Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

SBEM इमेजिंग, लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयारिंग इमेजिंग ऊतक और समारोह की प्रयोगशाला के उपकरणों के उपयोग के साथ किया गया जो प्रयोगात्मक जीव विज्ञान के Nencki संस्थान में एक इमेजिंग कोर सुविधा के रूप में कार्य करता है ।
चित्रा 1 की तैयारी के लिए, माउस (Souris_02) की छवि और https://smart.servier.com/ से एक शीशी का उपयोग किया गया था।
इस काम को केआर को दिए गए नेशनल साइंस सेंटर (पोलैंड) ग्रांट ओपस (यूएएम-2018/31/बी/NZ4/01603) ने सपोर्ट किया ।

यह शोध Nencki संस्थान के दिशा-निर्देशों और स्थानीय नैतिक समिति की अनुमति के अनुपालन में किया गया था । यह अध्ययन 24 नवंबर १९८६ (86/609/EEC), पोलैंड के पशु संरक्षण अधिनियम के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के अनुसार ?...

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+dendritic+spines.">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory.">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience:+challenges+of+SBEM+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>&#346;liwi&#324;ska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+&#945;CaMKII.">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of &#945;CaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li><li>Borczyk, M., &#346;liwi&#324;ska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density.">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).</li><li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure:+Volume+scanning+electron+microscopy.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).</li><li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+(OTO)+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells.">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy.">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li><li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy.">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).</li><li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired.">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li><li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems:+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells.">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis.">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li><li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>P&#322;achno, B. J., &#346;wi&#261;tek, P., Jobson, R. W., Ma&#322;ota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+(Utricularia,+Lentibulariaceae).">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li><li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy.">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li><li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells.">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li><li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella.">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li><li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization.">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li><li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy.">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li><li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence/Polyploidy+of+Breast+Cancer+Cells.">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice.">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li></ol>

201010में डियरिंक द्वारा वर्णित प्राथमिक एनसीआईआर विधि के कई रूप हैं। बुनियादी सिद्धांत एक ही रहते हैं, लेकिन, अध्ययन सामग्री के प्रकार के आधार पर, मामूली परिवर्तन लागू कर रहे हैं । यह पहले वर्णित...

