Name: humanized mediator release assay as a read-out for allergen potency
Uploaded: 2021-06-29T15:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور الدكتور ستيفان فيثس من قسم علم الأمراض الجزيئية، معهد بول إيرليش، لانغن، ألمانيا، على توفير خلايا RBL المؤنثة/FcεRI-transfected وعلى موافقته على كتابة ورقة منهجية البحث هذه. نود أن نشكر الأستاذة الدكتورة فاطمة فيريرا على تقديمها تعليقات ممتازة. كما نود أن نشكر البروفيسور الدكتور رونالد فان ري والدكتور جاب أكرداس من قسم المناعة التجريبية، المراكز الطبية بجامعة أمستردام، موقع AMC، أمستردام، هولندا، لإعطاء موافقتهم على نشر البيانات التمثيلية المقدمة في هذه الورقة الأساليب، والتي تم إنشاؤها في سياق المشروع BM4SIT - الابتكارات للحساسية (www.BM4SIT.eu). وقد تم دعم عمل المؤلفين من قبل صندوق العلوم النمساوي (المشروع P32189)، من قبل جامعة سالزبورغ الأولوية برنامج الحساسية والسرطان BioNano مركز البحوث، وبرنامج الدكتوراه الحصانة في السرطان والحساسية-ICA بتمويل من صندوق العلوم النمساوي (FWF W01213)، ومشروع BM4SIT (رقم المنحة 601763) من الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع FP7.

