Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

تم إجراء التصوير SBEM والتصوير المجهري الخفيف وإعداد عينة المجهر الإلكتروني باستخدام معدات مختبر الأنسجة التصويرية والوظيفة التي تعمل كمرفق أساسي للتصوير في معهد نينكي للبيولوجيا التجريبية.
لإعداد الشكل 1، تم استخدام صورة فأر (Souris_02)، وقارورة من https://smart.servier.com/.
وقد دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم (بولندا) منحة أوبوس (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) الممنوحة ل KR.

تم إجراء البحث وفقا لإرشادات معهد نينكي وإذن اللجنة الأخلاقية المحلية. وقد أجريت الدراسات وفقا لتوجيه مجلس الجماعات الأوروبية الصادر في 24 تشرين الثاني/نوفمبر 1986 (86/609/EEC)، وقانون حماية الحيوان في بولندا، ووافقت عليه أول لجنة محلية للأخلاقيات في وارسو. وبذلت كل الجهود لتقليل عدد الحيوانات ا...

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+dendritic+spines.">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory.">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience:+challenges+of+SBEM+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>&#346;liwi&#324;ska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+&#945;CaMKII.">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of &#945;CaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li><li>Borczyk, M., &#346;liwi&#324;ska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density.">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).</li><li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure:+Volume+scanning+electron+microscopy.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).</li><li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+(OTO)+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells.">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy.">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li><li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy.">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).</li><li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired.">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li><li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems:+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells.">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis.">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li><li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>P&#322;achno, B. J., &#346;wi&#261;tek, P., Jobson, R. W., Ma&#322;ota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+(Utricularia,+Lentibulariaceae).">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li><li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy.">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li><li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells.">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li><li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella.">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li><li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization.">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li><li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy.">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li><li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence/Polyploidy+of+Breast+Cancer+Cells.">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice.">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li></ol>

هناك العديد من الاختلافات في الطريقة NCMIR الأولية التي وصفها Deerinck في 201010. وتظل المبادئ الأساسية كما هي، ولكن، تبعا لنوع المواد التي تمت دراستها، يتم تنفيذ تغييرات طفيفة. وقد وصف سابقا أن الراتنجات المختلفة يمكن استخدامها لتضمين عينات لSBEM وعلى سبيل المثال في حالة النباتات، Spurr ?...

وتقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الجهاز العصبي المركزي على العمود الفقري التشجر - نتوءات صغيرة من غشاء الخلايا العصبية. تشكل هذه النتوءات مقصورات بيوكيميائية محصورة تتحكم في نقل الإشارات داخل الخلايا. ترتبط اللدونة الهيكلية للعمود الفقري المتشجر ونقاط الاشتباك العصبي ارتباطا وثيقا بالتغيرات الوظيفية في الفعالية المتشابكة التي تكمن وراء عمليات مهمة مثل التعلم والذاكرة1و2. من المهم ملاحظة أن المجهر الإلكتروني (EM) هو التقنية الوحيدة التي تسمح بتحديد ما إذا كان العمود الفقري التشجر لديه مدخل ما قبل الاشتباك العصبي. هناك حاجة أيضا إلى دقة EM لدراسة التفاصيل الهيكلية الفائقة مثل شكل كثافة ما بعد المتشابك (PSD) ، والتي تمثل جزءا من متشابكة من المشبك ، أو أبعاد العمود الفقري المتشعب ، وكذلك حجم وشكل بوتون أكسنال. بالإضافة إلى ذلك، مع EM فمن الممكن تصور نقاط الاشتباك العصبي والمناطق المحيطة بها.
بفضل التقدم في تقنيات التصوير والحوسبة ، من الممكن إعادة بناء دوائر عصبية بأكملها. تقنيات المجهر الإلكتروني حجم, مثل المقطع التسلسلي انتقال المجهر الإلكتروني (ssTEM), المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني (SBEM), وركزت شعاع أيون المسح المجهري الإلكتروني (FIB-SEM) وتستخدم عادة لإعادة بناء الدائرة العصبية3.
في دراساتنا، يتم استخدام طريقة SBEM بنجاح للتحقيق في اللدونة الهيكلية للعمود الفقري التشجر وPSDs في عينات من قرن آمون الماوس وشرائح الدماغ organotypic 4،5. ويستند SBEM على تركيب ميكروميكروم مصغرة داخل غرفة المجهر الإلكتروني المسحالضوئي 6،7،8،9. يتم تصوير الجزء العلوي من كتلة العينة ، ثم يتم قطع العينة على عمق محدد بواسطة ultramicrotome ، مما يكشف عن وجه كتلة جديد ، والذي يتم تصويره مرة أخرى ثم يتم تكرار العملية8. ونتيجة لذلك، يتم ترك صورة وجه الكتلة فقط بينما يتم فقدان الشريحة التي تم قطعها كحطام. هذا هو السبب في أن SBEM يسمى تقنية مدمرة ، مما يعني أنه من غير الممكن تصوير نفس المكان مرة أخرى. ومع ذلك ، فإن ميزة الأساليب المدمرة على الكتلة هي أنها لا تعاني من مشاكل تزييفها وفقدان القسم الذي يمكن أن يؤثر بشكل كبير على جودة البيانات وتحليل البيانات3. وعلاوة على ذلك، يعطي SBEM إمكانية لتصوير مجال رؤية كبير نسبيا (> 0.5 ملم × 0.5 ملم) بدقة عالية3.
لتوظيف SBEM ، يجب إعداد العينات وفقا لبروتوكول مخصص ومتناقض للغاية بسبب كاشف الإلكترونات المكثرة المستخدمة للحصول على الصور. نعرض هنا كيفية إجراء إعداد العينة وفقا للبروتوكول استنادا إلى إجراء طورته Deerinck10 (المركز الوطني لبحوث المجهر والتصوير (NCMIR) الأسلوب)، وذلك باستخدام انخفاض osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) البقع وضعت في 1980s8،11. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نهج تثبيت من خطوتين ، مع تغلغل تثبيت خفيف يسمح باستخدام نفس الدماغ لكل من دراسات الفلورة المناعية مع المجهر الخفيف وSBEM.
في البروتوكول يتم إصلاح دماغ الفأر في المقام الأول مع تثبيت معتدل ، ثم يقطع إلى نصفين ، ويتم تثبيت نصف الكرة الأرضية واحد وإعداده للفلورة المناعية (IF) ، في حين أن الآخر لدراسات EM(الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> الشكل 1. تمثيل تخطيطي لسير العمل للعمود الفقري dendritic التحضير للتحليل مع SBEM. تم التضحية بالفئران وثقبها مع مثبت أولي خفيف. تم قطع الدماغ إلى أنصاف ، وتم تثبيت نصف الكرة الأرضية مع immunofluorescence (IF) المخصصة المثبتة ، cryoprotected ، شرائح باستخدام cryostat ومعالجتها لدراسات IF ، في حين تم postfixed نصف الكرة الآخر مع مثبت EM ، شرائح مع الهزاز وأعدت لدراسات EM. وتباينت شرائح الدماغ لدراسات SBEM، شقة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، ثم تم تركيب منطقة CA1 من قرن آمون إلى دبوس، وصورت مع SBEM (الشكل 1). وظهر الجزء من البروتوكول الذي تم تسليط الضوء عليه في صندوق أصفر في الفيديو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital (Morbital)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>575283115</td>
			<td>pure p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>441244</td>
			<td>prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula (double 2&#34; flat ends, one rounded, one tapered to 1/8&#34;)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td>
			<td>KD-FINE 900413</td>
			<td>1.80 x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BQ80S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Profilab, Warsaw, Poland</td>
			<td>534.02</td>
			<td>plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight iris scissors (~9 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for EM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylic glue</td>
			<td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72632</td>
			<td>20 ml Scintillation Vial, a pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>612-4545</td>
			<td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Wilkinson Sword, London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Classic double edge safety razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for IF:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>701101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criostat</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica CM 1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>ETH001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile disposable blade 819</td>
			<td>Leica Biosystems Inc., USA</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>792770426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>772090110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td>