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अधिकांश उत्तेजक सिनेप्स डेंड्रिटिक कताई पर स्थित होते हैं - एक न्यूरोनल झिल्ली के छोटे फलाव। ये फलाव जैव रासायनिक डिब्बों को सीमित करते हैं जो इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसडक्शन को नियंत्रित करते हैं। डेंड्रिटिक कताई और सिनैप्स की संरचनात्मक प्लास्टिसिटी का सिनैप्टिक प्रभावकारिता में कार्यात्मक परिवर्तनों से गहरा संबंध है जो सीखने और स्मृति1,2के रूप में ऐसी महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एकमात्र तकनीक है जो यह निर्धारित करने की अनुमति देती है कि क्या एक डेंड्रिटिक रीढ़ में प्रेसिनैप्टिक इनपुट है। ईएम संकल्प को अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों जैसे कि एक पोस्टसिनैप्टिक घनत्व (पीएसडी) के आकार का अध्ययन करने की भी आवश्यकता है, जो एक सिनेप्स के एक पोस्टसिनैप्टिक भाग का प्रतिनिधित्व करता है, या एक डेंड्रिटिक रीढ़ के आयामों के साथ-साथ एक अक्षीय मुक्केबाज़ी के आकार और आकार का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अतिरिक्त, ईएम के साथ सिनेप्स और उनके परिवेश की कल्पना करना संभव है।
इमेजिंग और कंप्यूटिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति के लिए धन्यवाद, पूरे तंत्रिका सर्किट का पुनर्निर्माण करना संभव है। वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, जैसे सीरियल सेक्शन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसएसईएम), सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीईएम), और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एफआईबी-एसईएम) आमतौर पर न्यूरोनल सर्किट पुनर्निर्माण 3 के लिए उपयोग कियाजाताहै।
हमारे अध्ययनों में, एसबीईएम विधि को माउस हिप्पोकैम्पस और ऑर्गेनोइटिक ब्रेन स्लाइस 4, 5के नमूनों में डेंड्रिटिक कताई और पीएसडी की संरचनात्मक प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए सफलतापूर्वकनियोजितकिया गया है। एसबीईएम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप चैंबर 6 ,7,8,9केअंदर एक लघु अल्ट्रामाइक्रोटोम की स्थापना पर आधारित है । नमूना ब्लॉक के शीर्ष को चित्रित किया जाता है, और फिर नमूना अल्ट्रामाइक्रोटोपोम द्वारा एक निर्दिष्ट गहराई पर काटा जाता है, जो एक नए ब्लॉक-फेस का खुलासा करता है, जिसे फिर से इमेज किया जाता है और फिर प्रक्रिया8दोहराई जाती है। नतीजतन, केवल ब्लॉक-फेस की छवि बची है जबकि जो टुकड़ा काटा गया है वह मलबे के रूप में खो गया है। यही कारण है कि SBEM एक विनाशकारी तकनीक कहा जाता है, जिसका अर्थ है कि एक ही जगह को फिर से छवि करना संभव नहीं है। हालांकि, विनाशकारी ऑन-ब्लॉक विधियों का लाभ यह है कि वे विकृत समस्याओं और अनुभाग हानि से पीड़ित नहीं हैं जो डेटा गुणवत्ता और डेटा विश्लेषण3को काफी प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, SBEM उच्च संकल्प3पर अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र (> 0.5 मिमी × 0.5 मिमी) को छवि देने की संभावना देता है।
SBEM को नियोजित करने के लिए, नमूनों को छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के कारण एक समर्पित, अत्यधिक विषम प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए । हम यहां दिखाते हैं कि1 9 80 केदशकमें विकसित कम ऑस्मियम-थिओकार्बोहाइड्रेजाइड-ऑस्मिम (रोओटो) दाग का उपयोग करके डियरिंक 10 (नेशनल सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड इमेजिंग रिसर्च (एनसीएमआईआर) विधि द्वारा विकसित प्रक्रिया के आधार पर प्रोटोकॉल के अनुसार नमूना तैयारी कैसेकरें। इसके अलावा, हम हल्के निर्धारण परफ्यूजन के साथ एक दो-चरण निर्धारण दृष्टिकोण पेश करते हैं जो हल्के माइक्रोस्कोपी और एसबीईएम के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के लिए एक ही मस्तिष्क का उपयोग करने की अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल में एक माउस मस्तिष्क मुख्य रूप से एक हल्के फिक्सेटिव के साथ तय किया जाता है, और फिर हिस्सों में काट दिया जाता है, और एक गोलार्द्ध को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के लिए पोस्टफिक्स और तैयार किया जाता है, जबकि दूसरा ईएम अध्ययन(चित्रा 1)के लिए।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> चित्रा 1। SBEM के साथ विश्लेषण के लिए डेंड्रिटिक कताई की तैयारी के लिए वर्कफ्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चूहों का बलिदान किया गया था और एक हल्के प्राथमिक स्थिर के साथ छिद्रित किया गया था। मस्तिष्क को हिस्सों में काट दिया गया था, और एक गोलार्द्ध को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के साथ पोस्टफिक्स किया गया था- समर्पित फिक्सेटिव, क्रायोप्रोटेक्टेड, क्रायोस्टेट का उपयोग करके कटा हुआ और यदि अध्ययन के लिए संसाधित किया गया था, जबकि दूसरे गोलार्द्ध को ईएम फिक्सेटिव के साथ पोस्टफिक्स किया गया था, वाइब्रेटोम के साथ कटा हुआ था और ईएम अध्ययन के लिए तैयार किया गया था। SBEM अध्ययन के लिए मस्तिष्क स्लाइस विपरीत थे, राल में एम्बेडेड फ्लैट, तो हिप्पोकैम्पस के एक CA1 क्षेत्र पिन करने के लिए मुहिम शुरू की थी, और SBEM(चित्रा 1)के साथ छवि ) । एक पीले बॉक्स में प्रकाश डाला प्रोटोकॉल का हिस्सा वीडियो में चित्रित किया गया था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital (Morbital)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>575283115</td>
			<td>pure p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>441244</td>
			<td>prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula (double 2&#34; flat ends, one rounded, one tapered to 1/8&#34;)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td>
			<td>KD-FINE 900413</td>
			<td>1.80 x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BQ80S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Profilab, Warsaw, Poland</td>
			<td>534.02</td>
			<td>plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight iris scissors (~9 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for EM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylic glue</td>
			<td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72632</td>
			<td>20 ml Scintillation Vial, a pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>612-4545</td>
