesini, yani uni, bi, multiaksiyel veya döngüsel suş testi yoluyla inceleme imkanını açtı.17,18,19,20. Bu modeller, örneğin, hücre sayısının doku sertliği üzerindeki etkisini göstermek için kullanılmıştır, bu da sitoskeleton bütünlüğü ve aktomiyosin sitoskeleton kontrtilitesi ile pozitif olarak ilişkili bulunmuştur.18,19. Bununla birlikte, gerinim kuvveti dönüşümlerinin, kuvvet dönüştürücülerinin ve çapa noktalarının kelepçe noktalarının etrafındaki homojen olmayan doku deformasyonu ile karmaşık olduğunu belirtmek önemlidir. Bu doğal sınırlama, köpek kemiği veya halka şeklindeki dokular tarafından atlanabilir ve çapa noktalarında bazı doku uygulamaları sunar21,22,23. Halka şeklindeki dokular, hücre-kollajen hidrojelleri halka şeklindeki kalıplara dağıtılarak hazırlanabilir. Hidrojel sıkıştırırken, kalıbın sıkıştırılamaz iç çubuğunun etrafında bir doku oluşur ve bu da daha fazla doku kasılması için direnç sunar.24,25,26,27. İlk ve tipik olarak maksimum sıkıştırmadan sonra, dokular tanımlanmış bir doku uzunluğunda dairesel EKT'yi daha fazla kısıtlamak için ayarlanabilir aralayıcılara da aktarılabilir3,24,25,26,27,28,29,30. Biyofiziksel özellikler, tek yönlü veya dinamik gerinim altında uygun yük hücrelerine sahip standart yatay veya dikey gerinim gerinim cihazlarında değerlendirilebilir3. Dokular büyük ölçüde düzgün dairesel bir yapıya sahip olduğu ve çubuklar / kancalar (ankraj noktaları ve / veya kuvvet dönüştürücüleri) üzerinde tutulabildiğinden, bunlar hala yükleme çubuklarının etrafındaki sıkıştırma alanlarını kaplayabilir, ancak bu format sıkıştırmaya kıyasla daha düzgün bir gerinim varyasyonu sağlar.3. Ayrıca, bağlantılı dokular bipolar hücre şekli ortaya çıkarır ve hücreler anisotropik çekişi teşvik eden kuvvet çizgileri boyunca uzayarak doku kuvvetlerine uyum sağlar.31,32,33,34,35,36. Daha önce fonksiyonel stres-suş deneylerinde tek bir sert kutbun etrafına sıçan ve insan kardiyak fibroblastlarından (CF) halka şeklinde EKT uyguladık ve viral olarak transdüklenmiş fibroblastlar kullanarak fonksiyon çalışmaları kazandır ve kaybettik.24,25,26 ve farmakolojik çalışmalar37. Ayrıca, ECT modelinde CF aracılı fibroziste cinsiyet farklılıklarını belirleyebiliriz.27.
Ticari satıcılardan kriyoprezer korunmuş CF olarak elde edilen birincil insan CF'si ile örneklendirilen insan EKT'nin üretimi için aşağıdaki protokol (bkz. Malzeme Tablosu), halka şeklindeki dokuların avantajlarını paralel yüksek içerikli testler için tasarlanmış 48 kuyulu bir platform için makroskopik dokular üretmenin kolay ve hızlı bir yolu ile birleştirir.
Daha da önemlisi, EKT modeli belirli bir fibroblast tipi ile sınırlı değildir, örneğin cilt fibroblastları38,39 gibi diğer fibroblastların araştırılmasında belgelenmiş kullanım ile. Ayrıca, hastanın biyopsilerinden elde edilen fibroblastlar eşit derecede iyi çalışır ve fibroblast seçimi sonuçta ele alınacak bilimsel soruya bağlıdır.