تم الحصول على موافقة أخلاقية لاستخدام سيرا المستمدة من مرضى حساسية حبوب اللقاح البتولا من اللجنة الأخلاقية الهولندية (رقم الموافقة: NL65758.018.18).
1. إجراءات السلامة
<ol><li>العمل في ظل ظروف معقمة باستخدام منضدة عمل من الفئة 2 للسلامة البيولوجية خلال اليوم الأول من التجربة (مستوى السلامة البيولوجية 2). اتبع إرشادات السلامة للمؤسسة لاستخدام المصل البشري.</li>
</ol>2. تكملة تعطيل سيرا الإنسان
<ol><li>حصاد ثقافة كثيفة من الخلايا P3X63Ag8.653 (يطلق عليها خلايا Ag8 من الآن فصاعدا)، من قارورة ثقافة الخلية ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي.<ol>
<li>استخدام وسيط الثقافة التالية لهذه الخلايا: تعديل النسور الحد الأدنى المتوسط الأساسية مع انخفاض تركيز المصل, 1٪ البنسلين-Streptomycin (100 وحدة القلم., 0.1 ملغ/مل ستريب.), 5٪ العجل الجنيني المعطل للحرارة / مصل البقر (FCSi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>خلايا Ag8 الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 × ز في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعادة تعليق بيليه الخلية إلى تركيز نهائي من حوالي 1 × 106 خلايا / مل في المتوسط huRBL (الحد الأدنى النسر المتوسط الأساسية مع تعديل ألفا، 4 MM L-الجلوتامين، 5٪ FCSi، 1٪ G418 (100٪ الأسهم: 10 غرام/125 مل DH2O). ملاحظة: الحفاظ على خلايا Ag8 عن طريق تمرير للاستخدام في المستقبل كذلك.</li>
	<li>تمييع الإنسان سيرا 1:10 في تعليق الخلية Ag8. تخفيف المصل النهائي في المقايسة سيكون 1:20. ملاحظة: بالنسبة إلى سيرا ذات ال IIGE منخفضة التحديد، يمكن استخدام 1:5 (1:10 تخفيف نهائي).</li>
	<li>حضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ -7٪ CO2.</li>
</ol>3. حصاد وبذر خلايا huRBL
<ol><li>يستنشق الوسط من قارورة ثقافة الخلية T-75 بعناية دون لمس خلايا huRBL (خلايا huRBL متمسكة). تأكد من أن الخلايا هي حوالي 50٪ -90٪ التقاء. ملاحظة: اعتمادا على التقاء الخلية، محتوى الخلية من قارورة ثقافة الخلية T-75 كثيفة عادة ما تكون كافية لواحد إلى اثنين من لوحات 96-جيدا.</li>
	<li>اغسل الخلايا مرتين بإضافة 10 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (DPBS). إضافة DPBS إلى الجانب الآخر من القارورة وليس مباشرة على الخلايا.</li>
	<li>أسبيرات DPBS وإضافة 5 مل من 1x تريبسين-EDTA قبل الحارة (0.05٪/0.02٪ EDTA المخفف في DPBS) مفرزة الخلية.</li>
	<li>احتضان قارورة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>فصل الخلايا عن طريق النقر بعناية على القارورة.</li>
	<li>نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وملء مع هوربل المتوسطة أو DPBS لتمييع تريبسين-EDTA.</li>
	<li>الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أسبيرات supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من huRBL المتوسطة لعد الخلايا.</li>
	<li>عد الخلايا وتمييعها في المتوسط huRBL للحصول على تركيز نهائي من 2 × 106 خلايا / مل.</li>
	<li>استخدم لوحة معقمة من 96 بئرا وأضف 50 ميكرولتر من تعليق خلية huRBL لكل بئر ، وهو ما يعادل 1 × 105 خلايا / جيدا.</li>
</ol>4. التوعية السلبية للخلايا huRBL
<ol><li>الطرد المركزي تعليق Ag8/serum المحتضن مسبقا لمدة 5 دقائق عند 250 × ز.</li>
	<li>نقل 50 ميكرولتر من تعليق Ag8/serum الطرد المركزي إلى كل بئر تحتوي على خلايا huRBL دون إزعاج بيليه الخلية Ag8.<ol>
<li>وتشمل أي عنصر تحكم مستضد، والتي يتم توعيتها، ولكن الخلايا غير المحفزة (لا تضيف مستضد)، بمثابة مؤشر لهضبة إشارة أسفل / الخلفية. الخلفية والحد الأقصى للتحلل السيطرة الآبار لا تحتاج إلى توعية مع المصل. إضافة 50 ميكرولتر من المتوسط huRBL للسيطرة على الآبار بدلا من ذلك.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغطية لوحة مع غطاء واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ -7٪ CO2.</li>
</ol>5. التحلل المستضد وإطلاق سراح الوسيط
<ol><li>إعداد تخفيف مستضد في العازلة 1x التيرود (9.5 غرام / لتر أملاح التيرود، 0.1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)، 0.5 غرام / لتر كربونات الهيدروجين الصوديوم (NaHCO3) في DH2O) مقدما. وهناك حاجة إلى مبلغ نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل بئر. ملاحظة: ليس كل مسببات الحساسية، سواء تنقيتها من المصادر الطبيعية أو المنتجة بشكل مؤتلف، قد تكون مستقرة في العازلة 1x تايرود. لذلك، إجراء اختبارات الاستقرار في المخزن المؤقت 1x التيرود قبل إجراء الفحص. بدلا من ذلك، تمييع العازلة 1x التيرود في أكسيد الديوتريوم (D 2 O) لزيادةنسبةالإشارة إلى الضوضاء من المقايسة.</li>
	<li>جعل 8 التخفيفات من مستضد الفائدة من سلسلة تخفيف 1:10 في أنابيب رد الفعل بدءا إما 10 أو 1 ميكروغرام / مل من البروتين. ملاحظة: دائما اختبار سلسلة التخفيف مسبقا. بدلا من ذلك، قم بتكييف سلسلة التخفيف 1:10 (على سبيل المثال، 1:5، 1:20، أو 1:30) من أجل تغطية منحنى الإصدار الكامل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يختلف تركيز البداية اعتمادا على الإعداد التجريبي.</li>
	<li>لغسل خلايا huRBL مطلية على لوحة 96 جيدا، وإزالة المتوسط الخلية التي تحتوي على سيرا أولا عن طريق التجسس بعناية، عكس، والتنصت على لوحة على الورق الماصة.</li>
	<li>غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من العازلة 1x التيرودس في بئر. تعامل مع جميع الآبار بالمثل. ملاحظة: أضف محلول الغسيل ببطء إلى الخلايا حتى لا تزعجها.</li>
	<li>اتركه لمدة 30 ث تقريبا وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات في المجموع.</li>
	<li>بعد إضافة محلول الغسيل للمرة الأخيرة، اترك الحل في الآبار حتى يصبح جاهزا للاستمرار في إضافة تمييع المستضد. ملاحظة: تجنب تعريض الخلايا للهواء لفترة طويلة جدا.</li>
	<li>نقل 100 ميكرولتر من محلول مستضد لكل بئر تحتوي على خلايا huRBL الحساسة مسبقا. ملاحظة: إذا تحليل عدة معلمات مختلفة، نقل عينات فردية من سلسلة التخفيف إلى لوحة إضافية غير ملزمة 96-جيدا (استخدام نفس التخطيط كما هو الحال على لوحة huRBL) ونقلها بعد ذلك مع ماصة متعددة القنوات مباشرة على لوحة الخلية huRBL. وبهذه الطريقة، يمكن تجنب تعريض الخلايا للهواء لفترة طويلة جدا، مما قد يؤدي إلى ضعف أداء الفحص (إشارة أقل/بدون إشارة).</li>
	<li>تغطية آبار التحكم (أقصى قدر من التحلل والخلايا الخلفية غير الحساسة) مع 100 ميكرولتر من العازلة 1x التيرود. لا تحفز هذه الآبار السيطرة مع مستضد.<ol>
<li>بالإضافة إلى ذلك، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1x التيرود إلى الآبار الحساسة لا مستضد من سلسلة التخفيف، والتي هي ضرورية لاتخاذ إطلاق عفوية مستضد مستقلة من الخلايا الحساسة في الاعتبار أثناء تحليل البيانات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>احتضان خلايا huRBL لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ -7٪ CO2.</li>
</ol>6. قياس الفلورسينس لنشاط β-هيكسوسامينيديز
<ol><li>علاج الآبار من الحد الأقصى للسيطرة تحلل مع 10 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 لكل بئر وتخلط بشكل صحيح من أجل تحلل الخلايا تماما والحصول على الإفراج 100٪ من β هيكسوسامينيديز.</li>
	<li>إضافة 50 ميكرولتر من محلول الركيزة في لوحة جديدة غير ملزمة 96 جيدا. حل الركيزة للوحة واحدة 96 جيدا: 5 مل من 0.1 M المقايسة الستريك العازلة، pH 4.5؛ و 80 ميكرولتر من 10 م 4-ميثيلومبيفيريل N-أسيتيل-β-D-الجلوكوزامينيد.</li>
	<li>نقل 50 ميكرولتر من الخلايا الفائقة من جميع الآبار إلى لوحة جديدة تحتوي على محلول الركيزة. ملاحظة: ماصة فائقة بعناية قبالة لوحة huRBL من أجل عدم تعطيل خلايا huRBL.</li>
	<li>احتضان لوحة مع محلول الركيزة وخلايا فائقة ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية للسماح بتحويل الركيزة الفلورية. ملاحظة: احتفظ بلوحة huRBL لإجراء فحص قابلية البقاء للخلية.</li>
	<li>إضافة 100 ميكرولتر من محلول التوقف (15 غرام / لتر غليسين، 11.7 غرام / لتر NaCl حل في DH2O، درجة الحموضة 10.7) في بئر.</li>
	<li>قياس الفلورسينس في 360 نانومتر الإثارة و 465 نانومتر الانبعاثات باستخدام قارئ لوحة.</li>
</ol>7. تحليل البيانات
<ol><li>لإجراء الحسابات الأساسية لإصدار النسبة المئوية، استخدم أي برنامج جداول بيانات.</li>
	<li>بالنسبة لإزالة الطرح/خط الأساس في الخلفية، قم بطرح متوسط الآبار الخلفية من جميع الآبار الأخرى.</li>
	<li>حساب متوسط الآبار تحلل الحد الأقصى والبيانات الصريحة لسلسلة التخفيف في النسبة المئوية. بهذه الطريقة يمكن للمرء أن يعبر عن البيانات كنسبة مئوية من إطلاق الخلايا تطبيع إلى الحد الأقصى لإطلاق الانزيم الناجم عن تحلل الخلية.</li>
	<li>تمثل منحنيات إطلاق وسيط الاستجابة الكاملة للجرعة بشكل أفضل كرسم بياني XY مع تركيز المستضد على سجل على المحور X والنسبة المئوية لإطلاق الوسيط على محور Y.</li>