			<td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Wilkinson Sword, London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Classic double edge safety razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for IF:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>701101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criostat</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica CM 1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>ETH001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile disposable blade 819</td>
			<td>Leica Biosystems Inc., USA</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>792770426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>772090110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td>
			<td>Leica Biosystems, Switzerland</td>
			<td>14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>MAB1598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Spinning Disc microscope (63 &#215; oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 &#181;m &#215; 0.13 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>B-1231</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AGAA00008</td>
			<td>SuperFrost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td>
			<td>KL-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonT X-100 Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microsocpy sample preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>746980113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C Film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>50425</td>
			<td>Fluoropolymer Film embedding sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>T58203</td>
			<td>Epoxy embedding medium accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component A, M</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44611</td>
			<td>Durcupan ACM single component A, M epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component B</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44612</td>
			<td>Durcupan ACM single component B, hardener 964</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44614</td>
			<td>Durcupan ACM single component D , plasticizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol absolute</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genlab laboratory oven</td>
			<td>Wolflabs, York, UK</td>
			<td>Mino/18/SS</td>
			<td>Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250&#176;C maximum temperature, 240V electrical supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A-9256</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead (II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>467790</td>
			<td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.95% trace metals basis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>75632</td>
			<td>for electron microscopy, 4% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Elmetron, Zabrze, Poland</td>
			<td>CP-5-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>BioSan, J&#243;zef&#243;w, Poland</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td>rotator Multi Bio RS-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower mini shaker</td>
			<td>Grant bio, Shepreth,UK</td>
			<td>PD-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SLGP033NB</td>
			<td>0,22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>88535</td>
			<td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.0% (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77870</td>
			<td>Uranyl acetate&#183;2H2O, research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>WSL, Swietochlowice, Poland</td>
			<td>LWT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen mounting for SBEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>734-2782</td>
			<td>96-well plates, round bottom, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM Gatan 3View stub handling tweezers</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>50-001521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>OPTA-TECH, Warsaw, Poland</td>
			<td>X2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive glue</td>
			<td>Chemtronics, Georgia, USA</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>conductive eopxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View sample pin stubs</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>10-006003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P7793</td>
			<td>roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>16062-15</td>
			<td>PELCO&#174;&#160;Conductive Silver Paint, 15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades double edge</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72000</td>
			<td>Stainless Steel &#34;PTFE&#34; coated. PERSONNA brand .004&#34; thick, wrapped individually, 250 blades in a box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 &#181;m, dwell time 6 &#181;s, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trim 90&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau, Switzerland</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica ultracutR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>webpage</td>
			<td></td>
			<td>tutorials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FijiJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser</td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/</td>
			<td></td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruct</td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td>
			<td></td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Adult 3-month old and&#160;20&#177;1&#160;month old&#160;female&#160;Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines

त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (3 डी ईएम) नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना देता है। इसके अलावा, डेंड्रिटिक कताई की कुछ विशेषताएं, जैसे कि रीढ़ की मात्रा और पोस्ट-सिनैप्टिक घनत्व (PSD) (सिनैप्स के पोस्ट-सिनेप्टिक भाग का प्रतिनिधित्व करना), प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल की उपस्थिति, और पीएसडी (जैसे, बहु-इनरवेटेड कताई) का चिकनी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम या असामान्य रूप, केवल 3 डी ईएम के साथ देखा जा सकता है। धारावाहिक ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीईएम) को नियोजित करके पारंपरिक धारावाहिक अनुभागिंग करने की तुलना में 3डी ईएम डेटा आसान और अधिक प्रजनन तरीके से प्राप्त करना संभव है। यहां हम दिखाते हैं कि SBEM विश्लेषण के लिए माउस हिप्पोकैम्पल नमूने कैसे तैयार करें और इस प्रोटोकॉल को डेंड्रिटिक कताई के इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के साथ कैसे जोड़ा जा सकता है। हल्के निर्धारण परफ्यूजन हमें मस्तिष्क के एक आधे हिस्से पर हल्के माइक्रोस्कोपी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन करने की अनुमति देता है, जबकि दूसरा आधा SBEM के लिए तैयार किया गया था। इस दृष्टिकोण से अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो गई है ।