Bu protokolde açıklanan ECT üretimi için kullanılan platform, piyasada bulunan 48 kuyulu 3D hücre/doku kültürü plakasıdır (Şekil 1A). 48 kuyu plakası yardımıyla tanımlanmış bir geometri ve mekanik yük altında AİHM oluşumu ve işlevinin hazırlanması, kültlenmesi ve izlenmesi yöntemleri açıklanmıştır. Oluşan EKT entegre esnek kutuplar tarafından tutulur ve mekanik yük, bükme sertliklerini etkileyen farklı sertliğe sahip kutuplar (Shore A değeri 36-89) kullanılarak nihai amaca göre ince ayar yapılabilir. Kıyı A değeri 46 olan kutuplar önerilir. Protokol ayrıca, AİHM'nin tek bir sert çubuk etrafında tutulduğu daha önce tanımlanmış özel dairesel bir kalıpla uyumludur37. Bu kalıbın boyutları Şekil 1B'de verilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Şekil 1: Döküm kalıplarının şematik gösterimi. (A) İki esnek kutuplu döküm kalıbın teknik çizimi ve boyutları. Kalıp, kalıbın ana gövdesinde çift istinat direkleri tutan kısa bir duvarla sınırlandırılmış bir iç çevreden oluşur. Esnek direkler birbirine serbest yatay mesafeye sahiptir ve tabana bağlanır. Kalıp 180 μL döküm hacmine izin verir. Her kalıbın kuyusu, en az 600 μL kültür ortamı hacim kapasitesi sağlar. Farklı malzeme bileşimleri, belirli sertliklere sahip kutuplar üretmek için kullanılabilir (örneğin, TM5MED-TM9MED). (B) Tek bir sert çubuklu halka şeklindeki kalıbın teknik çizimi ve boyutları. Bu, AİHM döküm protokolü37 ile kullanılabilen farklı geometriye ve mekanik ortama sahip alternatif bir kalıptır. Halka şeklindeki kalıp montaj yöntemi yayınlanan daha büyük formatlardan uyarlanmıştır28,41. Kısacası, yöntem (1) polidimetilsiloksan (PDMS), silikon) cam tabaklara dökülür (çapı 60 mm) ve (2) bir PDMS kutup tutucusunu (1,5 mm çapında) oluşan içi boş boşluğun içine merkezi olarak sabitlemek, bu da (3) çıkarılabilir bir direği (4 mm çapında silikon tüp) tutmaya yarar. İçi boş alan sonucu 180 μL döküm hacmi sağlar. Her cam tabak birden fazla baskılı kalıbı (örnek olarak 5 kalıpla gösterilmiştir) komporte edebilir ve 5 mL'ye kadar kültür ortamı kapasitesine sahiptir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

Fibroblastlar fenotipik olarak son derece dinamik hücrelerdir ve biyokimyasal ve biyomekanik uyaranlara yanıt olarak hızla miyofibroblastlara transdifferentiate. Kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere fibrotik süreçlerin mevcut anlayışı zayıf kalır ve bu da yeni anti-fibrotik tedavilerin gelişimini engeller. Kontrol edilebilir ve güvenilir insan modeli sistemleri fibrozis patolojisinin daha iyi anlaşılması için çok önemlidir. Bu, fibroblastların ve fibrotik dokunun patofizyolojisinin 3 boyutlu (3D) bir ortamda çalışmalarını kolaylaştırmak için 48 kuyulu bir döküm plakasında mühendislik bağ dokuları (EKT) oluşturmak için son derece tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir protokoldür. EKT, kutupların etrafında ayarlanabilir sertlik ile üretilir ve tanımlanmış bir biyomekanik yük altında çalışmalara izin verir. Tanımlanan yükleme koşullarında hücre-matris etkileşimleri ile kontrol edilen fenotipik adaptasyonlar incelenebilir. Paralel test, doku sıkıştırma ve yüke karşı kasılma gibi birden fazla parametrenin zaman dilimi analizi fırsatı ile 48 kuyu formatında uygulanabilir. Bu parametrelerden doku sertliği ve elastikiyet gibi biyomekanik özellikler incelenebilir.

ECT, ilk 24 saat içindeki ilk hücre kollajen hidrojel hacmine kıyasla yaklaşık% 95 sıkıştırmaya ulaşır. Kontrol koşulları altında ve FCS varlığında doku sıkışması ve kasılması dökümden birkaç saat sonra ortaya çıkar ve özellikle 5. güne kadar artar (Şekil 5A). Kutup sapması takip eden 15 gün boyunca daha da artabilir (20 gün test edilen en uzun süreydi). Kutup saptırma büyüklüğü hücre tipine, hücre durumuna ve hücre ve doku kültürü koşullarına...