	<li>إضافة قيم عنصر التحكم بدون مستضد كخط متقطع للإشارة إلى الخلفية أو الهضبة السفلية. ملاحظة: يمكن مقارنة عدة سيرا تعامل بالمثل باستخدام هذه الاستراتيجية تطبيع. للمقارنة المباشرة، يوصى كذلك بحساب نصف الحد الأقصى للإصدار، وهو تركيز المستضد (بالنغ/مل) اللازم لإطلاق نصف الحد الأقصى المحدد على أنه متوسط القيم القصوى والحد الأدنى لكل منحنى. يتم حساب تركيز المستضد لتحفيز إطلاق نصف الحد الأقصى عن طريق الاستيفاء من قيمة الإصدار الأقصى النصف في خط الانحدار لوغاريتمي.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Curin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+of+allergen-specific+immunotherapies:+molecular+approaches.">Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).</li><li>Okamoto-Uchida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+results+of+IgE+binding-+and+crosslinking-Based+allergy+tests+caused+by+allergen+immobilization.">Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).</li><li>Vogel, L., L&#252;ttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+in+vitro+assay+as+a+novel+tool+for+the+standardization+of+allergen+extracts+in+the+human+system.">Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system.</a> Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).</li><li>Ocmant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basophil+activation+tests+for+the+diagnosis+of+food+allergy+in+children.">Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children.</a> Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).</li><li>Platts-Mills, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+immunoglobulin+E+in+allergy+and+asthma.">The role of immunoglobulin E in allergy and asthma.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), 1-5 (2001).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE+and+mast+cells+in+allergic+disease.">IgE and mast cells in allergic disease.</a> Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).</li><li>Lawrence, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-life+of+IgE+in+serum+and+skin:+Consequences+for+anti-IgE+therapy+in+patients+with+allergic+disease.">Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).</li><li>Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+chemotaxis+in+mast+cells.">Signal transduction and chemotaxis in mast cells.</a> European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).</li><li>Peebles, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandins+in+asthma+and+allergic+diseases.">Prostaglandins in asthma and allergic diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 193, 1-19 (2019).</li><li>Cyphert, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+inflammation+induces+a+persistent+mechanistic+switch+in+thromboxane-mediated+airway+constriction+in+the+mouse.">Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).</li><li>M&#233;ndez-Enr&#237;quez, E., Hallgren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+their+progenitors+in+allergic+asthma.">Mast cells and their progenitors in allergic asthma.</a> Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).</li><li>Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen-induced+mediator+release+tests.">Allergen-induced mediator release tests.</a> Allergy. 58 (7), 553-558 (2003).</li><li>Yamaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intracellular+histamine+concentration+and+basophil+activation+in+anaphylaxis.">Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis.</a> Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+assay+based+on+particle+analysis+for+cell+degranulation+detection+in+basophils+and+mast+cells.">A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells.</a> Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-P&#233;rez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., S&#225;nchez-Mach&#237;n, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+major+mite+allergens+from+European+standardized+commercial+extracts+for+in+vivo+diagnosis:+addressing+the+need+for+precision+medicine.">Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine.</a> Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).</li><li>Focke, M., Marth, K., Valenta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+and+biological+activity+of+commercial+birch+pollen+allergen+extracts.">Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts.</a> European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).</li><li>Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+allergen+assay+for+in+vivo+test+allergens+with+an+in+vitro+model+of+the+murine+type+I+reaction.">Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).</li><li>Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+rat+basophil+leukemia+(RBL)+cell-based+immunological+assay+for+allergen+identification,+clinical+diagnosis+of+allergy,+and+identification+of+anti-allergy+agents+for+use+in+immunotherapy.">Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy.</a> Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).</li><li>Kaul, S., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+assay+of+rat+basophil+leukemia+cells+as+alternative+for+passive+cutaneous+anaphylaxis+testing+(PCA)+in+laboratory+animals.">Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals.</a> Altex. 18 (1), 55-58 (2001).</li><li>Passante, E., Frankish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RBL-2H3+cell+line:+its+provenance+and+suitability+as+a+model+for+the+mast+cell.">The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell.</a> Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).</li><li>Kaul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+assays+based+on+human+or+murine+immunoglobulin+E+in+allergen+standardization.">Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+vitro+and+in+vivo+models+in+the+study+of+food+allergy.">Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy.</a> Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).</li><li>Klueber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+tropomyosins+from+vertebrate+and+invertebrate:+Recombinant+calibrator+proteins+in+functional+biological+assays+for+tropomyosin+allergenicity+assessment+of+novel+animal+foods.">Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+thermal+processing+effects+on+peanut+allergenicity.">Different thermal processing effects on peanut allergenicity.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amb+a+1+isoforms:+Unequal+siblings+with+distinct+immunological+features.">Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features.</a> Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).</li><li>Eichhorn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design,+structure-activity+relationship,+and+immunogenicity+of+hypoallergenic+Pru+p+3+variants.">Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).</li><li>Abd Rani, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+the+antiallergic+activity+of+phyllanthus+amarus+Schum.+and+Thonn.+and+its+compounds.">Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds.</a> Molecules. 26 (3), (2021).</li><li>Huber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+clinical+outcome+of+birch+pollen+immunotherapy+relate+to+induction+of+blocking+antibodies+preventing+IgE+from+allergen+binding?+A+pilot+study+monitoring+responses+during+first+year+of+AIT.">Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT.</a> Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).</li><li>Araujo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;1+mimetic+peptide+modulates+immune+response+to+grass+pollen+allergens+in+mice.">TGF&#946;1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice.</a> Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).</li><li>Passante, E., Frankish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+elements+involved+in+TLR4-receptor+signalling+in+RBL-2H3+cells.">Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells.</a> Inflammation Research. 59, 185-186 (2010).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