उच्च विपरीत ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करना, माउस मस्तिष्क ऊतक की अच्छी संकल्प छवियों को प्राप्त किया जा सकता है। SBEM तकनीक द्वारा प्रदान किए गए दृश्य का एक बड़ा क्षेत्र ब्याज के क्षेत्र के सटीक चयन की सुव?...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM) को मूर्ति पर लागू किया जाता है और मुरीन हिप्पोकैम्पस में डेंड्रिटिक कताई का विश्लेषण किया जाता है।

डेंड्रिटिक कताई के अध्ययन के लिए सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

मस्तिष्क में प्रत्येक न्यूरॉन लगभग 7, 000 synapses द्वारा अन्य न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है। सिवाय इसके कि स्तनधारी मस्तिष्क में वे सिनेप्स मुख्यतः झिल्ली के छोटे फलाव पर स्थित होते हैं जिन्हें डेंड्रिटिक कताई कहा जाता है। सिनेप्स और डेंड्रिटिक कताई और इस तरह की प्लास्टिसिटी, सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्य करता है।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक पूर्ण अंतर्दृष्टि देता है कि क्या एक डेंड्रिटिक रीढ़ में एक पोस्टसिनैप्टिक इनपुट है। डेंड्रिटिक कताई इमेजिंग पर विभिन्न तकनीकें उपलब्ध हैं। हालांकि, सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक उच्च संकल्प के साथ ऊतक की बड़ी मात्रा छवि के लिए अद्वितीय संभावना देता है ।धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक नमूना तैयारी के एक विशेष प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो भारी धातुओं के साथ मजबूत विषम शामिल है । परफ्यूजन के दौरान मेरा प्राथमिक निर्धारण हमें हल्का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक ही दिमाग का उपयोग करने की अनुमति देता है। चूहों का बलिदान किया गया था और एक हल्के प्राथमिक स्थिर के साथ छिद्रित किया गया था।मस्तिष्क को हिस्सों में काट दिया गया था और एक गोलार्द्ध इम्यूनोफ्लोरेसेंस समर्पित फिक्सेटिव, क्रायोप्रोटेक्टेंट के साथ तय किया गया था, जो क्रायोस्टेट का उपयोग करके कटा हुआ था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययनों के लिए संसाधित किया गया था। जहां दूसरे गोलार्द्ध को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिक्सेटिव के साथ तय किया गया था, कंपन के साथ कटा हुआ और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए तैयार किया गया था। धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए मस्तिष्क स्लाइस विपरीत थे, राल में एम्बेडेड फ्लैट, तो हिप्पोकैम्पस के एक CA1 क्षेत्र पिन करने के लिए घुड़सवार और धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ छवि थी ।एक पीले बॉक्स में प्रकाश डाला प्रोटोकॉल का हिस्सा वीडियो में चित्रित किया गया था । टिश्यू लें, जिसे फिक्स कर 100 माइक्रोबायोटिक स्लाइस में काटा गया है और इसे तीन मिनट के लिए पांच बार कोल्ड फॉस्फेट बफर से धोएं। 4% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 3% पोटेशियम फेरोसाइनाइड का वन-टू-वन मिश्रण तैयार करें।अंतिम उत्पाद भूरा हो जाएगा। इस मिश्रण में नमूनों को विसर्जित करें। इसके बाद नमूनों को बर्फ पर रखें।और इस चरण के बाद से उन्हें प्रकाश से बचाना महत्वपूर्ण है। उन्हें एक घंटे के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट। इस बीच, टीसीएच समाधान तैयार करें।डबल डिस्टिल्ड वॉटर के 10 मिलीलीटर और 0.1 ग्राम TCH मिलाएं। इसे एक घंटे के लिए 60 सेल्सियस पर सेट ओवन में रखें। समय-समय पर समाधान के लिए तैयार रहना जरूरी है।तैयार होने पर, इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करें। अब नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं और फिर उन्हें फ़िल्टर किए गए TCH समाधान में विसर्जित करें। स्लाइस काले हो जाएंगे।उन्हें कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार डबल आसुत पानी से धोएं और उन्हें 30 मिनट के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोऑक्साइड के साथ इनक्यूबेट करें, इस बार कमरे के तापमान पर । फिर, प्रत्येक तीन मिनट के लिए पांच बार डबल आसुत पानी के साथ नमूनों को धोएं और उन्हें फ़िल्टर किए गए 1% या एमिल एसीटेट में रखें।रात भर उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । अगले दिन, डी-एस्पार्टेट तैयारी के साथ शुरू करें। एस्पार्टिक एसिड समाधान के साथ लीड नाइट्रेट को 60 डिग्री सेल्सियस तक प्री-गर्म करें।मिश्रण को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में रखें और पीएच को एक मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ 5.5 तक समायोजित करें। लेड एस्पार्टेट के साथ शीशी बंद करें और इसे 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस में छोड़ दें। समाधान स्पष्ट होना चाहिए।यदि यह बादल बदल जाता है यह त्याग दिया जाना चाहिए और एक नया एक तैयार होने की जरूरत है । इस दौरान नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार गैस डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं और उन्हें 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। नमूनों को ताजा तैयार लीड एस्पार्टेट समाधान में विसर्जित करें और उन्हें ओवन सेट में 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।