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Bu protokol, fibroblast'ın tanımlanmış mekanik koşullar altında kendi ortamlarını inşa etmelerini ve düzenlemelerini sağlar. Bunlar, hücrenin doğal ortamıyla karşılaştırılabilir sertlik ve matris bileşimlerine sahip anizotropik dokularla sonuçlanır. Bu yöntem, paralel olarak 48'e kadar koşulu karşılaştırmaya izin verir.Kullanılan hücre tipi ve kültür koşullarına göre esnektir. Sadece birkaç iyi tanımlanmış bileşen kullanılarak laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir. Pro-fibrotik faktörler veya antifibrotik ilaçlar uygulanarak, bu protokol her türlü fibrotik hastalıkların alttaki süreçlerini ve tedavilerini incelemek için kullanılabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Alisa Degrave ve ben olacağım. Başlangıç olarak, kriyo ile korunmuş kardiyak fibroblastları 37 santigrat derecede bir su banyosunda, şişe sadece az miktarda buzla kalana kadar yaklaşık iki dakika çözün. Daha sonra, hücre süspansiyonunun iki mililitre serolojik pipet kullanarak damla yönünde 10 mililitre fibroblast büyüme ortamı içeren uygun bir steril santrifüj tüpüne aktarın.En uygun hücre alımı için kriyo şişesini bir mililitre FGM ile durulayın ve santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri yavaşça yeniden biriktirin ve bir hücre kültürü şişesine aktarın. FGM'i beş gün boyunca veya hücreler% 80 izdiah edene kadar her gün yenile.Ortamı kültürlü hücrelerden aldıktan sonra, hücreleri altı mililitre PBS ile yıkayın ve aspirat edin, ardından hücrelere altı mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve hücre müfrezesi görünene kadar kuluçkaya yatırın. Hücre ilişkisi reaktifinde yerinden çıkan hücrelere altı ila 12 mililitre FGM ekleyerek enzymatic aktiviteyi nötralize edin. Tek hücreli süspansiyon sağlamak ve hücreleri taze bir 50 mililitre toplama tüpüne aktarmak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak dört ila sekiz kez yavaşça pipet.Üreticinin talimatlarına göre otomatik bir hücre sayacı yardımıyla verimi doğrulayın ve hücreleri aşağı doğrulayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin, peletin yerinden çıkarmak ve FGM'deki hücreleri yeniden canlandırmak için tüpü hareket ettirİn. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikrometre örgü hücre süzgecinden geçirin, ardından otomatik bir hücre sayacı kullanarak, tasarlanmış bağ dokuları veya EKT hazırlığına devam etmeden önce güvenilir hücre numaraları sağlamak için hücre sayısını ve canlılığı elektrik akımı dışlama ile değerlendirin.EKT'ye hazırlanmak için, hücre süspansiyonu FGM ekleyerek mililitre başına 20 ila 25 santigrat derecede 8,9 milyon hücreye ayarlayın ve hücreleri buzda tutun. ECT hidrojel karışımının bireysel bileşenlerini içeren diğer tüm tüpleri buza aktarın ve karışımı hazırlamak için boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü önceden soğutun. Hava kabarcığı oluşumunu önleyen önceden soğutulmuş 50 mililitre santrifüj tüpüne metinde açıklanan bileşenleri ekleyerek ECT hidrojel karışımını hazırlamaya başlayın.İlk olarak, pipet asit çözünür kollajen tipi I hidrojel geniş bir delik ucu ile serolojik bir pipet içine. Uygun karıştırma için tüpü hafifçe döndürürken DMEM'i ekleyerek kollajen çözeltisinin tuz içeriğini ayarlayın. pH'ı nötralize etmek için, tüpü döndürürken 0,2 molar sodyum hidroksit ekleyin ve fenol kırmızı göstergesinin kırmızı rengini gözlemleyerek nötralizasyonunu onaylayın.Daha sonra tüpü hafifçe döndürürken hücre süspansiyonu damla yönünde ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek ve kesme stresini en aza indirmek için geniş delikli bir uçlu serolojik pipet kullanarak süspansiyonu sadece bir kez hafifçe yukarı ve aşağı borula karıştırın. Kapsamlı karıştırma için tüpü 10 kez hafifçe döndürün.ECT hidrojel karışımı içeren santrifüj tüpünü döküm işlemi boyunca buz üzerinde tutun. ECT hidrojel karışımında bir mililitre pipet ucu ıslatın, ardından 48 kuyulu döküm plakasının her kalıbına eşit olarak 180 mikrolitre hidrojel karışımı dağıtın, kollajen matris tertibatının bütünlüğünü etkileyebilecek aşırı kesme kuvvetlerini önleyin ve tüm plakanın 15 ila 20 dakika içinde bitmesini sağlayın. ECT karışımının süreksiz dağılımı tam bir ECT halkası oluşumunu önleyeceğinden, kalıp içinde tam bir döngü oluşmasını sağlayın.Homojen ve fonksiyonel doku oluşumu için düzgün bir ECT hidrojel dökümü sağlamak için iç kuyuya pipetlemekten ve pipetleme sırasında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. ECT hidrojel karışımını 15 ila 30 dakika yeniden inşa etmek için 48 kuyulu döküm