وصف هنا هوربل الخلية القائم على اختبار الافراج عن وسيط هو وسيلة قوية التي يمكن بسهولة تنفيذها وتنفيذها في أي مختبر. والشرط الوحيد هو أن الخلايا تحتاج إلى أن تزرع في ظروف معقمة. يتم استخدام المقايسة لتقييم احتمال وجود مصدر مسبب للحساسية أو مسبب للحساسية لاستحضار المرضى 'IgE-crosslinking وإزالة الجاذبية القاعدية17. يمكن بسهولة تكييف المقايسة مع أي مصدر مسبب للحساسية أو مسبب للحساسية طالما أن مصل المريض مع مستوى عال من IgE محددة ، مع الاعتراف بحساسية الاهتمام ، متاح. من المستحسن إجراء فحص صلاحية الخلية بالإضافة إلى المقايسة الإفراج الوسيط من أجل حساب أي آثار السامة للخلايا المحتملة التي قد تؤدي إلى ضعف أداء الفحص. قد يكون هذا بسبب عدم اكتمال تعطيل المكمل للسيرا أو غيرها من الآثار السامة للخلايا المشتقة من المصل. حتى المستضد نفسه ، على سبيل المثال ، بسبب النشاط البروتيوليك / الأنزيمي ، يمكن أن يضر بخلايا huRBL. نحن عادة ما تستخدم اختبار صلاحية الخلية مع MTT (3-(4,5-ديميثيلثيازول-2-yl)-2,5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) لتقييم الآثار السامة للخلايا المحتملة. يمكن إجراء المقايسة بسهولة مع خلايا huRBL المتبقية بعد جمع ونقل الخلايا الفائقة (انظر الخطوة 6.3. من البروتوكول). بالمقارنة مع الأساليب الكيميائية المناعية الأخرى ، مثل ELISAs والنشاف الغربي ، لتحديد الإمكانات المسببة للحساسية إما لمسببات الحساسية الفردية أو المستخلصات المعقدة على أساس ارتباط مسببات الحساسية - IgE ، يمكن لهذا الفحص أن يكشف ليس فقط ربط IgE لمسببات الحساسية ولكن يمكنه أيضا قياس وظائف كل من IgE البشرية والمواد المسببة للحساسية ، لاستفزاز إزالة البقعالقاعدية بوساطةIgE 18 . وهكذا، فإنه يمكن أن تساعد في دراسة شدة أعراض الحساسية في الجسم الحي السابق باستخدام سيرا المرضى. ويقال إن المقايسة أكثر اتساقا وكفاءة من اختبارات الحساسية المفرطة الجلدية السلبية الكلاسيكية لأن المقايسة تستخدم خلايا RBL-2H3 ، والتي يسهل التعامل معها نسبيا وتنتج تباينا أقل في النتائج مقارنة بالخلايا الأولية ، مثل الخلايا السارية أو القاعديات البشرية19،20. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الفحص تمثيلا جيدا للنشاط البيولوجي لمسببات الحساسية ويمكن أن يقدر بدقة إجمالي محتوى مسببات الحساسية في عينة معقدة معينة3. لاستكشاف أخطاء بعض الخطوات في البروتوكول الرجاء الرجوع إلى الجدول 1.
وفيما يتعلق بتطبيق هذه النسخة من المقايسة الافراج عن الوسيط، وقد استخدمت في الغالب لأغراض البحث ولكن أيضا لتوحيد مقتطفات مسببة للحساسية على أساس نشاطها البيولوجي. ويشمل ذلك تحليل دفعات مختلفة من حلول العلاج الوقائي الوقائي الوقائي، وحل اختبار الاستفزاز، فضلا عن المستخلصات المستخدمة للعلاج المناعي الخاص بالمواد المسببة للحساسية؛ كما هو مبين لحبوب اللقاح، وبر القط، عث الغبار المنزل، ومستخلصات الفول السوداني، وكذلك سم النحل3،17،21. يمكن تطبيق هذه التقنية خاصة في تشخيص الحساسية الغذائية ، حيث يمكنها اكتشاف كميات ضئيلة من المكونات المسببة للحساسية في المنتجات الغذائية المعقدة مثل الفول السوداني والحليب والقمح والبيض22. في هذا الصدد ، كما تم الإبلاغ عن أداة قيمة لتقييم الحساسية من المواد المسببة للحساسية الغذائية الحيوانية ، مثل tropomyosins ، ويمكن أن تساعد في التمييز بين المواد المسببة للحساسية قوية من المواد غير المسببة للحساسية23. كأداة بحثية ، يتم استخدام المقايسة لدراسة تأثير معالجة الأغذية وكذلك لتقييم تأثير الربط ليغاند لمسببات الحساسية وتأثيرها على الحساسية24،25. على سبيل المثال ، تبين أن ربط Bet v 1 إلى ligands لا يؤثر على الربط المتبادل بين مسببات الحساسية IgE ، على الرغم من أنه تسبب في زيادة استقراره الحراري والبروتيوليكي25. يمكن استخدام المقايسة لمقارنة التفاعل المريض لمسببات الحساسية البسيطة والرئيسية، وكذلك للتحقيق في التفاعل المتبادل من المثليات المسببة للحساسية وisoforms، كما هو مبين في مثالنا باستخدام بيت الخامس 1 ومسببات الحساسية الغذائية المثلية كور 1 (الشكل 3). فيما يتعلق isoforms مسببات الحساسية، تم استخدام المقايسة الافراج عن وسيط لتحديد مسببات الحساسية الرئيسية أمب A1.01 كما isoform IgE التفاعلية أقوى في حبوب اللقاح ragweed (أمبروزيا artemisiifolia). وبالمقارنة، فإن اثنين آخرين من isoforms المحددة في مقتطفات حبوب اللقاح ragweed، أمب 1.02 وامب 1.03، وأظهرت انخفاض التفاعل للمرضى 'IgE26.
في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق المقايسة لدراسة المركبات المضادة للحساسية المحتملة والمتغيرات الجديدة هيبوالرجينيك من المواد المسببة للحساسية ، مما يساعد في تحديد المرشحين المناسبين للعلاج المناعي الخاص بحساسية27،28. نهج جديد آخر هو استخدام المقايسة لرصد فعالية العلاج في سياق العلاج المناعي الخاص بحساسية. في هذا الصدد ، طورت مجموعتنا البحثية نظام تثبيط فحص huRBL ، والذي يرتبط بشكل جيد مع انخفاض درجة أعراض المريض أثناء العلاج المناعي الخاص بالمواد المسببة للحساسية29. كما تم اقتراح المقايسة لدراسة الآثار المثبطة للمناعة من TGFβ1 على الحط من حساسية الناجمة عن IgE بوساطة30.
القيود المفروضة على المقايسة هي أنه على الرغم من أن خلايا huRBL تمتلك بعض ميزات الخلايا الصارية أو الخلايا القاعدية ، إلا أنها لا تحاكي تماما الوظيفة الطبيعية لهذه الخلايا التأثيرية. على سبيل المثال، الخلايا الصاري تعبر على نطاق واسع عن مستقبلات التعرف على نمط مستقبلات مثل حصيلة 4 (TLR4)، اللازمة للتعرف على مسببات الأمراض، في حين أنها قاصرة تماما في خلايا RBL-2H331. بسبب هذا الاختلاف في الأداء الوظيفي ، لا يحاكي الفحص تماما الوضع الواقعي ، والذي يجب أن يوضع في الاعتبار عند تفسير البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، بما أن خلايا huRBL هي خلايا باسوفيليا سرطانية ، فإن التغيرات في ظروف الثقافة والزرع المطول يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في المناطق المحيطة تؤدي إلى نتائج متغيرة بين مختبرات مختلفة20. جانب آخر هو اختيار تركيز مسببات الحساسية التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تكييف هذه الطريقة لأن تركيزات مسببات الحساسية العالية قد تؤدي إلى إزالة الحبوب بوساطة غير IgE بسبب وجود كميات عالية من البروتياز أو السمومالداخلية 18. القيود الأخرى هي الاعتماد على سيرا الإنسان مع مستويات IgE محددة عالية نسبيا (RAST فئة 5-6)، والحاجة إلى نظم زراعة الخلايا، والتي لا تزال عقبة تحتاج إلى التغلب عليها من أجل تنفيذ هذه التقنية في الروتين السريري اليومي.
وبصرف النظر عن هذه القيود، يمثل فحص huRBL أداة بحثية قيمة لتشخيص وعلاج أمراض الحساسية ويمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات.