			<td>Leica Biosystems, Switzerland</td>
			<td>14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>MAB1598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Spinning Disc microscope (63 &#215; oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 &#181;m &#215; 0.13 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>B-1231</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AGAA00008</td>
			<td>SuperFrost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td>
			<td>KL-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonT X-100 Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microsocpy sample preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>746980113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C Film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>50425</td>
			<td>Fluoropolymer Film embedding sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>T58203</td>
			<td>Epoxy embedding medium accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component A, M</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44611</td>
			<td>Durcupan ACM single component A, M epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component B</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44612</td>
			<td>Durcupan ACM single component B, hardener 964</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44614</td>
			<td>Durcupan ACM single component D , plasticizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol absolute</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genlab laboratory oven</td>
			<td>Wolflabs, York, UK</td>
			<td>Mino/18/SS</td>
			<td>Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250&#176;C maximum temperature, 240V electrical supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A-9256</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead (II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>467790</td>
			<td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.95% trace metals basis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>75632</td>
			<td>for electron microscopy, 4% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Elmetron, Zabrze, Poland</td>
			<td>CP-5-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>BioSan, J&#243;zef&#243;w, Poland</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td>rotator Multi Bio RS-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower mini shaker</td>
			<td>Grant bio, Shepreth,UK</td>
			<td>PD-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SLGP033NB</td>
			<td>0,22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>88535</td>
			<td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.0% (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77870</td>
			<td>Uranyl acetate&#183;2H2O, research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>WSL, Swietochlowice, Poland</td>
			<td>LWT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen mounting for SBEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>734-2782</td>
			<td>96-well plates, round bottom, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM Gatan 3View stub handling tweezers</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>50-001521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>OPTA-TECH, Warsaw, Poland</td>
			<td>X2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive glue</td>
			<td>Chemtronics, Georgia, USA</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>conductive eopxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View sample pin stubs</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>10-006003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P7793</td>
			<td>roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>16062-15</td>
			<td>PELCO&#174;&#160;Conductive Silver Paint, 15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades double edge</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72000</td>
			<td>Stainless Steel &#34;PTFE&#34; coated. PERSONNA brand .004&#34; thick, wrapped individually, 250 blades in a box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 &#181;m, dwell time 6 &#181;s, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trim 90&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau, Switzerland</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica ultracutR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>webpage</td>
			<td></td>
			<td>tutorials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FijiJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser</td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/</td>
			<td></td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruct</td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td>
			<td></td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Adult 3-month old and&#160;20&#177;1&#160;month old&#160;female&#160;Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines

المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3D EM) يعطي إمكانية لتحليل المعلمات المورفولوجية للعمود الفقري التشجر مع دقة النانو. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة بعض ميزات العمود الفقري التشجر ، مثل حجم العمود الفقري وكثافة ما بعد متشابك (PSD) (تمثل جزءا ما بعد متشابك من المشبك) ، ووجود محطة presynaptic ، وشبكية endoplasmic السلس أو شكل غير نمطي من PSD (على سبيل المثال ، العمود الفقري متعددة الداخلية) ، إلا مع 3D EM. باستخدام المجهر الإلكتروني التسلسلي لمسح الوجه الكتلي (SBEM) ، من الممكن الحصول على بيانات EM ثلاثية الأبعاد بشكل أسهل وبطريقة أكثر قابلية للاستنساخ مما كانت عليه عند إجراء القسم التسلسلي التقليدي. هنا نعرض كيفية إعداد عينات فرس النهر الماوس لتحليل SBEM وكيف يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع دراسة immunofluorescence من العمود الفقري التشجر. يسمح لنا التشوه التثبيتي المعتدل بإجراء دراسات الفلورة المناعية باستخدام المجهر الخفيف على نصف الدماغ ، في حين تم إعداد النصف الآخر ل SBEM. هذا النهج يقلل من عدد الحيوانات التي ستستخدم للدراسة.

باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه عالية التباين، يمكن الحصول على صور جيدة القرار من أنسجة الدماغ الماوس. وهناك مجال كبير من الرؤية التي توفرها تقنية SBEM يسهل الاختيار الدقيق للمنطقة ذات الاهتمام. تم التقاط صورة كبيرة لمنطقة CA1 من قرن آمون لقياس طول الطبقة radiatum (ريال) (الشكل 2A</...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

يتم تطبيق المجهر الإلكتروني التسلسلي لمسح الوجه الكتلي (SBEM) على صورة وتحليل العمود الفقري التشجر في قرن آمون مورين.

المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكترون (SBEM) لدراسة العمود الفقري Dendritic

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

ويرتبط كل خلية عصبية في الدماغ مع الخلايا العصبية الأخرى من قبل ما يقرب من 7000 نقاط الاشتباك العصبي. إلا أن تلك نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ الثدييات تقع أساسا على نتوءات صغيرة من الغشاء يسمى العمود الفقري التشجر. اللدونة من نقاط الاشتباك العصبي والعمود الفقري التشجر وما إلى ذلك، وظائف الدماغ الهامة مثل التعلم وعمليات الذاكرة.من المهم ملاحظة أن المجهر الإلكتروني فقط يعطي فكرة كاملة عما إذا كان العمود الفقري التشجر له مدخلات ما بعد المتشابك. تقنيات مختلفة على التصوير العمود الفقري التشجر متاحة. ومع ذلك، كتلة المسلسل مسح الوجه المجهر الإلكتروني يعطي إمكانية فريدة من نوعها لتصوير حجم كبير من الأنسجة مع دقة عالية.تسلسل كتلة القائم على تقنية المجهر الإلكتروني المسح يتطلب بروتوكول خاص لإعداد العينة التي تنطوي على تناقض قوي مع المعادن الثقيلة. تثبيتي الأساسي أثناء التشوه سمح لنا باستخدام نفس الأدمغة للفحص المجهري الإلكتروني المخفف. تم التضحية بالفئران وثقبها مع مثبت أولي خفيف.تم قطع الدماغ إلى أنصاف وكان نصف الكرة الأرضية واحد آخر ثابتة مع immunofluorescence مخصصة مثبتة، cryoprotectant، شرائح باستخدام cryostat ومعالجتها لدراسات immunofluorescence. حيث تم تثبيت نصف الكرة الآخر مع مثبت المجهر الإلكتروني ، مقطعا إلى شرائح مع الهزاز ومستعدا لدراسات المجهر الإلكتروني. كانت شرائح الدماغ لدراسات المجهر الإلكتروني المسح المستندة إلى كتلة المسلسل على النقيض من ذلك، شقة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، ثم تم تركيب منطقة CA1 من قرن آمون إلى دبوس وصورت مع المجهر الإلكتروني المسح القائم على كتلة المسلسل.وظهر الجزء من البروتوكول الذي تم تسليط الضوء عليه في صندوق أصفر في الفيديو. خذ الأنسجة، التي تم إصلاحها وقطعها إلى 100 شريحة ميكروبيوتيك وغسلها بحاجز الفوسفات البارد خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. إعداد خليط واحد إلى واحد من 4٪ من التيتروكسيد أوسميوم و 3٪ فيروكسيانايد البوتاسيوم.المنتج النهائي سوف تتحول البني. تزج العينات في هذا الخليط. ثم ضع العينات على الجليد.ومن هذه المرحلة فصاعدا من المهم حمايتهم من الضوء. احتضانهم مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة. وفي الوقت نفسه، إعداد حل TCH.مزيج 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج و 0.1 غرام من TCH. وضعه في فرن تعيين في 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. من المهم أن يسوف الحل من وقت لآخر.عندما تكون جاهزة، تبريده إلى درجة حرارة الغرفة. الآن غسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ومن ثم تزج بها في محلول TCH المصفاة. الشرائح ستتحول إلى اللون الأسود.احتضنهم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما واحتضانها مع 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم لمدة 30 دقيقة، وهذه المرة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى، وغسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ووضعها في تصفية 1٪ أو خلات أميل.احتضنهم عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تبدأ مع إعداد D-الأسبارتات. مزيج نترات الرصاص مع محلول حمض الأسبارتيك مسبقا إلى 60 درجة مئوية.ضع الخليط في حمام مائي عند 60 درجة مئوية وضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع هيدروكسيد صوديوم مولار واحد. أغلق القارورة مع أسبارتات الرصاص واتركه في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وينبغي أن يكون الحل واضحا.إذا كان يتحول غائما يجب التخلص منه ويحتاج إلى إعداد واحد جديد. في غضون ذلك، اغسل العينات بالماء المقطر المزدوج الغازي خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها وابقها في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تزج العينات في محلول الأسبارتات الرصاص الطازجة واحتضانها في الفرن تعيين في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.إعداد راتنج الايبوكسي. وزن المكونات وخلط الراتنج جيدا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إضافة مسرع DMP 30. إعداد الفيروس مع تخفيف متدرج من الإيثانول.ثم أخرج العينات من الفرن واغسلها مرة أخرى بالماء المقطر المزدوج خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. في غضون ذلك، خلط الراتنج مع الإيثانول 100٪ في نسبة واحد إلى واحد للحصول على الراتنج 50٪. امزجها جيدا.بعد ذلك ، يجفف العينات في كل تخفيف للإيثانول لمدة خمس دقائق. تذكر العينات يجب أن لا تجف تماما. التسلل العينات الأولى في 50٪ الراتنج لمدة 30 دقيقة، المقبل في الراتنج 100٪لمدة ساعة واحدة، ومن ثم مرة أخرى في الراتنج الطازجة 100٪بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، ضع العينات في راتنج طازج بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة ثم قم بتضمينها بين أوراق تضمين الفلوروبوليمر. إعداد قطع من ورقة التضمين التي تم دي مدهون مع الإيثانول ووضع جانبا الشرائح الزجاجية التي سيتم استخدامها كدعم. وضع قطعة من ورقة تضمين على شريحة زجاجية، ووضع قطرة من الراتنج على ذلك، ثم نقل العينة بعناية مع استخدام عصا خشبية.تغطية ذلك مع القطعة الثانية. في محاولة لتجنب فقاعات الهواء. كن لطيفا لأن الأنسجة هشة جدا.ضع بعناية شريحة زجاجية أخرى فوق قطعة الورقة المضمنة وعالج العينة في الفرن عند 70 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. فصل الطبقات وقطع قطعة من العينة المضمنة مع شفرة حلاقة. نقلها إلى البارافين.وهذا يقلل من خطر فقدان العينة بسبب الكهروستاتيكيات. خذ دبوس الألومنيوم الذي تم إزالة الشحوم مع الإيثانول. مزيج الايبوكسي موصل جيدا واستخدام كمية صغيرة منه لتركيب العينة إلى دبوس.علاج الايبوكسي موصل في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تقليم كل جانب من كتلة العينة مع سكين الماس ومن ثم تلميع وجه الكتلة حتى يتعرض النسيج. الأرض العينة إلى دبوس باستخدام الطلاء موصل وعلاجه.لتقليل الشحن، يجب أيضا رصد العينات المغلفة بطبقة رقيقة من الذهب أو البلاديوم الذهبي. ضع الدبوس مع العينة في غرفة المجهر الإلكتروني المسح المتسلسل القائم على كتلة. محاذاة العينة إلى السكين ومن ثم إغلاق الغرفة وتعيين المعلمات.جمع كومة من الصور. باستخدام الطريقة الموصوفة ، تم الحصول على صور لأنسجة دماغ الماوس. تم التقاط صورة كبيرة من قرن آمون منطقة واحدة وتم تعيين التصوير في وسط stratum radiatum.تم الحصول على كومة من الصور وتم تقسيم الأشياء ذات الاهتمام ، مثل العمود الفقري المتشجر ونقاط الاشتباك العصبي. تم الحصول على مورفولوجيا الأنسجة ذات نوعية جيدة مع الأغشية المرئية بوضوح والحوافش متشابك والميتوكوندريا المحفوظة بشكل جيد. أكدت الدراسات المناعية للأجسام المضادة PSD 95 أن التثبيت الأولي المعتدل والتثبيت التقليدي مع 4٪ PFA يعطي نتائج مماثلة.بروتوكول قدم يتيح الحصول على صور أنسجة الدماغ مع استخدام المجهر الإلكتروني المسح القائم على كتلة المسلسل، مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة، و 12 الأغشية المرئية تسهيل 10 تجزئة الحق وإعادة الإعمار. تثبيت بلدي الأولية جعلت من الممكن استخدام نفس العقول لتحليل PSD 95 immunofluorescence والتصوير المجهري الإلكتروني العمود الفقري dendritic. هنا نستخدم PSE 9، 500 في مهدها.ومع ذلك، يمكن استخدام الآخر أيضا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...