plakasını hücre kültürü inkübatörünün içine dikkatlice yerleştirin. Kuluçkadan sonra jel benzeri ve opak görünür.AİHM'nin alttan kopmasını önlemek için duvar boyunca yavaşça duvar boyunca 37 santigrat derecelik 600 mikrolitre sıcak FGM ekleyin. Analize kadar ortamı her gün 500 mikrolitre FGM ile değiştirin. İstenilen zaman noktalarında, AİHM'nin üst ve yan görünümlerinin mikroskobik görüntülerini kaydetmek için bir stereo mikroskop kullanın.Hat tarama çözümlemesi gerçekleştirmek için görüntü işleme programı kullanın. Bir ölçek ayarlayın ve her görüntüleme düzleminde kol başına en az altı konumdaKI EKT çaplarını izlemek ve ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Yüksek çözünürlüklü tek renkli görüntü sensörü ve UV'ye yakın ışık kaynağı ile donatılmış sabit bir mesafeye yerleştirilmiş entegre alan tarama kamerasına sahip bir kayıt cihazının altındaki 48 kuyu döküm plakasını görüntüleyin.Kontrastı en üst düzeye çıkarmak için floresan boya içeren kutup uçlarının otomatik algılamasını gerçekleştirin. Karanlık bir arka plan veya görüntü işleme programında yüksek kontrastlı parlak pikselleri algılamak için kaydedilen görüntüleri yazılımda çalıştırarak otomatik bir analiz kullanarak kutuplar arasındaki günlük kayıtlardan uzaklığı ölçün. ECT'yi tutma direklerinden çıkarın ve bir aktarma kancası ve EKT döngüsü takın.Daha sonra ECT'yi sabit kola ve PBS ile dolu 37 santigrat derece temperli organ banyosu ile donatılmış uzatmalı dinamik mekanik riometrenin dönüştürücü koluna kenetlenmiş iki kancaya aktarın. Riometreyi kancalar arasındaki başlangıç mesafesinin yaklaşık %1'ine ayarlayarak sabit doğrusal hızda tek eksenli gerilim uygulayın. Tipik EKT boyutlarıyla saniyede 0,03 milimetre sabit bir esneme hızı kullanılabilir.Dönüştürücünün kuvvetini yırtın ve esnemeyi başlatın. Ölçülen kuvveti kesitsel alanla normalleştirdikten sonra EKT yırtılma noktasına kadar kayıt yapmaya devam edin ve farklı biyomekanik parametreleri belirleyen stres-gerinim eğrisini çizin. Doku mikro kırılmaya başlamadan hemen önce, elastik bölgenin üst sınırı verim noktasına karşılık gelir ve suşu doku elastikiyetinin bir ölçüsüdür.Plastik bölge verim noktası ile arıza noktası arasındadır. Başarısızlık noktası, dokunun yırtılmasına bağlı streste ani bir düşüşe karşılık gelir ve doku genişletilebilirliğinin bir ölçüsü olan nihai suşu tanımlar. Üçüncü ölçüm noktası, dokunun esneme sırasında kırılmadan taşıyabileceği en yüksek stresle tanımlanan maksimum güce karşılık gelir.Eğrinin altındaki alanın verdiği esneklik ve tokluk, doku tarafından emilen enerjiye sırasıyla verim noktasına ve başarısızlık noktasına kadar karşılık gelir. Elde edilen her eğri için, elastik bölgenin doğrusal kısmının eğimi, Young'un elastik modül olarak da bilinen modülüne karşılık gelir. Dokunun sertliğini ölçen mekanik bir özelliktir.Bu protokol kullanılarak, kontrol koşulları altında ve FCS varlığında ECT sıkıştırma ve daralma dökümden birkaç saat sonra ortaya çıktı ve özellikle beşinci güne kadar arttı. ECT, aktin polimerizasyon inhibitörü Latrunculin A ile tedavi edildiğinde, ECT sıkıştırması kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek kesit alanı tarafından belirtildiği gibi azaltıldı. Dokuların kasılması beş günlük kültür boyunca değerlendirildi.Latrunculin A'nın yokluğunda, kasılma yavaş yavaş beşinci güne kadar artarak yaklaşık% 40 daralmaya ulaştı. Bununla birlikte, Latrunculin Bir varlığı doku kasılmasını etkiledi ve sadece% 20 maksimum kasılma ile sonuçlandı. Aksin polimerizasyon inhibisyonu, kontrol üzerindeki doku sertliğinde yaklaşık% 50'lik önemli bir azalmaya yol açtı.Bu sonuçlar, aktin sitoskeletal bütünlüğünün ECT sıkıştırma, kasılma ve sertleşme için gerekli olduğunu göstermektedir. Güvenilir, yüksek kaliteli bir kolajen çözeltisi seçmek ve mühendislik konvektif dokuları yeniden inşa etmek için yüksek canlılığa sahip tek hücreli bir süspansiyon kullanılmasını sağlamak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Tri-broşür Polimer Vanalar göreceli hidrodinamik Değerlendirme Protokolü

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em&gt; In vitro</em&gt; Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...