تؤثر ردود الفعل فرط الحساسية من النوع الأول، التي تتميز بإنتاج الغلوبولين المناعي E (IgE) المحدد لمضاد معين، على ما يقرب من ثلث سكان العالم. وترتبط هذه التفاعلات مع العديد من مظاهر الحساسية مثل الربو والتهاب القرن ويمكن أن يؤدي حتى إلى ردود فعل الجهازية التي تهدد الحياة1. على عكس الاختبارات الحية، فإن النهج الكيميائية المناعية، مثل الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، مناسبة فقط للتحقيق في الربط المستهدف للأجسام المضادة ولكنها لا تعالج الجانب الوظيفي للبروتينات التي يمكن أن تسبب تفاعلات فرط الحساسية الفورية. يمكن أن يسبب شل مسببات الحساسية على الدعامات الصلبة (على سبيل المثال ، لوحات ELISA) تغييرات في سلامتها الهيكلية وتدمير الأسطح ذات الصلة بالحساسية2. حتى اختبارات وخز الجلد (SPT)، الأداة الأكثر شيوعا لتأكيد التوعية ضد بعض المواد المسببة للحساسية، لها حدودها فيما يتعلق بالكشف عن حساسية الطعام بوساطة IgE أو توافر مسببات الحساسية3،4. من أجل العثور على طريقة أخلاقية ومحددة للغاية وحساسة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الفعالية البيولوجية لمسببات الحساسية للتسبب في رد فعل فرط الحساسية من النوع الأول ، تم إنشاء ما يسمى بمقايسات إطلاق الوسيط.
يعتمد مبدأ هذه المقايسات على الأحداث التي تلي مرحلة التوعية والقدرة المصاحبة ل IgE على الارتباط بالسلسلة α لمستقبلات التقارب العالية المعبر عنها على سطح الخلايا التأثيرية ، مثل الخلايا السارية والباصوفيلية. يتم إنتاج IgE بشكل رئيسي عن طريق خلايا البلازما في الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي. على الرغم من أنه هو الغلوبولين المناعي الأقل وفرة (حوالي 0.05٪ في الأفراد غير التأتبيك) في الدم، فإنه يمتلك نشاطا بيولوجيا مرتفعا بشكل غير عادي كونه السبب الرئيسي لأعراض الحساسية. يمكن أن يزيد نصف عمر IgE من 2-3 أيام إلى عدة أسابيع وحتى أشهر عندما يرتبط بمستقبلاته على الخلايا التأثيرية. الربط اللاحق لمستضد للمنطقة المتغيرة من اثنين من جزيئات IgE المرتبطة بالمستقبلات يؤدي إلى ربطها عبر تليها تحريض سلسلة إشارات المصب في الخلية التأثيرية مما يؤدي إلى التحلل وإطلاق العديد من الوسطاء المؤيدين للالتهابات مما تسبب في توسع الأوعية ، مثل الهستامين ، سيرين بروتياز (على سبيل المثال ، تريبتاز) ، والبروستاغلاندين5و6و7. إفراز السيتوكينات مثل إنترلوكين 4 (IL-4) و IL-13 هي المسؤولة عن الحفاظ على التهابات T المساعد 2 (Th2) استجابة والتحول فئة من الخلايا B إلى خلايا البلازما المنتجة IgE5,8,9. من ناحية أخرى، صدر thromboxane يسبب التهاب القصبات الهوائية، وleukotrienes تحفيز تقلص العضلات على نحو سلس، فضلا عن تسرب الأوعية الدموية، وتلعب دورا حاسما في التهاب مجرى الهواء مما يؤدي إلى الربو أو التهاب الأنف التحسسي10،11.
وقد أنشئت أدوات بحثية لتحليل معظم الوسطاء المذكورين أعلاه، وإن كان ذلك مع بعض العيوب الرئيسية. المقايسات تريبتاز هي النهج السريرية المناسبة لقياس الحساسية المفرطة الجهازية من خلال تنشيط الخلايا الصاري ولكن حساسيتها وخصوصية في تشخيص الحساسية غير دقيقة جدا بالمقارنة مع الطرق القياسية الذهب مثل SPT. من ناحية أخرى، لا يمكن أن تكون مقايسات السيستينيل لليوكوتيرين قادرة على تشخيص الحساسية β-اللاكتام أو الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية12. وقد وضعت بالفعل بروتوكولات لقياس الهيستامين كوسيط رئيسي صدر في ردود الفعل التحسسية في الستينات. مرة واحدة صدر في الدم المحيطي, الهستامين هو المتدهورة على الفور من قبل ميثيل ترانسفيراسيس الهيستامين مما أدى إلى نصف عمر البلازما من بضع دقائق فقط, مما يجعل تحليلها تحديا كبيرا13. وبصرف النظر عن عدم استقرارها ، فقد ثبت أن مراقبة الهيستامين لديها خصوصية وحساسية منخفضة لحساسية الدواء وكذلك البروتينات الغذائية التجارية وسموم الدبابير12.
في المختبر نماذج مع خطوط الخلية التأثيرية وقد أدخلت كبديل لإجراءات كثيفة العمالة من العزل وزراعة basophils من المرضى الذين يعانون من الحساسية لإجراء المقايسات الإفراج. لذلك ، تم إنشاء سرطان الدم القاعدي للفئران - (RBL-) باستخدام خط الخلية RBL-2H33. وبما أن خط الخلية هذا غير قادر على ربط IgE البشري ، فقد تم إصابة أول مرة α β γ من مستقبلات غشاء البلازما IgE البشري (FcεRI). وقد تم توليد عدة استنساخ واختبارها لمستويات التعبير وتجانس سلسلة α البشرية، والتي ظهر استنساخ RBL-30/25 كمرشح واعد للاختبار في المختبر. تم اختبار سلسلة الإشارات الناجمة عن تنشيط مستقبلات المستنسخة المصابة عن طريق مقايسات تعبئة الكالسيوم. كمؤشر على إزالة التشجرات وبديل لإطلاق الهيستامين ، تم قياس إنزيم الليسوسومات β -hexosaminidase ، والذي يتمتع بميزة كبيرة تتمثل في استقرار أعلى14. وسيط الإفراج باستخدام خلايا RBL-30/25 تصل إلى 100٪ ، وبالتالي، يستخدم لاختبار سيرا المستمدة من مرضى الحساسية. تم اختبار المقايسة لإطلاق سراح الوسيط بعد تحدي الخلايا الحساسة مع مقتطفات مسببات الحساسية التجارية. وأدى ذلك إلى أن هناك تباين هائل في تكوين (تصل إلى 60 أضعاف فيما يتعلق بمحتوى البروتين الكلي) من مقتطفات مسببات الحساسية المستمدة من مختلف الشركات المصنعة وتستخدم لتشخيص (على سبيل المثال، SPT) أو النهجالعلاجية 3،15،16.
هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا للبروتوكول RBL لإجراء اختبار الافراج عن الوسيط باستخدام المصل من المتبرعين بالحساسية. أثناء التوعية السلبية ، يتم التقاط IgE في المصل من خلال مستقبلات FcεR1 عالية التقارب المعبر عنها على سطح الخلايا القاعدية. عند تحفيز المستضد ، ترتبط IgEs الملزمة الخاصة بالمضاد عبر ، مما يؤدي إلى إزالة الخلايا وإطلاق الوسيط β-hexosaminidase. يتم قياس نشاط β-hexosaminidase في وقت لاحق باستخدام ركيزة مناسبة. بالنسبة للمقاايسة، تم استخدام خلايا huRBL-2H3، و يطلق عليها huRBL في البروتوكول التالي. يصف البروتوكول سلسلة تمييع مستضد قياسية مع 8 خطوات مخففة 1:10 تتراوح بين 1 ميكروغرام / مل إلى 0.1 pg /mL من مسببات الحساسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10K units Pen.&#160; 10 mg/mL Strep.)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mediator release assay as a read-out for allergen potency