एपॉक्सी राल तैयार करें। सामग्री का वजन करें और एक्सीलेटर डीएमपी 30 जोड़ने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए राल को अच्छी तरह से मिलाएं। इथेनॉल के ग्रेडेड कमजोर पड़ने के साथ वायरस तैयार करें।फिर नमूनों को ओवन से बाहर निकालें और उन्हें फिर से तीन मिनट के लिए पांच बार डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं। इस बीच, 50% राल प्राप्त करने के लिए एक-से-एक अनुपात में 100% इथेनॉल के साथ राल मिलाएं। इसे अच्छी तरह मिला लें।इसके बाद, पांच मिनट के लिए इथेनॉल के प्रत्येक कमजोर पड़ने में नमूनों को निर्जलित करें। याद रखें कि नमूनों को पूरी तरह से कभी सूख नहीं जाना चाहिए। 30 मिनट के लिए 50% राल में पहले नमूनों घुसपैठ, एक घंटे के लिए 100% राल में अगले, और फिर एक ताजा 100% राल रातोंरात में फिर से।अगले दिन, नमूनों को एक घंटे के लिए ताजा 100% राल में रखें और फिर उन्हें फ्लोरोपॉलिमर एम्बेडिंग शीट्स के बीच एम्बेड करें। एम्बेडिंग शीट के टुकड़े तैयार करें जिन्हें इथेनॉल के साथ डी-ग्रीस किया गया है और ग्लास स्लाइड को अलग रखा गया है जिसे समर्थन के रूप में उपयोग किया जाएगा। कांच की स्लाइड पर एम्बेडिंग शीट का एक टुकड़ा रखें, उस पर राल की एक बूंद डालें, फिर लकड़ी की छड़ी के उपयोग के साथ नमूने को ध्यान से स्थानांतरित करें।इसे दूसरे टुकड़े से ढक दें। हवा के बुलबुले से बचने की कोशिश करें। कोमल रहें क्योंकि ऊतक बहुत नाजुक है।ध्यान से एम्बेडिंग शीट टुकड़ा के शीर्ष पर एक और ग्लास स्लाइड रखें और कम से कम 48 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूना इलाज करें। परतों को अलग करें और एम्बेडेड नमूने के एक टुकड़े को रेजर ब्लेड से काटें। इसे पैराफिन में ट्रांसफर करें।इससे इलेक्ट्रोस्टैटिक्स के कारण सैंपल खोने का खतरा कम हो जाएगा। एक एल्यूमीनियम पिन लें जिसे इथेनॉल के साथ डी-ग्रीस किया गया है। एक प्रवाहकीय एपॉक्सी को अच्छी तरह से मिलाएं और नमूने को पिन पर माउंट करने के लिए थोड़ी मात्रा का उपयोग करें।10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाहकीय एपॉक्सी का इलाज करें। हीरे के चाकू के साथ नमूना ब्लॉक के प्रत्येक पक्ष ट्रिम और फिर ऊतक उजागर होने तक ब्लॉक के चेहरे पॉलिश। प्रवाहकीय पेंट का उपयोग करके पिन के लिए नमूना जमीन और यह इलाज।चार्जिंग को कम करने के लिए, नमूनों को सोने या सोने के पैलेडियम की पतली परत के साथ लेपित भी देखा जाना चाहिए। नमूना के साथ पिन सीरियल ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखें। नमूने को चाकू में संरेखित करें और फिर कक्ष को बंद करें और पैरामीटर सेट करें।छवियों का एक ढेर ले लीजिए। वर्णित विधि का उपयोग करके, माउस मस्तिष्क ऊतक की छवियां प्राप्त की गईं। हिप्पोकैम्पस एक क्षेत्र की बड़ी छवि ली गई थी और इमेजिंग स्ट्रैटम रेडिएटम के केंद्र में स्थापित की गई थी।छवियों का एक ढेर प्राप्त किया गया था और ब्याज की वस्तुओं, जैसे कि डेंड्रिटिक कताई और सिनेप्स, खंडित थे। अच्छी गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान को स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली झिल्ली और सिनैप्टिक वेसिकल्स और अच्छी तरह से संरक्षित माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्राप्त किया गया था। पीएसडी 95 एंटीबॉडी के इम्यूनोफ्लोर्सेंट अध्ययनों ने पुष्टि की कि हल्के प्राथमिक निर्धारण और 4% पीएफए के साथ पारंपरिक निर्धारण तुलनीय परिणाम देते हैं।प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीरियल ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान, और 12 दृश्य झिल्ली के उपयोग के साथ मस्तिष्क ऊतक छवियों के अधिग्रहण में सक्षम बनाता है 10 सही विभाजन और पुनर्निर्माण की सुविधा । मेरे प्राथमिक निर्धारण ने पीएसडी 95 इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग डेन्ड्रिटिक कताई के विश्लेषण के लिए एक ही दिमाग का उपयोग करना संभव बनाया। यहां हम पीएसई 9, 500 नवोदित का उपयोग करते हैं।हालांकि, दूसरे के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में प्रतिदीप्ति प्रोटीन के टैग की गईं

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

ध्यान केंद्रित आयन बीम मिलिंग और मस्तिष्क के ऊतकों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Axons, Dendrites और मस्तिष्क स्लाइसें में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines से वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई रिकॉर्डिंग

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; में Vivo</em&gt; Neuronal आकृति विज्ञान और प्रवास का अध्ययन करने के लिए

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहा प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines इमेजिंग

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

दो photon<em&gt; में विवो</em&gt; एक पतला खोपड़ी तैयारी का उपयोग माउस प्रांतस्था में वृक्ष के समान spines के इमेजिंग

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

एक मॉडल के रूप घ्राण प्रणाली axonal विकास पैटर्न और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए<em&gt; Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए β-amyloid सजीले टुकड़े के साथ सहभागिता microglial

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

ब्रेन माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...