يقوم الوسيط بتحليل الغلوبولين المناعي المختبري E (IgE) بوساطة التخلص من الحبوب وإفراز الوسطاء عن طريق الخلايا التأثيرية ، مثل الخلايا السارية والباسوفيلية ، عند التحفيز مع التخفيفات التسلسلية لمسببات الحساسية المفترضة. لذلك ، تمثل هذه المقايسات أداة أساسية تحاكي عملية إزالة الجاذبية في الجسم الحي ، والتي تحدث عند التعرض لمسببات الحساسية في المرضى الحساسين أو في اختبارات وخز الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم استخدام هذه المقايسات للتحقيق في الإمكانات المسببة للحساسية للبروتينات وتفاعلات التفاعل مع المرضى. هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط لمدة يومين باستخدام خط خلايا سرطان الدم القاعدي الفئران الخالدة المصابة وأنسنة مع الإنسان عالية التقارب IgE مستقبلات البلازما غشاء (FcεRI). هذا البديل من المقايسة الافراج عن الوسيط هو قوية وحساسة ، وقابلة للاستنساخ في المختبر نظام الخلية القائمة دون الحاجة إلى شل مستضد لمصفوفات صلبة. يتكون البروتوكول من الخطوات التالية: (1) تكمل تعطيل سيرا الإنسان ، (2) الحصاد ، البذر ، والتوعية السلبية للخلايا ، (3) التحفيز بالمستضد للتسبب في إطلاق الوسيط ، و (4) قياس نشاط β -hexosaminidase كبديل للوسطاء الالتهابيين المفرج عنهم ، مثل الهيستامين. يمثل المقايسة أداة مفيدة لتقييم قدرة الحساسية-IgE عبر الربط لتحريك إزالة الخلايا ويمكن تنفيذها لتوحيد مقتطفات مسببات الحساسية، لمقارنة التفاعل المرضى لمسببات الحساسية البسيطة أو الرئيسية ومستخلصات مسببة للحساسية (حبوب اللقاح، وبر القط، الخ)، للتحقيق في قوة التجانسات المسببة للحساسية، isoforms، والمتغيرات أضعاف (على سبيل المثال، hypoallergenicity)، فضلا عن آثار الليجاندس على النشاط المسبب للحساسية. تطبيق أحدث يتضمن استخدام المقايسة لمراقبة فعالية العلاج في سياق العلاج المناعي المسببة للحساسية.

الوسيط الافراج عن المقايسة، استنادا إلى خلايا huRBL (الشكل 1A و B)، النتائج في منحنى جرعة استجابة على شكل جرس ( الشكل1C). لتمثيل البيانات المبسطة، يمكن حساب تركيز المستضد اللازم لإطلاق الوسيط الأقصى النصف باستخدام الانحدار الخطي(الشكل 1D). يتم إجراء فحص قابلية البقاء للخلية لاستبعاد الآثار السامة للخلايا المستمدة من مصل التوعية أو المستضد المستخدم للتحفيز(الشكل 1E). يمكن استخدام المقايسة لاختبار التفاعل من سيرا مختلفة إلى مستضد معين. في حالتنا، 4 من أصل 5 سيرا، المستمدة من مرضى حساسية حبوب اللقاح البتولا، استجابت للتحفيز بيت الخامس 1. المصل # 1 أظهرت أعلى وسيط الافراج (الشكل 2). لم يستجيب المصل رقم 5 لتحفيز Bet v 1 ، وبالتالي ، قد يتفاعل مع مسببات الحساسية الأخرى لحبوب اللقاح البتولا (على سبيل المثال ، Bet v 2 ، profilin). تشير هذه البيانات إلى أن Bet v 1 هو مسبب حساسية قوي مسؤول عن أعراض الحساسية بوساطة IgE. باستخدام المقايسة huRBL، يمكن تقييم التفاعل المتبادل بين IgE والمواد المسببة للحساسية المتجانسة(الشكل 3). هنا ، استجاب كل من مرضى حساسية حبوب اللقاح البتولا بشكل جيد ل Bet v 1 ، في حين استجاب المريض الوحيد رقم 2 أيضا ل Cor a 1 ، وBet v 1-homologous food allergen الموجود في البندق. استنادا إلى هذه البيانات، المريض رقم 2 على الأرجح لديه أعلى كور 1 عبر التفاعلية مستويات IgE من المريض # 1، مما أدى إلى أعراض الحساسية عن طريق الفم على استهلاك البندق. حتى تقييم الطبيعة هيبوالرجيجينية للمتغيرات متحولة من المواد المسببة للحساسية (انخفاض قوة) يمكن تحليلها ومقارنتها مع نظيرتها البرية من نوع(الشكل 4). في المثال المقدم ، تحول منحنى إطلاق متغير الطي نحو تركيز مستضد أعلى مقارنة بمسببات الحساسية البرية ، مما أدى إلى تركيز أعلى بكثير من المستضد اللازم لإثارة إطلاق نصف الحد الأقصى(الشكل 4B). هذه البيانات تعني أن البديل المتحول / أضعاف ولدت هو أقل مسببة للحساسية بالمقارنة مع البروتين البرية من نوع. هذا انخفاض قوة لتحريك التملق بوساطة IgE يسلط الضوء على الطابع هيبوالرجينيك من البديل أضعاف. استنادا إلى هذا المقايسة، البديل أضعاف هو مرشح مثير للاهتمام للعلاج المناعي مسببات الحساسية محددة لأنه قد يسبب انخفاض الآثار الجانبية المرتبطة IgE أثناء العلاج.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig01.jpg"> الشكل 1:خلايا RBL أنسنة ومنحنى تمثيلي على شكل جرس من IgE-المسببة للحساسية عبر ربط الناجمة عن β-hexosaminidase الإفراج. خلايا RBL هي ملتزمة قوارير الثقافة، مما يعطيها شكل قضيب مثل لأنها تحاول أن تعلق نفسها(A). مستوى مثالي من التقاء الخلايا التي سيتم حصادها لا يزيد عن 90٪(B). تظهر الخلايا تحت تكبير 40x و 10x، على التوالي. الخلايا التي تم توعيتها مع مصل الإنسان من البتولا حبوب اللقاح حساسية الفرد رد فعل على التحدي مع بيت المؤتلف v 1 (rBet v 1), مسببات الحساسية الرئيسية حبوب اللقاح البتولا(C). كبديل للإفراج عن الوسيط ، يتم قياس نشاط β-hexosaminidase في الخلايا الفائقة. ينتج المنحنى على شكل جرس عن احتلال أحادي التكافؤ لأسطح المستضد على IgE بسبب فائض مسببات الحساسية ، والذي يمنع بشكل تنافسي الارتباط المتبادل بين مسببات الحساسية IgE بتركيزات مستضد عالية. تفسير آخر للافراج عن انخفاض في تركيزات مسببات الحساسية العالية هو تثبيط المسارات داخل الخلايا في وجود مستضد الزائدة. لتحديد تركيز مسببات الحساسية اللازمة للحصول على نصف إطلاق أقصى ، تم استخدام خط انحدار لوغاريتمي استنادا إلى القيم التجريبية التي تمثل الجزء الخطي من منحدر منحنى إطلاق الوسيط (D). يمثل الخط المنقط الأحمر خط الانحدار لوغاريتمي المستخدم في الحساب. تظهر صيغة خط الانحدار باللون الأحمر. يتم تعريف الإصدار الأقصى النصف كما يلي: إصدار الحد الأقصى نصف = (قيمة الإصدار الحد الأدنى + قيمة الإصدار الأقصى)/2. في المثال، كان الإصدار الأقصى نصف المحسوب 20.6٪. تم تخفيف المصل البشري التمثيلي المستخدم في هذه التجربة 1:20 للحضانة مع خلايا huRBL ، وتراوح تركيز المستضد المستخدم للتحفيز من 100 ميكروغرام / مل إلى 0.004 pg /mL من Bet v 1. تم إجراء فحص قابلية بقاء الخلية ، في هذه الحالة فحص MTT ، مع الخلايا المتبقية بعد تحفيز المستضد لتقييم تأثير المصل الحساس وكذلك تمييع المستضد على صلاحية الخلية وعدد الخلايا (E). تظهر خلايا الخلفية غير المعالجة والخلايا المتحللة (الحد الأقصى للتحلل) كخط منقط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig02.jpg"> الشكل 2: منحنيات تمثيلية لإطلاق β-hexosaminidase في المئة من خمسة سيرا الإنسان مختلفة. تم احتضان نفس نطاق تركيز المستضد من rBet v 1 بخلايا huRBL التي تم توعيتها مع سيرا من مختلف الأفراد الذين توعيتهم بحبوب اللقاح البتولا. هناك فرق واضح في الإفراج في المئة بين المرضى المختلفين المقابلة لشدة أعراضهم. لاحظ أن المريض رقم 5 غير تفاعلي مع مسببات الحساسية الرئيسية لحبوب اللقاح البتولا Bet v 1. تم تخفيف جميع سيرا الإنسان الخمسة المستخدمة للحصول على هذه المنحنيات الافراج وسيط على قدم المساواة 1:20 لاحتضان مع خلايا huRBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig03.jpg"> الشكل 3: عبر التفاعل من IgE المستمدة من سيرا من حبوب اللقاح البتولا توعية المرضى الذين يعانون من بيت الخامس 1 مسبب الحساسية البندق متجانسة كور 1. اثنين من sera ممثل المرضى الذين تم توعيتهم لحبوب اللقاح البتولا تتفاعل بقوة مع بيت الخامس 1 وكذلك إلى درجة أقل لمسببات الحساسية متجانسة كور 1. المريض 2 يظهر رد فعل كبير لكور 1، وبالتالي من المرجح أن تظهر أعراض الحساسية عن طريق الفم على استهلاك البندق، مقارنة مع المريض 1 حيث الإفراج وسيط يكاد لا يذكر. يمثل الخط المنقط التحكم في عدم المستضد ، وهي خلايا حساسة بالسيرا البشرية ولكن لا يتم تحفيزها بمسببات الحساسية ، وبالتالي ، فهي بمثابة مؤشر على هضبة / خلفية الإشارة السفلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig04.jpg"> الشكل 4: مقارنة الإفراج في المئة بين rBet v 1 نوع البرية وhypoallergenic أضعاف البديل. تم احتضان نفس المصل للفرد البتولا حبوب اللقاح الحساسة مع rBet v 1 نوع البرية (wt) وhypoallergenic أضعاف البديل من مسببات الحساسية الرئيسية حبوب اللقاح البتولا (A). على الرغم من أن ينظر إلى إطلاق وسيط في كلا المستضدات، هناك تحول واضح نحو تركيزات مستضد أعلى عند مقارنة البديل أضعاف لنوع البرية rBet v 1 لإطلاق سراح نفس النسبة المئوية. وهناك طريقة قياسية لمقارنة الفرق في إطلاق النسبة المئوية من المستضدات المختلفة هو حساب تركيز المستضد اللازم لتحقيق نصف الحد الأقصى للافراج (ب). وعادة ما يتم ذلك في التكرارات البيولوجية (اختبار نفس نطاق المستضد لكل مسببات الحساسية في سيرا الإنسان المختلفة). عادة، من أجل استخلاص أي استنتاجات هامة، يتم تنفيذ الافراج عن الوسيط مع سيرا من 8 إلى 10 على الأقل المرضى مختلفة. هنا يتم رسم نتائج أربعة سيرا مختلفة كمثال. تم استخدام t-testالمقترن للتحليل الإحصائي. *p ≤ 0.05; ** ص ≤ 0.01؛ ص ≤ 0.001; ص ≤ 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" fo:text-align="left"><tbody>
<tr>
<td>الأسئلة المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها</td>
			<td>حل</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">تقلب المقايسة إلى الفحص بسبب استجابة الخلية المتغيرة</td>
			<td>تأكد من أن رقم دورة مرور الخلية لا يتجاوز 20 إلى 30 مقطعا. جعل المخزونات المجمدة في الممرات المبكرة للتجارب في المستقبل.</td>
		</tr>
<tr>
<td>بل تعتمد على التكرارات البيولوجية (استخدام سيرا مختلفة) من تلك التقنية.</td>
		</tr>
<tr>
<td>سيرا يحتوي على مستويات منخفضة من IgE محددة</td>
			<td>يمكن استخدام تخفيف مصل نهائي أقل (أي 1:10) بدلا من 1:20. وعلى العكس من ذلك، يمكن تخفيف سيرا التي تحتوي على مستويات عالية من IgE محددة (1:30 أو 1:40).</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا توجد خلايا كافية لإجراء الفحص</td>
			<td>تأكد من أن التقاء قارورة T-75 حوالي 50-90٪. مرور المزيد من القوارير.</td>
		</tr>
<tr>
<td>الآثار السامة للخلايا من سيرا، أي بسبب عدم اكتمال تكملة تعطيل</td>
			<td>إجراء فحص صلاحية الخلية بالإضافة إلى المقايسة الافراج عن الوسيط. زيادة تركيز Ag8 لتجنب عدم اكتمال تعطيل المكمل.</td>
		</tr>
<tr>
<td>إشارة منخفضة</td>
			<td>تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من المقايسة عن طريق تخفيف العازلة 1x التيرود في أكسيد الديوتريوم (D2O) بدلا من DH2O، أو باستخدام سيرا مع مستويات أعلى من IgE محددة لمسببات الحساسية من الفائدة.</td>
		</tr>
<tr>
<td>مسببات الحساسية ليست مستقرة في العازلة التيرود (على سبيل المثال هطول الأمطار)</td>
			<td>إجراء اختبارات الاستقرار في المخزن المؤقت 1x التيرود قبل إجراء الفحص. لا ينصح باستبدال المخزن المؤقت لتيرود.</td>
		</tr>
<tr>
<td>مشاكل في العثور على تركيز البداية الصحيح لمسببات الحساسية المعنية</td>
			<td>التكيف من سلسلة التخفيف لتغطية منحنى الإفراج الكامل (مزيد من الخطوات المخفف، 1:20 التخفيف بدلا من 1:10).</td>
		</tr>
<tr>
<td>ضعف أداء الفحص المشار إليه بإشارة منخفضة/معدومة</td>
			<td>تجنب الآثار السامة للخلايا من تحفيز ال سيرا أو مستضد (مثل المواد المسببة للحساسية الأنزيمية). غسل ونقع الخلايا بعناية. تجنب التعرض للهواء لفترة طويلة جدا ومنع الخلايا من الجفاف.</td>
		</tr>
<tr>
<td>كيف أعرف إذا تم الوصول إلى هضبة الإشارة السفلية؟</td>
			<td>أضف عناصر التحكم "بدون مستضد" إلى طبقك. هذه هي الخلية الحساسة، والتي تم تحفيزها فقط مع العازلة 1x تايرود ولكن من دون مسببات الحساسية.</td>
		</tr>
<tr>
<td>هل أحتاج إلى تحكم إيجابي بالإضافة إلى الحد الأقصى الآبار التحلل؟</td>
			<td>كما التحكم الإيجابي إضافية مصل ومزيج مستضد المعروف أن يسبب degranulation يمكن استخدامها أو مضادة FcεR1.</td>
		</tr>
<tr>
<td>كم بئر أحتاج؟</td>
			<td>وهذا يعتمد على سلسلة المعايرة الخاصة بك، وعدد المستضدات وسيرا تريد تحليل.  تخطيط تخطيط لوحات 96 جيدا وفقا لكيفية العديد من سيرا / المستضدات أنت ذاهب لاختبار. لا تنسى أن تضيف "لا ضوابط مستضد"، وخلايا الخلفية (غير حساسة، غير محفزة) وكذلك الآبار تحلل الحد الأقصى.</td>
		</tr>
<tr>
<td>كم سيرا يجب أن أختبر؟ وهل أحتاج إلى نسخ متماثلة؟</td>
			<td>على الرغم من أن المقايسة قوية جدا، هناك بعض التباين في المقايسة إلى المقايسة بسبب استجابة الخلية المتغيرة. ولذلك، يوصى بالاعتماد بدلا من ذلك على الرواسخ البيولوجية (باستخدام السيرا المختلفة) بدلا من الاعتماد على النسخ المتماثلة التقنية. ويكفي أن يكون هناك ثمانية سيرا مختلفة على الأقل لتحليل المواد المسببة للحساسية. ومع ذلك، وكما هو مبين في الشكل 4B، يمكن بالفعل الحصول على نتائج هامة باستخدام أقل سيرا.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Watch this Scientific Journal Video about Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency at JoVE.com

Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency

هنا نقدم الوسيط الافراج عن المقايسة ، وذلك باستخدام خط خلية سرطان الدم الجرذ القاعدية المصابة مع مستقبلات IgE الإنسان ، لمحاكاة degranulation من الخلايا التأثيرية لوحظ عادة في نوع 1 الحساسية. هذه الطريقة تحقق في النشاط البيولوجي لمسببات الحساسية بطريقة حساسة للغاية وقابلة للاستنساخ ومصممة خصيصا.

أنسنة وسيط الافراج عن المقايسة كمقروءة لقوة مسببات الحساسية

Mediator release assays analyze in vitro immunoglobulin E (IgE)-mediated degranulation and secretion of mediators by effector cells, such as mast cells ...

يمثل المقايسة أداة بحثية مهمة لمحاكاة عمليات التخلص من الخلايا القاعدية الناجمة عن الربط المتبادل بين المرضى والمواد المسببة للحساسية. وبالتالي يمكن استخدام المقايسة لمحاكاة النوع 1 ، ردود الفعل التحسسية. المقايسة قوية وقابلة للاستنساخ وقابلة للتكييف.وعلاوة على ذلك، فإنه حساس للغاية كما يمكن أن يؤديها مع كميات صغيرة من مسببات الحساسية المؤتلف أو تنقيتها أو حتى مع مقتطفات مسببات الحساسية المعقدة. يتم استخدام هذه الطريقة لتشخيص الحساسية لأنها تحلل التفاعل بين المرضى'IgE لمسببات الحساسية. أيضا هذه الطريقة مناسبة لتحليل التفاعل المتبادل ورصد فعالية العلاج AIT.ابدأ بحصاد خلايا Ag8 من قارورة زراعة الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي. بيليه أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق، في 250 مرة ز في درجة حرارة الغرفة. يستنشق العملاق، وإعادة إنفاق بيليه الخلية إلى تركيز نهائي من حوالي مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة، لكل ملليلتر في أنسنة، RBL الخلايا المتوسطة.تمييع سيرا الإنسان 1-10 في تعليق الخلية Ag8 لتخفيف المصل النهائي من 1 إلى 20 في المقايسة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل خلايا RBL المؤنسة إلى 50 إلى 90٪ التقاء ، يستنشق الوسط من قارورة ثقافة الخلية T-75 بعناية دون لمس خلايا RBL المؤنثة. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 10 ملليلتر من DPBS إلى الجانب الآخر من القارورة وليس مباشرة إلى الخلايا.أسبيرات DPBS، إضافة خمسة ملليلتر من ما قبل الاحماء مرة واحدة تريبسين-EDTA مفرزة الخلية واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. اضغط برفق على القارورة لفصل الخلايا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليمتر وملء الأنبوب مع أنسنة RBL الخلية المتوسطة أو DPBS لتخفيف تريبسين-EDTA.طرد الخلايا في 250 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant، وإعادة إنفاق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة خلية RBL أنسنة لعد الخلايا. بعد عد الخلايا، تمييع الخلايا في المتوسط خلية RBL أنسنة للحصول على تركيز النهائي من مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر.إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية RBL أنسنة، في بئر، أي ما يعادل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في لوحة معقمة 96 جيدا. الطرد المركزي تعليق مصل Ag8 المحتضن مسبقا ونقل 50 ميكرولتر من تعليق مصل Ag8 الطرد المركزي إلى كل بئر تحتوي على خلايا RBL أنسنة، دون إزعاج بيليه الخلية Ag8. استخدام الخلايا غير المحفزة الحساسة دون مستضد كما لا يوجد عنصر تحكم مستضد للإشارة إلى هضبة الإشارة السفلية أو الخلفية، ولا توعية الخلفية والحد الأقصى الآبار التحكم تحلل.تغطية لوحة مع الغطاء واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. أسبيرات سيرا التي تحتوي على خلية المتوسطة، عكس والاستفادة من لوحة على الورق ماصة لتفريغ لوحة لغسل خلايا RBL أنسنة. غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من العازلة التيرود لكل بئر، واحتضان لمدة 30 ثانية تقريبا لكل غسل لأول غسلين.بعد إضافة المخزن المؤقت لتيرود للمرة الثالثة، يستنشق المخزن المؤقت وترك الحل في الآبار حتى تصبح جاهزة لإضافة تخفيف مستضد. نقل 100 ميكرولتر من محلول مستضد لكل بئر تحتوي على خلايا RBL المؤنسة قبل التوعية ، ولكنها لا تحفز الحد الأقصى من التحلل والخلايا الخلفية غير الحساسة مع المستضد. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التيرود في الآبار الحد الأقصى للسيطرة على تحلل، غير حساسة الآبار مراقبة الخلفية، وتوعية الآبار لا مستضد.احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. علاج الحد الأقصى للتحلل السيطرة الآبار مع 10 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 لكل بئر، وتخلط بشكل صحيح لتحلل الخلايا تماما لاطلاق سراح 100٪ من بيتا هيكسوسامينيديز. إضافة 50 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى لوحة جديدة غير ملزمة 96 بئر.نقل 50 ميكرولتر من النافورات من آبار خلايا RBL المؤننة التي تحتوي على لوحة في لوحة جديدة تحتوي على محلول الركيزة واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية للسماح بتحويل الركيزة الفلورية. أضف 100 ميكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر وقاس الفلورسينس كما هو موضح في المخطوطة النصية. منحنى على شكل جرس التي تم الحصول عليها في اختبار نشاط بيتا هيكسوسامينيديز، مما يشير إلى الاحتلال أحادي التكافؤ من الظهارة مستضد من الغلوبولين المناعي E بسبب فائض من مسببات الحساسية، مما يمنع الغلوبولين المناعي مسببات الحساسية E عبر ربط في تركيزات مستضد عالية.تم حساب تركيز المستضد اللازم لإطلاق الوسيط الأقصى نصف باستخدام تحليل الانحدار الخطي. تم إجراء فحص صلاحية الخلية لاستبعاد الآثار السامة للخلايا المستمدة إما من مصل التوعية أو المستضد المستخدم للتحفيز. تم استخدام خمسة أمصال بشرية مختلفة لإجراء فحص نشاط بيتا هيكسوسامينيداز ، واستجابت أربعة من أصل خمسة سيرا مشتقة من مرضى حساسية حبوب اللقاح البتولا لتحفيز Bet v 1 ، مما يدل على أن Bet v 1 هو مسبب حساسية قوي مسؤول عن أعراض الحساسية بوساطة المناعية E.تم تقييم التفاعل المتبادل للغلوبولين المناعي E لمسببات الحساسية المثلية. تم العثور على الاستجابة لبيت الخامس 1 في كلا المريضين، ولكن المريض الثاني استجاب أيضا لكور 1. الرهان ضد 1 مسببات الحساسية الغذائية متجانسة, مما يدل على ارتفاع كور 1 عبر التفاعلية المناعية مستويات E في المريض الثاني.تم تقييم الطبيعة هيبوالرجينيك للمتغيرات متحولة من المواد المسببة للحساسية ومقارنتها مع نظيرتها نوع البرية. تحول منحنى الإطلاق من متغير Bet v 1 fold نحو تركيز مستضد أعلى مقارنة بمسببات الحساسية من النوع البري ، مما أدى إلى تركيز أعلى بكثير من المستضد لإثارة إطلاق نصف الحد الأقصى ، مما يجعل المتحول أقل حساسية وبالتالي مرشحا للعلاج المناعي المحدد لمسببات الحساسية. لا تنسى أن تترك حلول الغسيل على الخلايا حتى تطبيق تمييع مستضد لتجنب الخلايا من الجفاف، وإلا، وهذا من شأنه أن يؤدي إلى ضعف أداء المقايسة.يمكن استخدام المقايسة للعديد من التطبيقات المختلفة ، بما في ذلك توحيد المنتجات المسببة للحساسية ، استنادا إلى نشاطها البيولوجي ، مثل حلول اختبار وخز الجلد أو المستخلصات المستخدمة في العلاج المناعي المحدد لمسببات الحساسية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

الفئران نموذج من الربو المستحثة مسببات الحساسية

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

باستخدام الماوس BLT إنساني وساق الموديل خلية مقرها جين ورم العلاج

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

أنسنة نموذج الفأر لدراسة الالتهابات البكتيرية استهداف الأوعية الدموية الدقيقة

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

أنسنة إيماءة/نظام/IL2rγفارغة الماوس (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) نموذج للنسخ المتماثل من فيروس نقص المناعة البشرية والدراسات الكمون

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...